Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Gene Teslim Çalışmaları Ortotopik Mesane Kanseri Modeli

doi: 10.3791/50181 Published: December 1, 2013

Summary

Kaynaklı organ içine kanser hücrelerinin implantasyonu yeni tedaviler değerlendirmek için yararlı bir ön-klinik modeli olarak hizmet edebilir. MB49 mesane karsinom hücreleri intravezikal Damla damla akıtma sonrası mesane içinde yetiştirilebilir. Bu protokol, tümör implantasyonu ve adenoviral teslimat amacıyla fare mesane kateterizasyon gösterir.

Abstract

Mesane kanseri ürogenital sistem ve nüks ve ilerleme ihtiyaç vardır azaltabilir yeni terapötik yaklaşımların en sık görülen ikinci kanser türüdür. Tümör mikro önemli ölçüde tümör gelişimini ve tedavi yanıtı etkileyebilir. Bu kaynaklandıkları organda tümör hücrelerinin büyümesini bu nedenle sık sık istenmektedir. Bu protokol MB49 kemirgen hücreleri, mesane karsinomu kateterizasyon ile torbasına damlatılır edildiği, mesane kanseri ortotopik bir model tanımlar. Bu modelde başarılı tümör hücre implantasyonu, fiziksel ya da kimyasal yollarla gerçekleştirilebilir koruyucu glikozaminoglikan tabakası, bozulması gerektirir. Protokolde mesane önce hücre damlatma için tripsin ile muamele edilmektedir. Mesane kateterizasyonu da tümörler oluştuğunda kez terapötik sunmak için de kullanılabilir. Bu protokol, bir lusiferaz raportör geni ifade eden bir adenoviral konstruktun teslimat açıklanmaktadır. O süreur protokol kısa süreli çalışmalar için optimize edilmiş ve gen teslimat odaklanmaktadır olmuştur, fare mesane kateterizasyonu metodoloji geniş uygulamaları vardır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mesane kanseri 2012 1. beklenen yaklaşık 75,000 yeni vaka ve 15.000 ölüm ile ürogenital sistemin en sık görülen ikinci kanser türüdür. Nüks oranlarının yüksek mesane kanseri tedavisinde pahalı kanserlerin biri yapar ömür boyu takip gerektirir. Kas tabakası işgal etmiştir Mesane kanseri lenf sistemi yoluyla karaciğer, akciğer veya kemik metastaz yapabilir. 5 yıl sonra sadece% 20-40 hayatta gelişmiş tümörler sonuçları multimodal tedavi. Bu nedenle, yüzeyel mesane kanseri nüks ve ilerlemesini azaltılması gibi gelişmiş hastalığı olan hastalarda tedavi sonuçlarını iyileştirmeye yönelik etkili tedavi stratejilerine acilen ihtiyaç vardır.

Yeni tedavilerin geliştirilmesi ilk in vitro değerlendirme sonrasında etkinliğini değerlendirmek için klinik öncesi modelleri gerektirmektedir. Tümör mikro ölçüde preclinic ihtiyacını vurgular ki, kanser gelişimi ve yanıt etkileyebilirtümörler ortaya edildiği veya buna al modelleri kökenli organda kurulabilir. Bir yaklaşım, tümörler, kendiliğinden ortaya çıkan ya da bir organa özgü bir şekilde indüklenebilir transgenik model geliştirilmesidir. Transjenik bir mesane kanseri modelinde mükemmel bir protokol son 2 yayınlanmıştır. Transgenik modellerin dezavantajı tümörler yavaş ve istenenden daha az tekdüzelik ile geliştirme eğiliminde olmasıdır. Buna ek olarak, bir üreme koloni korumanın maliyeti göz önünde bulundurulmalıdır. Transgenik model için alternatif bir ticari olarak temin edilebilir, farelerde tümör kurulması için kısa zaman dilimlerinde yararı vardır tümör hücrelerinin implantasyonu ortotopik vardır. Bazı insan mesane kanseri hücre çizgileri orthotopically yetiştirilebilir da (başarılı UM-UC-3 kullanmış), bu bağışıklığı yeterli farelerde tümörler oluşturmak için arzu edilebilir. Orthotopically büyümesi iki kemirgen mesane kanseri hücre çizgileri, MBT-2 ve MB49 3 bulunmaktadır. MBT-2 hücreleri çoğaltılıyor ile kontamine olduğundanC retrovirüsü 4 yazın, biz çalışmalar için MB49 hücreleri seçtiniz. Bu MB49 hücreleri, erkek fare izole edilmiş ve ortotopik implantasyonları dişi farelerde yapılan anatomik nedenlerle vardır edildi olduğunu not etmek önemlidir. Bu Y kromozomunun belirteçleri tarafından nakledilen hücrelerin kolay tanımlanması yararı vardır, ancak toplumsal cinsiyet uyumsuzluğu immünolojik çalışmalar için bir dezavantaj olabilir.

Mesane epitel mikroorganizmaların enfeksiyonu için bir bariyer olarak işlev gören bir glikozaminoglikan (GAG) tabakası ile kaplı olduğu. Bu bariyer, bu zorluk (Tablo 1) üstesinden gelmek için geliştirilmiştir tümör hücreleri ve çeşitli yöntemler implantasyonu engelleyebilir. Elektrokoter GAG tabaka 5-13 ve bir protokol gösteren elektro-son Jüpiter 14 yayınlanmıştır bozmak için fiziksel bir araç olarak yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Ancak, elektrokoter birim mevcut olmamalı, kimyasal G yok etmek anlamına gelirÖrneğin gümüş nitrat ya da poli-L-lisin gibi AG tabakası, aynı zamanda 15-24 de kullanılabilir. Tümörler, bir gümüş nitrat küçük bir hacme mesane kısa maruz kalma ile etkili kurulan (5-10 ul, 0,15-1,0 M, ~ 10 saniye) ya da poli-L-lisin ile uzun temas (0.1 mg / ml 100 ul 20 dakika boyunca) (Tablo 1). Burada MB49 hücre implantasyonu kolaylaştırmak için tripsin kullanan bir yöntem tarif eder.

Mesane kanseri için tedavi yaklaşımları geliştirmek amacıyla, gen terapisi önemli dikkat çekmiştir. Görüş Klinik açıdan, mesane kanseri, kolay organın erişilebilirliği ve yerel olarak yük sunmak için yeteneği, gen terapisi için ideal bir hedeftir. Mesane kanseri, gen terapisi için araştırılmıştır Viral vektörler bir onkolitik herpes simpleks virüsü 25, retrovirüs 26, canarypox virüsü 27, vaccinia virüsü, AAV ve adenoviru içerir28 s. Bizim protokolünün ikinci bölümünde, tümör hücrelerinin damlatılmasını hemen hemen aynıdır viral gönderim için bir yöntem tarif eder. Laboratuarımızda ilgi bir lusiferaz transgenini ifade adenoviral bir vektör ile biyolüminesensin yoluyla değerlendirmek gen teslimi için yeni yaklaşımların geliştirilmesi olduğunu. Bununla birlikte, mesane metodoloji kateterizasyon çeşitli maddelerin verilmesi için kullanılan ve bu nedenle geniş bir uygulama alanına sahip olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hayvanları içeren tüm prosedürleri gözden geçirilmiş ve Güney Carolina Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Protokol ağrısı için USDA kategori D altında kabul edildi.

1.. Hücre İmplantasyonu

  1. İki gün yordamı gerçekleştirmeden önce, T-25 şişeler içine 1 x 10 6 MB49 hücreleri plaka. (Arzu edildiği takdirde, ve antibiyotikler),% 10 FBS ile desteklenmiş yüksek glukoz DMEM kullanın. Bir şişe, anestezi uygulandı ve paralel olarak implante edilecek olan, beşe kadar her fare grubu için yeterlidir.
  2. Prosedürün gününde, steril DMEM taban ortamı (1:02 seyreltme) ile% 0.125 ile% 0.25 'lik steril doku kültürü dereceli tripsin seyreltilerek damlatma tripsin için hazırlar. 1,2 mi, 10 fareden için yeterlidir. Dengelenmeye bir 37 ° C su banyosu içine koyun.
  3. Bir ısıtma yastığı Prewarm ve i sunmak için kullanılacak anestezi sisteminin nosecones altında konumlandırmaksoflurane. Isıtma pedi üzerine temiz emici bir yastık yerleştirin.
  4. Anestezi sistemi indüksiyon odasına fareler yerleştirin ve% 3 izofluran ile anestezi neden. Fareler ayak tutam refleks kaybı ile doğrulanır bilincini kaybetmiş olduğunda, nosecones aktarabilirsiniz. Her bir hayvan sırt üstü yatırıldı ve düzgün vücut ısısını korumak için ısıtma pedi üzerine yerleştirilmiş emin olun.
  5. Anesteziyi korumak için% 2 izofluran konsantrasyonu azaltır.
  6. Kurumasını önlemek için her iki gözünde oftalmik merhem uygulayın.
  7. İsteğe bağlı adım: karın saç çıkarın. In vivo bioluminescent görüntüleme yapılacaksa alt karın Saç kaldırılması gerekir.
    1. Dış genital temas etmemesine özen, karın kürk meydanında en düşük 1 gibi Veet tüy dökücü krem ​​gibi cömert bir tabaka uygulayın. 3 dakika bekleyin.
    2. Kuru bir sünger ile bölgeyi ovularak saç çıkarın ve sonra cildi temizlemek için nemli bir sünger kullanın. Gerekirse, bir kez tekrarlayın.
  8. Idrar sondası
    1. Böyle KY gibi bir tahriş edici yağlama jeli ile yeni, steril 24 G pediatrik venöz kateter yağlayın. Çıkarın ve iğneyi atın. Kateter çevresinde sıvı sızıntı ortak bir sorun, yani değilse. Daha büyük sondaj kateter (20 G) kullanılabilir, daha sık on fareden bir daha meydana gelir. Bu 8 haftadan daha eski farelerde önemli bir husus olabilir.
    2. Kateterin hub tutarak, fare arka bacakları yaymak ve üretral meatus maruz senin karşısında elinizin baş ve işaret parmağınızı kullanın. Yavaşça tam olarak eklemek için tezgah ile bir paralel açısını değiştirerek, bir 45 ° açıyla üretra içine kateter yerleştirin.
    3. Tam yerleştirildikten sonra, bu tezgah paralel tutarak, yavaşça kateter kaldırın ve görsel bunun altında üretra değil vajina, yerleştirilir onaylamak. Doğru girdiyseniz, kateter olmak mümkün olacakvajina üretranın daha kısa olduğundan tam takılmamışsa.
    4. % 1 izofluran konsantrasyonu azaltır.
  9. Bir P200 pipet için bir ipucu takın ve kateterin dış ucuna emme uygulanması ile mesaneden idrar çıkarın. Kateter göbeğinden kalan idrar çıkarın. Idrar atın ve yerine kateter bırakın.
  10. Hava kabarcıkları dikkatle kaçınarak kateterin hub'a 80 ul% 0.125 tripsin solüsyonu pipetle. Kateter hub için 1 ml hava doldurulmuş şırınga takın ve yavaş yavaş mesane içine tripsin teslim pistonu 0.1-0.2 ml basınız.
  11. 15 dakika boyunca yerinde şırınga ve kateter tertibatını bırakın. Tekrar kalan anestezi farelerin herhangi bir (en fazla 4) için 1,8-1,11 adımları. Bekleme süresinde bir sonraki adıma geçin. İPUCU: Başlangıçta başkası hücreleri (adım 1.12) hazırlamak için yararlı olabilir.
  12. Implantasyon için MB49 hücreleri hazırlayın. Hücreler, T-2 başına 1 x 10 6 plakalanmıştır5 şişesi 48 saat implantasyon öncesi (1.1 adım).
    1. Ortamı çıkarın ve şişeye% 0.25 tripsin 500 ul ekleyin. Hücreler tekrar süspansiyon tam DMEM'de 5 ml ekleyin ayırmak zaman. Saymak için bir 50 ul bir kısım çıkarın ve 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüj kalan. Santrifüj adımı esnasında adımları 1.12.2 ve 1.12.3 devam etmektedir.
    2. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Hücre / ml hesaplanır. Daha sonra 4 x 10 6 hücre / ml (50 ul başına 2 x 10 5 hücre) üzere hücre pelleti getirmek için gerekli olan hacmi hesaplamak.
    3. Santrifüj hücrelerden süpernatant dökün ve (aşama 1.12.2 hesaplanan) 4 x 10 6 hücre / ml 'ye hücrelerin süspansiyonu için gerekli olan hacmi kullanılarak DMEM baz ortamında pelletini. Oda sıcaklığında hücrelere tutun.
  13. Mesane tripsin tedavisi için 15 dakikalık bir zaman noktası ulaşıldığında, kateter yerinde bırakarak kateterden hava doldurulmuş şırınga çıkarın. Geçirilen tripsin Normal olacakly kateter yoluyla geri dışarı akar. Yukarıdaki adımda 1.9 olarak P200 pipet ile emme ile mesane kalan tripsin çıkarın ve atın.
  14. Hemen sondanın merkezi haline MB49 hücre süspansiyonu, 50 ul pipetle. Kateterin göbeğine 1 ml hava ile dolu şırınga takın ve pistonu yavaşça 0.1-0.2 ml basarak mesane hücreleri sağlar. Beş fareler implant dört ek kez bu adım yukarı tekrarlayın. Herhangi kullanılmayan hücreleri atın.
  15. Yerine kateter şırınga bırakarak, hücreler, 50 dakika için idrar torbasında yaşamak için izin verir.
  16. Yavaşça üretradan kateter-şınnganın çekilme. Sıfıra izofluran konsantrasyonu döndürün ve her fareye bir santim uzakta ısıtma yastığı kurtarmak için roket ucu konisi veya iki hareket.
  17. Bir Fare, doğrulma refleksini kazanmış zaman, kendi kafesine geri.

2. (8 Gün Hücreleri İmplantasyonunda sonra) Adenovirüs intravezikal teslim DİKKAT: protokolünün bu bölümü bulaşıcı bir ajan adenovirüs, kullanır ve sıkı BSL2 kurallar altında ele alınmalıdır (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/).

Enfeksiyöz ajanlar ile gerçekleştirilen tüm işlemler South Carolina Tıp Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Kurulu tarafından kabul edildi.

  1. Sekiz gün MB49 hücreleri farelere implante sonra, hematüri için kontrol edin. Emici beyaz bir kâğıt parçası üzerinde bireysel hayvanları Pick up ve yavaşça kağıt üzerine idrarın damla leke için karın üzerine basın. Kırmızıya pembe İdrar hematüri gösterir ve tümörler kurduk bir işaretidir. Tümör alım oranı, en az% 80 olduğu ve mükemmel bir teknik ile% 100 kadar yüksek olabilir.
  2. Buz üzerinde adenoviral stok çözülme ve steril, oda sıcaklığında PBS içinde 10 9 PFU/50 ul (2 x 10 10 PFU / ml) seyreltin.
  3. Yukarıdaki adımlar, 1,3-1,6 tarif edildiği gibi fareler anestezi.
  4. Adımda 1.8 'de tarif edildiği gibi fare sondası ve aşama 1.9 olarak idrar kaldırma
  5. Idrar kaldırıldıktan sonra hemen kateterin hub'a virüs süspansiyonu 50 ul pipetle. Kateterin göbeğine 1 ml hava ile dolu şırınga takın ve pistonu yavaşça 0.1-0.2 ml basarak mesane virüsü sağlar.
  6. Yerine kateter şırınga bırakarak, virüs 40 dakika için idrar torbasında yaşamak için izin verir.
  7. Yavaşça üretradan kateter şırınga geri ve herhangi bir geri kalan virüs etkisiz hale getirmek için% 10 çamaşır suyu solüsyonu içine atın.
  8. Sıfıra izofluran konsantrasyonu döndürün ve her fareye bir santim uzakta ısıtma yastığı kurtarmak için roket ucu konisi veya iki hareket.
  9. Bir Fare, doğrulma refleksini kazanmış zaman, kendi kafesine geri.
  10. Fareler belirtmek için Mark kafesleri adenovirüs ile telkin edilmiştir. Virüs birkaç gün boyunca kafes yatak içine dökülecek ve tüm kafesleri ve yatak olmalıdırele ve uygun dezenfekte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hematüri 200,000 MB49 hücrelerinin implantasyonundan sonra 8 gün içinde hemen hemen bütün farelerde gözlenmiştir. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, 34.7 ± 3.3 mg, iki katına göre, mesane ağırlık (aralık 31-37 mg, n = 4) nontumor 87.5 ± 19.2 mg taşıyan farelerin (aralık 77-120 mg, n = 10)' in farelerde bu MB49 hücreleri ile implante edilmiştir. Gen teslimat açısından, biz farelere 24 saat görüntüleme viral instillasyonun 48 saat (Şekil 2) sonra daha güçlü bir sinyal verir sonra bulundu. Adenoviral teslim istatistiki amaçlar için grup büyüklüğü planlanırken dikkate alınması (Şekil 2 ve 3) olmalıdır hayvanlar arasında oldukça değişkendir. Küçük bir hayvan görüntüleme sistemi içinde mevcut değilse lusiferaz transjenin ekspresyonunu ölçmek için alternatif bir yaklaşım kaldırmak ve in vitro analiz için mesane homojenize etmektir. IVIS200 küçük hayvan syste kullanarak in vivo analizi karşılaştırılmasıSteady-Glo kiti kullanılarak m ve in vitro analiz, veri kümeleri arasında iyi bir korelasyon (Şekil 3) göstermektedir.

Şekil 1
Tümör yükü. Nontumor ağırlığı (n = 4) 9 gün 200,000 MB49 hücre uygulamasından sonra ve tümör taşıyan (n = 10), fare keseleri Şekil 1.. Analizi. İstatistiksel anlamlılık Graphpad yazılımını kullanarak Student t-testi ile belirlenmiştir. * P = 0.0002. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Gen ekspresyon Şekil 2.. In vivo analizi. 9 PFU AdCMV.Luc (+). Lusiferaz görselleştirmek için, fareler 200 ug lusiferin / fare karın içinden enjekte edilmiştir. Lusiferaz Transgenin İfade IVIS200 küçük hayvan görüntüleme sistemi kullanılarak in vivo ölçüldü. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. In vivo görüntüleme ve küçük bir hayvan, bir in vitro deneyi ile bio-elde edilen sinyallerin karşılaştırılması. Yirmi dört saat virüs depolama tampon maddesi (açık daireler) ya da 10 x 1 9 PFU AdCMV.Luc (kapalı daireler) teslim edilmesinden sonra, fareler IVIS200 ile görüntülenmiş ve daha sonra sacrificed. Mesaneler ve Steady-Glo kiti kullanılarak biyolüminesans sinyalin in vitro analizi için homojenize edilmiştir. Her iki yöntemle elde edilen lüsiferaz rasgele sinyal birimi (AU) olarak ifade edilir. Belirlenmesi (R 2) katsayısı, Microsoft Excel Veri Analizi eklenti ile hesaplandı. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

GAG tabakaya Insult Hücreler implante Alıkonma süresi Tümör algılama ve Kalkınma referans
Elektrokoter 0.01-1 10 x 5 MB49 Hematüri: 1.000 hücreleri: 0/0; 10.000 hücre: 4/6; 100.000 hücre: 6/6 Tümörler: 1.000 hücreleri: 0/6; 10.000 ya da daha fazla hücre: 6/6, 6/6 (% 100) 5
Electrocautery 5 x 10 4 MB49-Luc Tümör sıklığı:% 90 (referans 11'deki gibi) 6
Elektrokoter 1 x 10 5 MB49 ~ 3 saat Tümör insidansı:% 90 50 günde 7
Elektrokoter 1 x 10 5 MB49-PSA PSA: 4 gün kadar erken implantasyon sonrası olarak algılanabilir 8
Elektrokoter 1 x 10 5 MB49 Tümör insidansı:% 90 9
Elektrokoter 5 x 10 4 MB49 2 saat Tümör insidansı:% 83.3 (10/12) ve 21 günlük 10
Elektrokoter 2 x 10 4 MB49 2 saat Tümör sıklığı: Her gün 28 ile% 100 11
Elektrokoter 1-5 x 10 4 MB49 3 saat Hematüri: 16. günde% 100; Tümör insidansı:% 100 12
Elektrokoter 1 x 10 5 MB49 3 saat Tümör insidansı:% 97.3 (73/75) 13
PLL (100ul 0.01% 20 dk) 1 x 10 5 MB49-PSA 2 saat Tümör insidansı:% 100 15
PLL (0.1 mg / ml) 1 x 10 5 MB49-PSA 2 saat Tümör insidansı:% 100 16
PLL (100 ul 0.1 mg / ml 20 dakika) 1 x 10 5 MB49 1 saat Tümör insidansı:% 94 (15/16) 17
PLL (0.1 mg / ml) 1 x 10 6 MB49 7. günde hematüri: 14. günde% 50,% 100 18
PLL (100 ul 0.1 ug / ml 20 dakika) ya da% 22 etanol 1 x 10 5 MB49 1 saat Tümör insidansı: Modifikasyonlaştırılmamış mesane:% 0, PLL:% 80-100; Etanol% 40-80 19
Gümüş nitrat (5 ul 0.2 M) 1 x 10 6 MB49 1 saat Tümör insidansı:% 100 20
Gümüş nitrat (10 0.15 M 10 sn ul) 5 x 10 5 MB49 Tümör insidansı:% 92 (46/50) 21
Gümüş nitrat (8 ul 1 M 10 sn) 5 x 10 5 MB49 2 saat Hematüri: 7. günde% 100; gün hematüri% 100; Tümör insidansı:% 96.7 (29/30 fare), 15 günde 22
Gümüş nitrat 5 ul 0.2 M 6 x 10 MB49-PSA 0.5-2 1 saat PSA tespit 23
HCI (100 ul 0.1 M 15 sn) 1 x 10 6 MB49 1 saat 24

Tablo 1. MB49 hücrelerinin ortotopik implantasyonu takiben Tümör algılama ve geliştirme. Farklı fiziksel ve kimyasal hakaretler MB49 hücrelerinin intravezikal büyümesini kolaylaştırmak için GAG tabakasının bozulması için kullanılmıştır. Deneysel koşullar ve MB49 orthotopik modelini kullanarak önceki çalışmalardan elde edilen sonuçlar özetlenmiştir. Mümkün olduğunda, ilk sütunda parantez içinde bilgi hacmi, konsantrasyon, ve maddenin temas süresi GAG tabakasının kimyasal bozma için kullanılan içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol açıklanan birincil metodoloji hücrelerin damlatılması veya mesane epiteline yerel teslimat için tasarlanmış herhangi bir ajan için geniş uygulamalara sahip fare mesane kateterizasyonu, olduğunu. Yukarıda özetlenen spesifik protokol kısa süreli çalışmalarda (~ 10 gün) için optimize edilmiştir. Daha yüksek bir hücre sayısı nedeniyle tümör yükü için daha hızlı tümör büyümesi ve olasılıkla hayvanların kaybına neden çünkü hücrelerin implante doğru sayısı, kritik öneme sahiptir. Damlatma için 200,000 MB49 hücreleri kullanılarak aşırı tümör yükü için gün 14 olduğunda hayvanların% 25 kadar ötenazi gerektirebilir. Bizim tecrübelerimize göre, fareler olumsuz 12 gün içinde tümör yükü etkilenmez. Böyle uyuşukluk, kötü bakım ve / veya bu modelde iştah aşırı tümör yükü kaybı gibi standart kriterlere ek olarak idrara çıkma yetersizlik ile kanıtlanır.

Bu protokol için önemli bir husustur lojistik. İlk olarak, MB49 hücreler büyümek rapidliki gün implantasyondan önce y ve kaplama bir milyon hücre instilasyon gününde log fazında optimum kültürleri verecektir. Bir deney için gerekli hayvan sayısı bir gün implante edilebilir hayvanların sayısını aşarsa, MB49 kültürler kültürlerin büyümeyi engellemek için (çok sayıda günlerde) buna göre ayarlanması gerekecektir. Tekniği mükemmel olmuştur kadar İkincisi, kullanıcılar, hayvanların küçük bir grup ile çalışması gerekir. Deneyimli kullanıcılar bir asistan (bekleme süreleri dahil 1.5 saat / grup) olmadan bir gün içinde 5 farelerin 6 gruplarını her implant mümkün olacak. Ancak, başlangıçta bir asistan damlatılması için hücreleri hazırlamak ve saymak için yararlıdır. Son olarak, ekipmanın yeri önemlidir. İdeal biyogüvenlik kabini ve anestezi cihazları aynı odada bulunmaktadır.

Bir potansiyel sınırlama anestezi ekipman bekleme süresi sırasında kullanımda olan 5 nosecones sahip olmasıdır. Farelerin sayıda rutin olarak implante edilir ise, seVeral bu tür sistemler paralel olarak kullanılabilir. Teorik olarak, anestezi için diğer yöntemler de kullanılabilir. Ancak, inhalasyon izofluran anestezi bir yarar kalma süresi kontrol edilebilir olmasıdır.

Kateterizasyon tekniği hakim sonra, bu protokol, deney koşullarında bir dizi uygulanabilir. Potansiyel orthotopically büyümesi için temel mesane tümörleri elde edilen yeni mesane kanseri hücre çizgileri veya hücre değerlendirilebilir. Bundan başka, tümör almak için gerekli olan eşik miktarını belirlemek için farklı hücre sayıları implante etmek mümkündür. Tümör büyüme hızları da kurulabilir. Karşılaştırmalar tümör kuruluş veya büyüme oranı faiz genin etkisini belirlemek için genetik olarak değiştirilmiş hücreler arasında yapılırsa bu varyasyonlar, özellikle faydalı olabilir. Yapışma, büyüme oranı, ya da tümör almak izlenmesi için, hücreler, lusiferaz 6 gibi bir raportör gen ile birlikte transfekte edilebilir. Bununla birlikte, önemli considerasyon biyoışıldama sinyali 29 hipoksi ve nekroz etkisidir. Kateterizasyon da tedavi edici bir maddeyi sunmak için de kullanılabilir. Biz şu anda bir in vivo ortamda gen teslim stratejileri değerlendirmek için kadavradan modelini kullanıyor. Bu model terapötiklerin teslim optimize etmek ve tümör gerilemesi ve sağkalım üzerindeki etkisini belirlemek için yararlı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Name of reagent

Company

Catalog number

Comments

6-8 week old female mice

Jackson Laboratories

Strain Name: C57BL/6J

Stock Number: 000664

Trypsin*

MediaTech

MT25-053-CI

Obtained through Fisher

DMEM*

MediaTech

MT10-017-CV

Obtained through Fisher

FBS

Hyclone

SH30071.03

Heat-inactivated

T25 flasks*

Corning Costar

Corning No.:3056

Fisher: 07-200-63

Obtained through Fisher

MB49 cells

N/A

N/A

Obtained from Dr. Boehle (see reference11)

Puralube Vet Ointment*

Pharmaderm

Henry Schein Company

No.:036090-6050059

Fisher: NC9676869

Obtained through Fisher

Depilatory cream: Veet

local pharmacy

Lubricant:

K-Y Jelly

local pharmacy

Catheters*

Exel International

Exel International

No.:26751;

Fisher: 14-841-21

Obtained through Fisher

Isoflurane

Terrell

NDC 66794-011-25

Obtained though hospital pharmacy

1 ml slip tip TB syringes

Becton Dickinson

BD309659

Fisher:14-823-434

D-Luciferin

Gold Biotechnologies

L-123-1

Ad-CMV-Luc

VectorBiolabs

1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use

Infectious agent that requires BSL2 containment

Steady-Glo Luciferase Assay System

Promega

E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml)

*available through multiple vendors

EQUIPMENT

Anesthesia system

E-Z Systems, Euthanex Corporation

Anesthesia system: EZ7000

5-port mouse rebreathing device: EZ109

Obtained through Fisher

Xenogen IVIS 200

Caliper Life Sciences

http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm

FLUOstar Optima

BMG Labtech

http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer. J. Clin. 62, (1), 10-29 (2012).
  2. Seager, C. M., Puzio-Kuter, A. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Cancer Prev. Res. 2, (12), 1008-1014 (2009).
  3. Chodak, G. W., Shing, Y., Borge, M., Judge, S. M., Klagsbrun, M. Presence of heparin binding growth factor in mouse bladder tumors and urine from mice with bladder cancer. Cancer Res. 46, (11), 5507-5510 (1986).
  4. De Boer, E. C., Teppema, J. S., Steerenberg, P. A., De Jong, W. H. Retrovirus type C in the mouse bladder carcinoma cell line MBT-2. J. Urol. 163, (6), 1999-2001 (2000).
  5. Lodillinsky, C., Rodriguez, V., et al. Novel invasive orthotopic bladder cancer model with high cathepsin B activity resembling human bladder cancer. J. Urol. 182, (2), 749-755 (2009).
  6. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, (1), 120-124 (2008).
  7. Brocks, C. P., Buttner, H., Bohle, A. Inhibition of tumor implantation by intravesical gemcitabine in a murine model of superficial bladder cancer. J. Urol. 174, (3), 1115-1118 (2005).
  8. Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin. Cancer Res. 10, (20), 6977-6984 (2004).
  9. Wu, Q., Mahendran, R., Esuvaranathan, K. Nonviral cytokine gene therapy on an orthotopic bladder cancer model. Clin. Cancer Res. 9, (12), 4522-4528 (2003).
  10. Bonfil, R. D., Russo, D. M., Binda, M. M., Delgado, F. M., Vincenti, M. Higher antitumor activity of vinflunine than vinorelbine against an orthotopic murine model of transitional cell carcinoma of the bladder. Urol. Oncol. 7, (4), 159-166 (2002).
  11. Bohle, A., Jurczok, A., et al. Inhibition of bladder carcinoma cell adhesion by oligopeptide combinations in vitro and in. 167, (1), 357-363 (2002).
  12. Gunther, J. H., Jurczok, A., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, (12), 2834-2837 (1999).
  13. Gunther, J. H., Frambach, M., et al. Effects of acetylic salicylic acid and pentoxifylline on the efficacy of intravesical BCG therapy in orthotopic murine bladder cancer (MB49). J. Urol. 161, (5), 1702-1706 (1999).
  14. Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. J Vis Exp. (48), (2011).
  15. Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and microenvironment modification during progression of murine orthotopic bladder cancer. Clin. Dev. Immunol. 2011, 865684 (2011).
  16. Seow, S. W., Cai, S., et al. Lactobacillus rhamnosus GG induces tumor regression in mice bearing orthotopic bladder tumors. Cancer Sci. 101, (3), 751-758 (2009).
  17. Mangsbo, S. M., Ninalga, C., Essand, M., Loskog, A., Totterman, T. H. CpG therapy is superior to BCG in an orthotopic bladder cancer model and generates CD4+ T-cell immunity. J. Immunother. 31, (1), 34-42 (2008).
  18. Loskog, A. S., Fransson, M. E., Totterman, T. T. AdCD40L gene therapy counteracts T regulatory cells and cures aggressive tumors in an orthotopic bladder cancer model. Clin. Cancer Res. 11, (24 Pt 1), 8816-8821 (2005).
  19. Loskog, A., Ninalga, C., et al. Optimization of the MB49 mouse bladder cancer model for adenoviral gene therapy. Lab Anim. 39, (4), 384-393 (2005).
  20. Bockholt, N. A., Knudson, M. J., et al. Anti-Interleukin-10R1 Monoclonal Antibody Enhances Bacillus Calmette-Guerin Induced T-Helper Type 1 Immune Responses and Antitumor Immunity in a Mouse Orthotopic Model of Bladder Cancer. J. Urol. 187, (6), 2228-2235 (2012).
  21. Watanabe, F. T., Chade, D. C., et al. Curcumin, but not Prima-1, decreased tumor cell proliferation in the syngeneic murine orthotopic bladder tumor model. Clinics. 66, (12), 2121-2124 (2011).
  22. Chade, D. C., Andrade, P. M., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int. Braz. J. Urol. 34, (2), 220-226 (2008).
  23. Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J. Urol. 172, 2414-2420 (2004).
  24. Zhang, Z., Xu, X., et al. The therapeutic potential of SA-sCD40L in the orthotopic model of superficial bladder cancer. Acta Oncol. 50, (7), 1111-1118 (2011).
  25. Kohno, S., Luo, C., et al. Herpes simplex virus type 1 mutant HF10 oncolytic viral therapy for bladder cancer. Urology. 66, (5), 1116-1121 (2005).
  26. Kikuchi, E., Menendez, S., et al. Highly efficient gene delivery for bladder cancers by intravesically administered replication-competent retroviral vectors. Clin. Cancer Res. 13, (15 Pt 1), 4511-4518 (2007).
  27. Siemens, D. R., Austin, J. C., See, W. A., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. Evaluation of gene transfer efficiency by viral vectors to murine bladder epithelium. J. Urol. 165, (2), 667-671 (2001).
  28. Siemens, D. R., Crist, S., Austin, J. C., Tartaglia, J., Ratliff, T. L. Comparison of viral vectors: gene transfer efficiency and tissue specificity in a bladder cancer model. J. Urol. 170, (3), 979-984 (2003).
  29. Black, P. C., Shetty, A., et al. Validating bladder cancer xenograft bioluminescence with magnetic resonance imaging: the significance of hypoxia and necrosis. BJU Int. 106, (11), 1799-1804 (2010).
Gene Teslim Çalışmaları Ortotopik Mesane Kanseri Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies. J. Vis. Exp. (82), e50181, doi:10.3791/50181 (2013).More

Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies. J. Vis. Exp. (82), e50181, doi:10.3791/50181 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter