Implantering av cancerceller in i ursprungsorgan kan fungera som en användbar preklinisk modell för att utvärdera nya terapier. MB49 blåsa cancerceller kan odlas i urinblåsan efter intravesikal instillation. Detta protokoll visar kateterisering av musen blåsan för att tumörimplantation och adenoviral leverans.
Urinblåsecancer är den näst vanligaste cancerformen i den urogenitala kanalen och nya behandlingsmetoder som kan minska återfall och progression behövs. Tumormicroenvironmenten kan avsevärt påverka tumörutveckling och terapisvar. Därför är det ofta önskvärt att odla tumörceller i det organ från vilka de har sitt ursprung. Detta protokoll beskriver en orthotopic modell av cancer i urinblåsan, där MB49 murina blåskarcinom celler ingjutit in i urinblåsan via kateter. Framgångsrik tumörcells implantation i denna modell kräver avbrott i det skyddande glykosaminoglykan skiktet, vilket kan åstadkommas genom fysikaliska eller kemiska medel. I våra protokoll blåsan behandlas med trypsin före cellinstillation. Kateterisering av blåsan kan också användas för att leverera terapeutiska medel när tumörerna är etablerade. Detta protokoll beskriver leverans av en adenoviral konstrukt som uttrycker en luciferas reportergen. Medan our protokoll har optimerats för korttidsstudier och fokuserar på genen leverans, har metodiken för musen blåsan kateterisering breda applikationer.
Urinblåsecancer är den näst vanligaste cancerformen i den urogenitala kanalen med nästan 75.000 nya fall och 15.000 dödsfall som förväntas under 2012 1. Hög frekvens av återfall kräver livslång uppföljning, vilket gör blåscancer en av de mest kostsamma cancer att behandla. Cancer i urinblåsan som har invaderat muskeln skiktet kan metastasera till lever, lunga eller ben via det lymfatiska systemet. Multimodal behandling av avancerade tumörer resulterar i endast 20-40% överlevnad efter 5 år. Därför finns ett stort behov effektiva behandlingsstrategier för att minska återfall och progression av ytlig blåscancer och förbättra terapeutiska resultat hos patienter med avancerad sjukdom.
Utveckling av nya läkemedel krävs prekliniska modeller för att utvärdera effekten efter inledande in vitro-utvärdering. Tumormicroenvironmenten kan avsevärt påverka cancerutveckling och lyhördhet, vilket understryker behovet av preclinical modeller där tumörer uppstår eller kan fastställas i det organ i ursprung. Ett tillvägagångssätt är att utveckla transgena modeller i vilka tumörer uppstå spontant eller kan induceras i en organspecifikt sätt. En utmärkt protokoll av en transgen blåscancer modell har nyligen publicerats 2. Nackdelen med transgena modeller är att tumörer tenderar att utvecklas långsamt och med mindre enhetlighet än önskat. Dessutom har kostnaden för att upprätthålla en avelskoloni vägas. Ett alternativ till transgena modeller är orthotopic implantation av tumörceller, som har fördelen av korta tidsramar för tumör etablering i kommersiellt tillgängliga möss. Medan vissa humana cancer i urinblåsan cellinjer kan odlas orthotopically (vi har med framgång använt UM-UC-3), kan det vara önskvärt att upprätta tumörer i immunkompetenta möss. Två murina blåscancer cellinjer, som växer orthotopically är MBT-2 och MB49 3. Eftersom MBT-2-celler är förorenade med replikeratyp C retrovirus 4, har vi valt MB49 celler för våra studier. Det är viktigt att notera att MB49-celler isolerades från en manlig mus och orthotopic implantationer är endast för anatomiska skäl utförs i honmöss. Detta har fördelen av enkel identifiering av de implanterade cellerna genom markörer på Y-kromosomen, men obalansen kön kan vara en nackdel för immunologiska studier.
Blåsan epitel kantas av en glykosaminoglykan (GAG)-skikt, som fungerar som en barriär för infektion av mikroorganismer. Denna barriär kan också störa implantation av tumörceller och ett flertal metoder har utvecklats för att övervinna denna svårighet (tabell 1). Diatermi har använts i stor utsträckning som ett fysiskt sätt att störa GAG lagret 5-13 och ett protokoll som visar diatermi har nyligen publicerats i JUPITER 14. Dock bör en diatermi enhet inte är tillgängliga, kemiska medel för att förstöra GAG skikt, såsom silvernitrat eller poly-L-lysin kan också användas 15 till 24. Tumörer som tillsatts genom en kort exponering av blåsan till en liten volym av silvernitrat (5 till 10 | il, 0,15 till 1,0 M, ~ 10 sek) eller längre kontakt med poly-L-lysin (100 pl av 0,1 mg / ml under 20 min) (tabell 1). Här beskriver vi en metod som använder trypsin för att underlätta implantation av MB49 celler.
I ett försök att förbättra terapeutiska metoder för cancer i urinblåsan har genterapi rönt betydande uppmärksamhet. Ur klinisk synvinkel är blåscancer ett perfekt mål för genterapi på grund av lätt tillgänglighet av orgeln och förmågan att lokalt leverera nyttolasten. Virala vektorer som har utforskats för blåscancer genterapi inkluderar ett onkolytiskt herpes simplex virus 25, retrovirus 26, canarypoxvirus 27, vaccinia-virus, AAV, och adenovirus 28. I den andra delen av vår protokoll, beskriver vi en metod för viral leverans som är praktiskt taget identisk med instillation av tumörcellerna. Av intresse i vårt labb är att utveckla nya metoder för gen leverans, vilket vi bedömer via mareld med hjälp av en adenovirusvektor som uttrycker en luciferas transgen. Emellertid kan metoden i blåsan kateterisering användas för tillförsel av olika medel och har bred tillämpbarhet därför.
Den primära metod som beskrivs i detta protokoll är kateterisering av mus blåsor, som har breda applikationer för instillation av celler eller någon agent är avsedd för lokal leverans till epitelcellerna i urinblåsan. Den specifika protokoll som beskrivs ovan har optimerats för korttidsstudier (~ 10 dagar). Implantation det exakta antalet celler är kritisk, eftersom en högre cell nummer kommer att leda till en snabbare tumörtillväxt och eventuellt förlust av djur på grund av stor tumörbörda. Med hjälp …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH R21 CA143505 till Christina Voelkel-Johnson.
Name of reagent |
Company |
Catalog number |
Comments |
6-8 week old female mice |
Jackson Laboratories |
Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664 |
|
Trypsin* |
MediaTech |
MT25-053-CI |
Obtained through Fisher |
DMEM* |
MediaTech |
MT10-017-CV |
Obtained through Fisher |
FBS |
Hyclone |
SH30071.03 |
Heat-inactivated |
T25 flasks* |
Corning Costar |
Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63 |
Obtained through Fisher |
MB49 cells |
N/A |
N/A |
Obtained from Dr. Boehle (see reference11) |
Puralube Vet Ointment* |
Pharmaderm |
Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869 |
Obtained through Fisher |
Depilatory cream: Veet |
local pharmacy |
||
Lubricant: K-Y Jelly |
local pharmacy |
||
Catheters* |
Exel International |
Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21 |
Obtained through Fisher |
Isoflurane |
Terrell |
NDC 66794-011-25 |
Obtained though hospital pharmacy |
1 ml slip tip TB syringes |
Becton Dickinson |
BD309659 Fisher:14-823-434 |
|
D-Luciferin |
Gold Biotechnologies |
L-123-1 |
|
Ad-CMV-Luc |
VectorBiolabs |
1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use |
Infectious agent that requires BSL2 containment |
Steady-Glo Luciferase Assay System |
Promega |
E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml) |
*available through multiple vendors
EQUIPMENT
Material name |
Company |
Catalog number |
Comments |
Anesthesia system |
E-Z Systems, Euthanex Corporation |
Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109 |
Obtained through Fisher |
Xenogen IVIS 200 |
Caliper Life Sciences |
http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm |
|
FLUOstar Optima |
BMG Labtech |
http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |