Implantación de células de cáncer en el órgano de origen puede servir como un modelo preclínico útil para evaluar nuevas terapias. Células de carcinoma de vejiga MB49 se pueden cultivar dentro de la vejiga después de la instilación intravesical. Este protocolo demuestra la cateterización de la vejiga de ratón para el propósito de la implantación del tumor y la entrega adenoviral.
El cáncer de vejiga es el segundo cáncer más común del tracto urogenital y nuevos enfoques terapéuticos que pueden reducir son necesarios recurrencia y progresión. El microambiente tumoral puede influir significativamente en el desarrollo del tumor y la respuesta al tratamiento. Por lo tanto, a menudo es deseable hacer crecer las células tumorales en el órgano del que se derivan. Este protocolo describe un modelo ortotópico de cáncer de vejiga, en el que las células de carcinoma de vejiga murino MB49 se instila en la vejiga a través de la cateterización. Implantación de células tumorales con éxito en este modelo requiere la interrupción de la capa protectora de glucosaminoglucano, que se puede lograr por medios físicos o químicos. En nuestro protocolo de la vejiga se trata con tripsina antes de la instilación de células. La cateterización de la vejiga también puede ser utilizado para entregar la terapéutica de una vez establecidos los tumores. Este protocolo describe la entrega de una construcción adenoviral que expresa un gen indicador de luciferasa. Si bien our protocolo ha sido optimizado para los estudios a corto plazo y se centra en la entrega de genes, la metodología de ratón cateterismo vesical tiene amplias aplicaciones.
El cáncer de vejiga es el segundo cáncer más común del tracto urogenital, con cerca de 75.000 nuevos casos y 15.000 muertes esperadas en el 2012 1. Las altas tasas de recurrencia requieren seguimiento de por vida, lo que hace que el cáncer de vejiga uno de los cánceres más costosas de tratar. El cáncer de vejiga que ha invadido la capa muscular puede producir metástasis en el hígado, pulmón o hueso a través del sistema linfático. La terapia multimodal de tumores avanzados resultados en sólo 20-40% de supervivencia a los 5 años. Por lo tanto, las estrategias de tratamiento eficaces destinadas a reducir la recurrencia y progresión del cáncer superficial de vejiga, así como mejorar los resultados terapéuticos en los pacientes con enfermedad avanzada se necesitan con urgencia.
Desarrollo de nuevas terapias requiere modelos preclínicos para evaluar la eficacia después de la evaluación inicial in vitro. El microambiente tumoral puede influir significativamente en el desarrollo del cáncer y la capacidad de respuesta, lo que pone de relieve la necesidad de preclínicamodelos de AL en el que surgen los tumores o se pueden establecer en el órgano de origen. Un enfoque es el desarrollo de modelos transgénicos en los que surgen los tumores de forma espontánea o puede ser inducida en una manera específica de órgano. Una excelente protocolo de un modelo de cáncer de vejiga transgénico ha sido recientemente publicado 2. El inconveniente de los modelos transgénicos es que los tumores tienden a desarrollarse lentamente y con menos uniformidad de lo deseado. Además, el costo de mantenimiento de una colonia de cría tiene que ser considerado. Una alternativa a modelos transgénicos es la implantación ortotópica de las células tumorales, que tiene la ventaja de marcos corto de tiempo para el establecimiento de tumores en ratones disponibles comercialmente. Mientras que algunas líneas celulares de cáncer de vejiga humanos se pueden cultivar de forma ortotópica (hemos utilizado con éxito UM-UC-3), puede ser deseable para establecer tumores en ratones inmunocompetentes. Dos líneas celulares de cáncer vesical murino, que crecen ortotópicamente son MBT-2 y MB49 3. Desde MBT-2 células están contaminados con la replicaciónretrovirus tipo C 4, hemos elegido las células MB49 para nuestros estudios. Es importante señalar que las células MB49 fueron aisladas de un ratón macho y implantaciones ortotópico son por razones anatómicas realizados en ratones hembra. Esto tiene la ventaja de una fácil identificación de las células implantadas por marcadores del cromosoma Y, pero la falta de coincidencia de género puede ser un inconveniente para estudios inmunológicos.
El epitelio de la vejiga está revestida por una capa de glucosaminoglucano (GAG), que funciona como una barrera para la infección por microorganismos. Esta barrera también puede interferir con la implantación de las células tumorales y varios métodos se han desarrollado para superar esta dificultad (Tabla 1). Electrocauterio se ha utilizado ampliamente como un medio físico para interrumpir la capa GAG 5-13 y un electrocauterio demostrando protocolo ha sido recientemente publicado en Jove 14. Sin embargo, no debe estar disponible una unidad de electrocauterio, medios químicos para destruir el GAG capa tal como nitrato de plata o de poli-L-lisina también se puede utilizar 15-24. Los tumores se establecieron de manera efectiva por una breve exposición de la vejiga a un pequeño volumen de nitrato de plata (5-10 l, 0,15 a 1,0 M, ~ 10 seg) o de contacto más largo con poli-L-lisina (100 l de 0,1 mg / ml durante 20 min) (Tabla 1). Aquí se describe un método que usa tripsina para facilitar la implantación de las células MB49.
En un intento de mejorar los enfoques terapéuticos para el cáncer de vejiga, la terapia génica ha llamado la atención significativa. Desde un punto de vista clínico, el cáncer de vejiga es un objetivo ideal para la terapia génica debido a la fácil accesibilidad del órgano y la capacidad de administrar localmente la carga útil. Los vectores virales que se han explorado para la terapia génica del cáncer de vejiga incluyen un virus oncolítico del herpes simple 25, 26 de retrovirus, virus de la viruela del canario 27, virus de la vacuna, de AAV, y adenovirus 28. En la segunda parte de nuestro protocolo, se describe un método para la entrega viral que es prácticamente idéntica a la instilación de las células tumorales. De interés en nuestro laboratorio es el desarrollo de nuevos enfoques para la entrega de genes, que evaluamos a través de la bioluminiscencia usando un vector adenoviral que expresa un transgen de la luciferasa. Sin embargo, la metodología de la cateterización de la vejiga puede ser utilizado para la entrega de diversos agentes y por lo tanto tiene una amplia aplicabilidad.
La principal metodología descrita en este protocolo es la cateterización de la vejiga del ratón, que tiene amplias aplicaciones para la instilación de células o de cualquier agente destinado a la administración local en el epitelio de la vejiga. El protocolo específico descrito anteriormente ha sido optimizado para los estudios a corto plazo (~ 10 días). Implantar el número exacto de las células es fundamental, ya que un número mayor de células dará lugar a un crecimiento rápido del tumor más y, posibleme…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el NIH R21 CA143505 a Christina Voelkel-Johnson.
Name of reagent |
Company |
Catalog number |
Comments |
6-8 week old female mice |
Jackson Laboratories |
Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664 |
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Trypsin* |
MediaTech |
MT25-053-CI |
Obtained through Fisher |
DMEM* |
MediaTech |
MT10-017-CV |
Obtained through Fisher |
FBS |
Hyclone |
SH30071.03 |
Heat-inactivated |
T25 flasks* |
Corning Costar |
Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63 |
Obtained through Fisher |
MB49 cells |
N/A |
N/A |
Obtained from Dr. Boehle (see reference11) |
Puralube Vet Ointment* |
Pharmaderm |
Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869 |
Obtained through Fisher |
Depilatory cream: Veet |
local pharmacy |
||
Lubricant: K-Y Jelly |
local pharmacy |
||
Catheters* |
Exel International |
Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21 |
Obtained through Fisher |
Isoflurane |
Terrell |
NDC 66794-011-25 |
Obtained though hospital pharmacy |
1 ml slip tip TB syringes |
Becton Dickinson |
BD309659 Fisher:14-823-434 |
|
D-Luciferin |
Gold Biotechnologies |
L-123-1 |
|
Ad-CMV-Luc |
VectorBiolabs |
1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use |
Infectious agent that requires BSL2 containment |
Steady-Glo Luciferase Assay System |
Promega |
E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml) |
*available through multiple vendors
EQUIPMENT
Material name |
Company |
Catalog number |
Comments |
Anesthesia system |
E-Z Systems, Euthanex Corporation |
Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109 |
Obtained through Fisher |
Xenogen IVIS 200 |
Caliper Life Sciences |
http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm |
|
FLUOstar Optima |
BMG Labtech |
http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |