Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En Orthotopic blåscancer modell för Gene Delivery Studier

doi: 10.3791/50181 Published: December 1, 2013

Summary

Implantering av cancerceller in i ursprungsorgan kan fungera som en användbar preklinisk modell för att utvärdera nya terapier. MB49 blåsa cancerceller kan odlas i urinblåsan efter intravesikal instillation. Detta protokoll visar kateterisering av musen blåsan för att tumörimplantation och adenoviral leverans.

Abstract

Urinblåsecancer är den näst vanligaste cancerformen i den urogenitala kanalen och nya behandlingsmetoder som kan minska återfall och progression behövs. Tumormicroenvironmenten kan avsevärt påverka tumörutveckling och terapisvar. Därför är det ofta önskvärt att odla tumörceller i det organ från vilka de har sitt ursprung. Detta protokoll beskriver en orthotopic modell av cancer i urinblåsan, där MB49 murina blåskarcinom celler ingjutit in i urinblåsan via kateter. Framgångsrik tumörcells implantation i denna modell kräver avbrott i det skyddande glykosaminoglykan skiktet, vilket kan åstadkommas genom fysikaliska eller kemiska medel. I våra protokoll blåsan behandlas med trypsin före cellinstillation. Kateterisering av blåsan kan också användas för att leverera terapeutiska medel när tumörerna är etablerade. Detta protokoll beskriver leverans av en adenoviral konstrukt som uttrycker en luciferas reportergen. Medan our protokoll har optimerats för korttidsstudier och fokuserar på genen leverans, har metodiken för musen blåsan kateterisering breda applikationer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Urinblåsecancer är den näst vanligaste cancerformen i den urogenitala kanalen med nästan 75.000 nya fall och 15.000 dödsfall som förväntas under 2012 1. Hög frekvens av återfall kräver livslång uppföljning, vilket gör blåscancer en av de mest kostsamma cancer att behandla. Cancer i urinblåsan som har invaderat muskeln skiktet kan metastasera till lever, lunga eller ben via det lymfatiska systemet. Multimodal behandling av avancerade tumörer resulterar i endast 20-40% överlevnad efter 5 år. Därför finns ett stort behov effektiva behandlingsstrategier för att minska återfall och progression av ytlig blåscancer och förbättra terapeutiska resultat hos patienter med avancerad sjukdom.

Utveckling av nya läkemedel krävs prekliniska modeller för att utvärdera effekten efter inledande in vitro-utvärdering. Tumormicroenvironmenten kan avsevärt påverka cancerutveckling och lyhördhet, vilket understryker behovet av preclinical modeller där tumörer uppstår eller kan fastställas i det organ i ursprung. Ett tillvägagångssätt är att utveckla transgena modeller i vilka tumörer uppstå spontant eller kan induceras i en organspecifikt sätt. En utmärkt protokoll av en transgen blåscancer modell har nyligen publicerats 2. Nackdelen med transgena modeller är att tumörer tenderar att utvecklas långsamt och med mindre enhetlighet än önskat. Dessutom har kostnaden för att upprätthålla en avelskoloni vägas. Ett alternativ till transgena modeller är orthotopic implantation av tumörceller, som har fördelen av korta tidsramar för tumör etablering i kommersiellt tillgängliga möss. Medan vissa humana cancer i urinblåsan cellinjer kan odlas orthotopically (vi har med framgång använt UM-UC-3), kan det vara önskvärt att upprätta tumörer i immunkompetenta möss. Två murina blåscancer cellinjer, som växer orthotopically är MBT-2 och MB49 3. Eftersom MBT-2-celler är förorenade med replikeratyp C retrovirus 4, har vi valt MB49 celler för våra studier. Det är viktigt att notera att MB49-celler isolerades från en manlig mus och orthotopic implantationer är endast för anatomiska skäl utförs i honmöss. Detta har fördelen av enkel identifiering av de implanterade cellerna genom markörer på Y-kromosomen, men obalansen kön kan vara en nackdel för immunologiska studier.

Blåsan epitel kantas av en glykosaminoglykan (GAG)-skikt, som fungerar som en barriär för infektion av mikroorganismer. Denna barriär kan också störa implantation av tumörceller och ett flertal metoder har utvecklats för att övervinna denna svårighet (tabell 1). Diatermi har använts i stor utsträckning som ett fysiskt sätt att störa GAG lagret 5-13 och ett protokoll som visar diatermi har nyligen publicerats i JUPITER 14. Dock bör en diatermi enhet inte är tillgängliga, kemiska medel för att förstöra GAG skikt, såsom silvernitrat eller poly-L-lysin kan också användas 15 till 24. Tumörer som tillsatts genom en kort exponering av blåsan till en liten volym av silvernitrat (5 till 10 | il, 0,15 till 1,0 M, ~ 10 sek) eller längre kontakt med poly-L-lysin (100 pl av 0,1 mg / ml under 20 min) (tabell 1). Här beskriver vi en metod som använder trypsin för att underlätta implantation av MB49 celler.

I ett försök att förbättra terapeutiska metoder för cancer i urinblåsan har genterapi rönt betydande uppmärksamhet. Ur klinisk synvinkel är blåscancer ett perfekt mål för genterapi på grund av lätt tillgänglighet av orgeln och förmågan att lokalt leverera nyttolasten. Virala vektorer som har utforskats för blåscancer genterapi inkluderar ett onkolytiskt herpes simplex virus 25, retrovirus 26, canarypoxvirus 27, vaccinia-virus, AAV, och adenovirus 28. I den andra delen av vår protokoll, beskriver vi en metod för viral leverans som är praktiskt taget identisk med instillation av tumörcellerna. Av intresse i vårt labb är att utveckla nya metoder för gen leverans, vilket vi bedömer via mareld med hjälp av en adenovirusvektor som uttrycker en luciferas transgen. Emellertid kan metoden i blåsan kateterisering användas för tillförsel av olika medel och har bred tillämpbarhet därför.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla som deltar i djurförsök har granskats och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid medicinska universitetet i South Carolina. Protokollet godkändes enligt USDA kategori D för smärta.

1. Cell Implantation

  1. Två dagar innan du utför proceduren, plåt 1 x 10 6 MB49 celler till T-25 kolvar. Använd hög glukos DMEM kompletterat med 10% FBS (och antibiotika, om så önskas). En kolv är tillräcklig för varje grupp av upp till fem möss som skall bedövas och implanteras parallellt.
  2. På dagen för det förfarande, förbereda trypsin för instillation genom utspädning av steril 0,25% vävnadsodlingskvalitet trypsin till 0,125% med sterilt DMEM basmedium (1:02 utspädning). 1,2 ml är tillräckligt för 10 möss. Placera i en 37 ° C vattenbad för att ekvilibrera.
  3. Prewarm en värmedyna och placera den under nosecones av anestesisystemet som kommer att användas för att leverera isoflurane. Placera ett rent absorberande dynan över värmedynan.
  4. Placera möss i induktionskammare av anestesisystemet och inducera anestesi med 3% isofluran. När möss har förlorat medvetandet, vilket verifieras genom förlust av toe-nypa reflex, överföra dem till nosecones. Se till varje djur är i ryggläge och korrekt placerad på värmedyna för att bibehålla kroppstemperaturen.
  5. Minska isofluran koncentration till 2% för att upprätthålla anestesi.
  6. Applicera oftalmisk salva för båda ögonen för att förhindra torkning.
  7. Valfritt steg: Ta bort buken hår. Hår på nedre delen av magen måste bort om in vivo självlysande imaging kommer att utföras.
    1. Applicera ett generöst lager av hårborttagningskräm, t.ex. Veet, till den lägsta 1 i kvadrat av päls på magen, se till att inte ta kontakt med de yttre könsorganen. Vänta 3 min.
    2. Ta bort hår genom att gnugga området med en torr svamp, och sedan använda en fuktig svamp för att rengöra huden. Upprepa en gång, om det behövs.
  8. Kateterisera blåsan
    1. Smörj en ny, steril 24 G pediatrisk venkateter med en icke-irriterande smörj gel som KY. Avlägsna och kassera nålen. Om läckage av vätska runt katetern är ett vanligt problem, dvs. Det förekommer oftare än i en av tio möss, större borr katetrar (20 G) kan användas. Detta kan vara en viktig faktor i möss äldre än 8 veckor.
    2. Håll i navet av katetern, använd tummen och pekfingret på din andra handen för att sprida bakbenen på musen och exponera urinrörsmynningen. Försiktigt in katetern i urinröret vid en 45 ° vinkel, ändra vinkeln till en parallell med bänken för att sätta in den helt.
    3. Efter full insättning, lyft katetem försiktigt och håller den parallellt till bänken, och bekräfta visuellt att den är placerad i urinröret och inte slidan, vilket är lägre än det. Om korrekt placerad, kommer katetern att kunna vara iinfogas helt eftersom slidan är kortare än urinröret.
    4. Minska isofluran koncentrationen till 1%.
  9. Fäst en spets till en P200 pipett och avlägsna urin från blåsan genom att applicera sug på den yttre änden av katetern. Avlägsna eventuellt återstående urin från navet hos katetern. Kassera urin och lämnar katetern på plats.
  10. Försiktigt pipettera 80 | il 0,125% trypsin-lösning in i navet hos katetern, för att undvika luftbubblor. Fäst en 1 ml luftfylld spruta till kateternavet och långsamt trycka kolven 0,1-0,2 ml att leverera trypsin in i urinblåsan.
  11. Lämna sprutan och kateterenhet i stället för 15 min. Upprepa steg från 1,8 till 1,11 för någon av de kvarvarande sövda möss (upp till 4). Gå vidare till nästa steg under väntetiden. TIPS: I början kan det vara bra att ha någon annan förbereda cellerna (steg 1,12).
  12. Förbered MB49 celler för implantation. Celler ströks ut med 1 x 10 6 per T-25 kolv 48 timmar före implantation (steg 1,1).
    1. Ta bort media och tillsätt 500 l av 0,25% trypsin till kolven. När cellerna loss 5 ml komplett DMEM att återsuspendera celler. Ta bort en 50 ul alikvot att räkna, och centrifugera återstoden vid 1000 rpm under 5 min. Under centrifugeringssteget fortsätta till steg 1.12.2 och 1.12.3.
    2. Räkna celler med användning av en hemocytometer. Beräkna de celler / ml. Beräkna sedan volymen som behövs för att cellpelleten till 4 x 10 6 celler / ml (2 x 10 5 celler per 50 pl).
    3. Häll av supernatanten från centrifugerade cellerna och suspendera pelleten i DMEM basmedium använda den volym som krävs för att suspendera cellerna till 4 x 10 6 celler / ml (som beräknats i steg 1.12.2). Håll cellerna vid rumstemperatur.
  13. När 15 min tidpunkten för trypsinbehandling av blåsor är nådd, lossa luftfylld spruta från katetern lämnar katetern på plats. Tillbringade trypsin kommer normaltly strömma tillbaka ut genom katetern. Ta bort eventuella återstående trypsin från urinblåsan genom sugning med P200 pipett som i steg 1.9 ovan och kasta.
  14. Omedelbart pipettera 50 ul av MB49-cellsuspension in i navet hos katetern. Fäst 1 ml luftfyllda sprutan till navet i katetern och leverera cellerna till urinblåsan genom att långsamt trycka kolven 0,1-0,2 ml. Upprepa det här steget upp till ytterligare fyra gånger för att implantera alla fem möss. Kassera alla oanvända celler.
  15. Lämnar katetern-sprutenheten på plats, gör att cellerna att bo i blåsan under 50 min.
  16. Försiktigt dra tillbaka katetern-sprutenheten från urinröret. Vrid isofluran koncentrationen till noll och flyttar varje mus en tum eller två bort från noskonen för att återhämta sig på värmedyna.
  17. När en mus har återfått sin rätande reflex, returnera den till sin bur.

2. Intravesikal Leverans av adenovirus (8 dagar efter implantation av celler) VARNING: Denna del av protokollet använder adenovirus, vilket är ett smittämne och bör hanteras under strikta riktlinjer BSL2 (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/).

Alla ingrepp med smittämnen har godkänts av Institutional Biosäkerhetskommittén av medicinska universitetet i South Carolina.

  1. Åtta dagar efter att implantera möss med MB49 celler, kontrollera hematuri. Plocka upp enskilda djur över ett vitt papper absorberande papper och tryck försiktigt på buken för att utplåna droppar urin på papperet. Urin som är rosa till röd visar hematuri och är ett tecken på att tumörer har etablerat. Tumör take hastigheten är åtminstone 80% och med utmärkt teknik kan vara så hög som 100%.
  2. Tina adenoviral lager på is och späd till 10 9 PFU/50 il (2 x 10 10 PFU / ml) i steril, rumstemperatur PBS.
  3. Söva möss som beskrivs i steg 1,3-1,6 ovan.
  4. Kateterisera möss som beskrivs i steg 1,8 och avlägsna urin som i steg 1.9
  5. Efter att urinen har tagits bort omedelbart pipettera 50 | il av virussuspension i navet hos katetern. Fäst 1 ml luftfyllda sprutan till navet i katetern och leverera virus till urinblåsan genom att långsamt trycka kolven 0,1-0,2 ml.
  6. Lämnar katetern-sprutenheten på plats, gör det möjligt för viruset att bo i blåsan under 40 min.
  7. Försiktigt dra tillbaka katetern-sprutanordningen från urinröret, och kasta in 10% blekmedelslösning för att inaktivera eventuellt kvarvarande virus.
  8. Vrid isofluran koncentrationen till noll och flyttar varje mus en tum eller två bort från noskonen för att återhämta sig på värmedyna.
  9. När en mus har återfått sin rätande reflex, returnera den till sin bur.
  10. Markera burar för att indikera att möss har ingjutit med adenovirus. Virus kommer att kasta in i buren strö i flera dagar och alla burar och sängkläder måste varahanteras och desinficeras på lämpligt sätt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hematuri har observerats i nästan alla möss inom 8 dagar efter implantation av 200.000 MB49 celler. Såsom visas i figur 1, blåsa i vikt mer än fördubblas från 34,7 ± 3,3 mg (intervall 31 till 37 mg, n = 4) i nontumor bärande möss till 87,5 ± 19,2 mg (intervall 77 till 120 mg, n = 10) i möss som har implanterats med MB49 celler. När det gäller genen leverans, fann vi att avbildning möss 24 timmar efter virusinstillation ger en starkare signal än efter 48 timmar (Figur 2). Adenoviral leverans varierar mycket mellan djur, vilket bör beaktas vid planering gruppstorlek för statistiska ändamål (figur 2 och 3). Om ett litet djur avbildningssystem inte är tillgängligt, en alternativ metod för att mäta uttrycket av luciferas transgen är att avlägsna och homogenisera i blåsan för in vitro-analys. Jämförelse mellan in vivo-analys med användning av IVIS200 litet djur systemam-och in vitro-analys med användning av Steady-Glo kit, indikerar utmärkt korrelation mellan datauppsättningar (Figur 3).

Figur 1
Figur 1. Analys av tumörbörda. Vikt av nontumor (n = 4) och tumörbärande (n = 10) mus blåsor 9 dagar efter instillation av 200000 MB49-celler. Statistisk signifikans bestäms av Students t-test med Graphpad programvaran. * P = 0,0002. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. In vivo-analys av genuttryck. 9 PFU AdCMV.Luc (+). Att visualisera luciferas injicerades mössen intraperitonealt med 200 | ig luciferin / mus. Uttryck av luciferas transgen mättes in vivo med hjälp av IVIS200 smådjursbildsystem. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 3
Figur 3. Jämförelse av bioluminescence signaler som erhållits genom in vivo litet djur avbildning och en analys in vitro. Tjugofyra timmar efter tillförsel av virus lagringsbuffert (ofyllda cirklar) eller 1 x 10 9 pfu AdCMV.Luc (fyllda cirklar), möss avbildas med IVIS200 och sedan sacrificed. Blåsor togs bort och homogeniseras för in vitro-analys av den självlysande signal med hjälp av Steady-Glo kit. Luciferas-signal som erhålls genom varje metod uttrycks i godtyckliga enheter (AU). Förklaringsgraden (R2) beräknades med Dataanalys tillägget för Microsoft Excel. Klicka här för att visa en större bild .

Förolämpning mot GAG lagret Celler implanterade Retentionstid Tumör upptäckt och utveckling referens
Diatermi 0,01-1 x 10 5 MB49 Hematuri: 1.000 celler: 0/0, 10.000 celler: 4/6, 100.000 celler: 6/6 tumörer: 1.000 celler: 0/6, 10000 eller flera celler: 6/6, 6/6 (100%) 5
Electrocautery 5 x 10 4 MB49-Luc Tumör-incidens: 90% (som i referens 11) 6
Diatermi 1 x 10 5 MB49 ~ 3 tim Tumör-incidens: 90% vid 50 dagar 7
Diatermi 1 x 10 5 MB49-PSA PSA: upptäckas så tidigt som 4 dagar efter implantation 8
Diatermi 1 x 10 5 MB49 Tumör incidens: 90% 9
Diatermi 5 x 10 4 MB49 2 hr Tumör incidens: 83,3% (10/12) på dag 21 10
Diatermi 2 x 10 4 MB49 2 hr Tumör-incidens: 100% vid dag 28 11
Diatermi 1-5 x 10 4 MB49 3 tim Hematuri: 100% vid dag 16, Tumor incidens: 100% 12
Diatermi 1 x 10 5 MB49 3 tim Tumör incidens: 97,3% (73/75) 13
PLL (100 ul 0,01% 20 min) 1 x 10 5 MB49-PSA 2 hr Tumör-incidens: 100% 15
PLL (0,1 mg / ml) 1 x 10 5 MB49-PSA 2 hr Tumör-incidens: 100% 16
PLL (100 | il 0,1 mg / ml, 20 min) 1 x 10 5 MB49 1 hr Tumör-incidens: 94% (15/16) 17
PLL (0,1 mg / ml) 1 x 10 6 MB49 Hematuri på dag 7: 50%, 100% vid dag 14 18
PLL (100 | il 0,1 | ig / ml 20 min) eller 22% etanol 1 x 10 5 MB49 1 hr Tumör förekomst: Ej modifierat blåsa: 0%, PLL: 80-100%, Etanol 40-80% 19
Silvernitrat (5 pl 0,2 M) 1 x 10 6 MB49 1 hr Tumör-incidens: 100% 20
Silvernitrat (10 | il 0,15 M 10 sek) 5 x 10 5 MB49 Tumör incidens: 92% (46/50) 21
Silvernitrat (8 pl 1 M 10 sek) 5 x 10 5 MB49 2 hr Hematuri: 100% vid dag 7; dagar hematuri 100%; tumörincidens: 96,7% (29/30 möss) vid dag 15 22
Silvernitrat 5 | il 0,2 M 0,5 till 2 x 10 6 MB49-PSA 1 hr PSA detekteras 23
HCl (100 | il 0,1 M 15 sek) 1 x 10 6 MB49 1 hr 24

Tabell 1. Tumör upptäckt och utveckling efter orthotopic implantation av MB49-celler. Olika fysikaliska och kemiska förolämpningar har använts för störning av GAG-skiktet för att underlätta intravesikal tillväxten av MB49-celler. Experimentella förhållanden och resultat från tidigare studier med hjälp av MB49 orthotopic modellen sammanfattas. När de är tillgängliga, uppgifterna inom parentes i den första kolumnen innehåller volym, koncentration och kontakttid för medel som används för kemisk störning av GAG lagret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den primära metod som beskrivs i detta protokoll är kateterisering av mus blåsor, som har breda applikationer för instillation av celler eller någon agent är avsedd för lokal leverans till epitelcellerna i urinblåsan. Den specifika protokoll som beskrivs ovan har optimerats för korttidsstudier (~ 10 dagar). Implantation det exakta antalet celler är kritisk, eftersom en högre cell nummer kommer att leda till en snabbare tumörtillväxt och eventuellt förlust av djur på grund av stor tumörbörda. Med hjälp av 200.000 MB49 celler för instillation kan kräva euthanizing upp till 25% av djuren vid dag 14 på grund av alltför tumörbörda. Enligt vår erfarenhet är möss inte påverkas negativt av tumörbelastningen inom 12 dagar. Förutom standardkriterier som letargi, dålig grooming, och / eller aptitlöshet driven tumörbörda i denna modell bevisas av oförmåga att urinera.

En viktig fråga för detta protokoll är logistiken. Först MB49-celler växa rapidly och plätering miljoner celler två dagar före implantering kommer att ge optimala kulturer i logfas på dagen för instillation. Om det antal djur som krävs för ett experiment överstiger det antal djur som kan implanteras i en dag, kommer MB49 kulturer måste inrättas i enlighet därmed (på flera dagar) för att förhindra överväxt av kulturer. För det andra, till dess att tekniken har fulländat bör användare arbeta med en liten grupp av djur. Erfarna användare kommer att kunna implantera 6 grupper om 5 möss vardera i en dag utan en assistent (1,5 tim / grupp inklusive uppehållstider). Emellertid är det till en början till hjälp att ha en assistent förbereda och räkna cellerna för instillation. Slutligen är platsen för utrustning viktigt. Helst biosäkerhet skåpet och anestesiutrustning finns i samma rum.

En potentiell begränsning är att anestesiapparater har 5 nosecones, som är i bruk under uppehållstiden. Om ett stort antal möss rutinmässigt implanterade, seVeral sådana system kan användas parallellt. I teorin skulle andra metoder för anestesi användas. Men en fördel med isofluran inhalationsanestesi som uppehållstid kan kontrolleras.

När tekniken med kateterisering behärskas, kan detta protokoll tillämpas på ett antal experimentella betingelser. Nya urinblåsan cancercellinjer eller celler som härrör från primära tumörer i urinblåsan kan utvärderas för sin potential att växa orthotopically. Vidare är det möjligt att implantera olika antal celler för att bestämma tröskelvärdet som erfordras för tumör take. Tumörtillväxttakten kan också fastställas. Dessa variationer kan vara särskilt användbart om jämförelser görs mellan genetiskt modifierade celler för att bedöma effekten av genen av intresse på tumör anläggning eller tillväxttakt. För övervakning av vidhäftning, tillväxt eller tumör ta, kan celler transfekterade med en reportergen såsom luciferas 6. Emellertid en viktig consideranson är effekterna av hypoxi och nekros på mareld signalen 29. Kateterisering kan också användas för att avge ett terapeutiskt medel. Vi använder för närvarande den orthotopic modell för att utvärdera genterapistrategier i en in vivo-miljö. Denna modell kommer att vara användbart för att optimera avgivning av terapeutiska medel och för att bestämma deras effekt på tumörregression och överlevnad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH R21 CA143505 till Christina Voelkel-Johnson.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Name of reagent

Company

Catalog number

Comments

6-8 week old female mice

Jackson Laboratories

Strain Name: C57BL/6J

Stock Number: 000664

Trypsin*

MediaTech

MT25-053-CI

Obtained through Fisher

DMEM*

MediaTech

MT10-017-CV

Obtained through Fisher

FBS

Hyclone

SH30071.03

Heat-inactivated

T25 flasks*

Corning Costar

Corning No.:3056

Fisher: 07-200-63

Obtained through Fisher

MB49 cells

N/A

N/A

Obtained from Dr. Boehle (see reference11)

Puralube Vet Ointment*

Pharmaderm

Henry Schein Company

No.:036090-6050059

Fisher: NC9676869

Obtained through Fisher

Depilatory cream: Veet

local pharmacy

Lubricant:

K-Y Jelly

local pharmacy

Catheters*

Exel International

Exel International

No.:26751;

Fisher: 14-841-21

Obtained through Fisher

Isoflurane

Terrell

NDC 66794-011-25

Obtained though hospital pharmacy

1 ml slip tip TB syringes

Becton Dickinson

BD309659

Fisher:14-823-434

D-Luciferin

Gold Biotechnologies

L-123-1

Ad-CMV-Luc

VectorBiolabs

1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use

Infectious agent that requires BSL2 containment

Steady-Glo Luciferase Assay System

Promega

E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml)

*available through multiple vendors

EQUIPMENT

Anesthesia system

E-Z Systems, Euthanex Corporation

Anesthesia system: EZ7000

5-port mouse rebreathing device: EZ109

Obtained through Fisher

Xenogen IVIS 200

Caliper Life Sciences

http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm

FLUOstar Optima

BMG Labtech

http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer. J. Clin. 62, (1), 10-29 (2012).
  2. Seager, C. M., Puzio-Kuter, A. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev. Res. 2, (12), 1008-1014 (2009).
  3. Chodak, G. W., Shing, Y., Borge, M., Judge, S. M., Klagsbrun, M. Presence of heparin binding growth factor in mouse bladder tumors and urine from mice with bladder cancer. Cancer Res. 46, (11), 5507-5510 (1986).
  4. De Boer, E. C., Teppema, J. S., Steerenberg, P. A., De Jong, W. H. Retrovirus type C in the mouse bladder carcinoma cell line MBT-2. J. Urol. 163, (6), 1999-2001 (2000).
  5. Lodillinsky, C., Rodriguez, V., et al. Novel invasive orthotopic bladder cancer model with high cathepsin B activity resembling human bladder cancer. J. Urol. 182, (2), 749-755 (2009).
  6. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, (1), 120-124 (2008).
  7. Brocks, C. P., Buttner, H., Bohle, A. Inhibition of tumor implantation by intravesical gemcitabine in a murine model of superficial bladder cancer. J. Urol. 174, (3), 1115-1118 (2005).
  8. Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin. Cancer Res. 10, (20), 6977-6984 (2004).
  9. Wu, Q., Mahendran, R., Esuvaranathan, K. Nonviral cytokine gene therapy on an orthotopic bladder cancer model. Clin. Cancer Res. 9, (12), 4522-4528 (2003).
  10. Bonfil, R. D., Russo, D. M., Binda, M. M., Delgado, F. M., Vincenti, M. Higher antitumor activity of vinflunine than vinorelbine against an orthotopic murine model of transitional cell carcinoma of the bladder. Urol. Oncol. 7, (4), 159-166 (2002).
  11. Bohle, A., Jurczok, A., et al. Inhibition of bladder carcinoma cell adhesion by oligopeptide combinations in vitro and in. 167, (1), 357-363 (2002).
  12. Gunther, J. H., Jurczok, A., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, (12), 2834-2837 (1999).
  13. Gunther, J. H., Frambach, M., et al. Effects of acetylic salicylic acid and pentoxifylline on the efficacy of intravesical BCG therapy in orthotopic murine bladder cancer (MB49). J. Urol. 161, (5), 1702-1706 (1999).
  14. Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. J Vis Exp. (48), (2011).
  15. Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and microenvironment modification during progression of murine orthotopic bladder cancer. Clin. Dev. Immunol. 2011, 865684 (2011).
  16. Seow, S. W., Cai, S., et al. Lactobacillus rhamnosus GG induces tumor regression in mice bearing orthotopic bladder tumors. Cancer Sci. 101, (3), 751-758 (2009).
  17. Mangsbo, S. M., Ninalga, C., Essand, M., Loskog, A., Totterman, T. H. CpG therapy is superior to BCG in an orthotopic bladder cancer model and generates CD4+ T-cell immunity. J. Immunother. 31, (1), 34-42 (2008).
  18. Loskog, A. S., Fransson, M. E., Totterman, T. T. AdCD40L gene therapy counteracts T regulatory cells and cures aggressive tumors in an orthotopic bladder cancer model. Clin. Cancer Res. 11, (24 Pt 1), 8816-8821 (2005).
  19. Loskog, A., Ninalga, C., et al. Optimization of the MB49 mouse bladder cancer model for adenoviral gene therapy. Lab Anim. 39, (4), 384-393 (2005).
  20. Bockholt, N. A., Knudson, M. J., et al. Anti-Interleukin-10R1 Monoclonal Antibody Enhances Bacillus Calmette-Guerin Induced T-Helper Type 1 Immune Responses and Antitumor Immunity in a Mouse Orthotopic Model of Bladder Cancer. J. Urol. 187, (6), 2228-2235 (2012).
  21. Watanabe, F. T., Chade, D. C., et al. Curcumin, but not Prima-1, decreased tumor cell proliferation in the syngeneic murine orthotopic bladder tumor model. Clinics. 66, (12), 2121-2124 (2011).
  22. Chade, D. C., Andrade, P. M., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int. Braz. J. Urol. 34, (2), 220-226 (2008).
  23. Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J. Urol. 172, 2414-2420 (2004).
  24. Zhang, Z., Xu, X., et al. The therapeutic potential of SA-sCD40L in the orthotopic model of superficial bladder cancer. Acta Oncol. 50, (7), 1111-1118 (2011).
  25. Kohno, S., Luo, C., et al. Herpes simplex virus type 1 mutant HF10 oncolytic viral therapy for bladder cancer. Urology. 66, (5), 1116-1121 (2005).
  26. Kikuchi, E., Menendez, S., et al. Highly efficient gene delivery for bladder cancers by intravesically administered replication-competent retroviral vectors. Clin. Cancer Res. 13, (15 Pt 1), 4511-4518 (2007).
  27. Siemens, D. R., Austin, J. C., See, W. A., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. Evaluation of gene transfer efficiency by viral vectors to murine bladder epithelium. J. Urol. 165, (2), 667-671 (2001).
  28. Siemens, D. R., Crist, S., Austin, J. C., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. Comparison of viral vectors: gene transfer efficiency and tissue specificity in a bladder cancer model. J. Urol. 170, (3), 979-984 (2003).
  29. Black, P. C., Shetty, A., et al. Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis. BJU Int. 106, (11), 1799-1804 (2010).
En Orthotopic blåscancer modell för Gene Delivery Studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies. J. Vis. Exp. (82), e50181, doi:10.3791/50181 (2013).More

Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies. J. Vis. Exp. (82), e50181, doi:10.3791/50181 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter