起源の臓器への癌細胞の移植は、新規治療法を評価するための有用な前臨床モデルとして役立つことができる。 MB49膀胱癌細胞は、膀胱内注入後の膀胱内に成長させることができる。このプロトコルは、腫瘍移植およびアデノウイルス引渡しのために、マウスの膀胱のカテーテル法を示しています。
膀胱癌は尿生殖路、再発および進行が必要な削減することができ、新たな治療アプローチの第二の最も一般的な癌である。腫瘍微小環境が著しく腫瘍の発生および治療応答に影響を与えることができる。それは、それらが由来する器官に腫瘍細胞を増殖させることが望ましい場合が多い。このプロトコルは、MB49マウス膀胱癌細胞はカテーテル法を介して膀胱に点滴注入された膀胱癌の同所性モデルを記載している。このモデルで成功した腫瘍細胞移植は、物理的または化学的手段によって達成することができるグリコサミノグリカン、保護層の破壊を必要とする。我々のプロトコルでは、膀胱前細胞点滴をトリプシンで処理する。膀胱カテーテル法はまた、腫瘍が確立されれば治療薬を送達するために使用することができる。このプロトコルは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するアデノウイルス構築の送達を記載する。 O間ウルプロトコルは短期試験用に最適化遺伝子送達に焦点を当ててきた、マウスの膀胱カテーテル法の方法論は、幅広い用途を有する。
膀胱癌は2012年1で予想はほぼ75,000の新しい症例と15000人が死亡した尿生殖路の第二の最も一般的な癌である。再発率の高さは、膀胱癌治療する最も高価な癌の1になり、生涯のフォローアップを必要とする。筋層に侵入している膀胱がんは、リンパ系を経由して肝臓、肺や骨に転移することがあります。 5年後にのみ20から40まで%生存における進行した腫瘍の結果マルチモーダル療法。そのため、表在性膀胱癌の再発や進行を減らすだけでなく、高度な疾患を持つ患者の治療結果の向上を目的とした効果的な治療戦略が緊急に必要とされている。
新規治療薬の開発は初期のインビトロ評価以下の効果を評価する前臨床モデルを必要とします。腫瘍微小環境が大幅にpreclinicの必要性を強調しており、癌の発生と応答性に影響を与えることができる腫瘍が生じたからモデルは、起源の器官において確立することができる。一つのアプローチは、腫瘍が自然発生または器官特異的に誘導することが可能なトランスジェニックモデルの開発である。トランスジェニック膀胱癌モデルの優れたプロトコルは、最近2公表されている。トランスジェニックモデルの欠点は、腫瘍はゆっくりと所望未満の均一性で開発する傾向があることである。また、繁殖コロニーを維持するためのコストを考慮しなければならない。トランスジェニックモデルに代わるものは、市販のマウスにおける腫瘍の確立のための短い時間枠の利益を有する腫瘍細胞の同所移植である。いくつかのヒト膀胱癌細胞株は(我々はUM-UC-3を首尾よく使用している)同所成長させることができるが、免疫応答性マウスにおいて腫瘍を確立することが望ましい場合がある。同所性増殖二つマウス膀胱癌細胞株は、MBT-2およびMB49 3である。 MBT-2細胞を複製に汚染されているのでC型レトロウイルス4、我々は我々の研究のためMB49細胞を選択しました。それは、MB49細胞は雄のマウスから単離され、同所着床は雌マウスで行った解剖学的な理由であるしていることに注意することが重要である。これは、Y染色体のマーカーによって移植された細胞を容易に識別するという利点がありますが、性別の不一致が免疫学的研究のための欠点です。
膀胱上皮は、微生物による感染症のためのバリアとして機能グリコサミノグリカン(GAG)層によって裏打ちされている。この障壁はまた、この困難性( 表1)を克服するために開発された腫瘍細胞およびいくつかの方法の着床を妨害する可能性がある。電気焼灼は、GAG層5月13日を破壊する物理的手段として広く使用されており、電気メスを実証プロトコルは最近、Joveの14に掲載されました。しかし、電気焼灼器が利用できない場合は、化学物質は、Gを破壊することを意味する例えば、硝酸銀またはポリ-L-リジンなどAG層も15-24を使用することができる。腫瘍は、ポリ-L-リジンとの長い接触又は0.1 mg / mlと(100μl の (〜10秒、5〜10μlを、0.15〜1.0 M)の硝酸銀を少量の膀胱への短時間曝露することにより効果的に確立される20分間)( 表1)。ここでは、MB49細胞の移植を容易にするために、トリプシンを使用する方法を記載している。
膀胱癌のための治療アプローチを改善する試みにおいて、遺伝子治療に大きな注目を集めている。臨床的な観点からは、膀胱癌は簡単に臓器のアクセシビリティと、ローカルにペイロードを提供する能力のために、遺伝子治療のための理想的なターゲットである。膀胱癌の遺伝子治療のために検討されているウイルスベクターは、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス25、レトロウイルス26、カナリア痘ウイルス27、ワクシニアウイルス、AAV、およびadenoviruを含む28秒 。我々のプロトコルの第二部では、腫瘍細胞の点滴注入と実質的に同一であるウイルス送達するための方法を記載している。私たちの研究室で興味深いのは、我々はルシフェラーゼ導入遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを用いた生物発光を経由して評価した遺伝子デリバリーへの新しいアプローチの開発である。しかし、膀胱カテーテル法の方法論は様々な薬剤の送達のために使用され、従って広い適用性を有することができる。
このプロトコルで説明する主な方法は、細胞の点滴や膀胱上皮への局所送達のために意図されたいずれの薬剤のための広範なアプリケーションを持っていたマウスの膀胱のカテーテル法、である。上記で概説した具体的なプロトコルは、短期試験(〜10日)のために最適化されている。より高い細胞数が大きい腫瘍量、より急速な腫瘍増殖およびおそらく動物の損失をもたらすので、細胞の?…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、クリスティーナVoelkel·ジョンソンにNIHのR21〜CA143505によってサポートされていました。
Name of reagent |
Company |
Catalog number |
Comments |
6-8 week old female mice |
Jackson Laboratories |
Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664 |
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Trypsin* |
MediaTech |
MT25-053-CI |
Obtained through Fisher |
DMEM* |
MediaTech |
MT10-017-CV |
Obtained through Fisher |
FBS |
Hyclone |
SH30071.03 |
Heat-inactivated |
T25 flasks* |
Corning Costar |
Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63 |
Obtained through Fisher |
MB49 cells |
N/A |
N/A |
Obtained from Dr. Boehle (see reference11) |
Puralube Vet Ointment* |
Pharmaderm |
Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869 |
Obtained through Fisher |
Depilatory cream: Veet |
local pharmacy |
||
Lubricant: K-Y Jelly |
local pharmacy |
||
Catheters* |
Exel International |
Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21 |
Obtained through Fisher |
Isoflurane |
Terrell |
NDC 66794-011-25 |
Obtained though hospital pharmacy |
1 ml slip tip TB syringes |
Becton Dickinson |
BD309659 Fisher:14-823-434 |
|
D-Luciferin |
Gold Biotechnologies |
L-123-1 |
|
Ad-CMV-Luc |
VectorBiolabs |
1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use |
Infectious agent that requires BSL2 containment |
Steady-Glo Luciferase Assay System |
Promega |
E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml) |
*available through multiple vendors
EQUIPMENT
Material name |
Company |
Catalog number |
Comments |
Anesthesia system |
E-Z Systems, Euthanex Corporation |
Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109 |
Obtained through Fisher |
Xenogen IVIS 200 |
Caliper Life Sciences |
http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm |
|
FLUOstar Optima |
BMG Labtech |
http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |