Summary
جعلت من الممكن Optogenetic تقنيات لدراسة الخلايا العصبية مساهمة محددة لسلوك. وصفنا أسلوب في الزرد اليرقات الخلايا العصبية الحسية الجسدية لتفعيل واحدة تعبر عن البديل channelrhodopsin (الشيف) مع ليزر (DPSS) الصمام الثنائي ضخ الحالة الصلبة وتسجيل السلوكيات أثار مع كاميرا فيديو عالية السرعة.
Abstract
الزرد اليرقات تظهر كنموذج لوصف وضع وظيفة الدارات العصبية البسيطة. بسبب التسميد الخارجية، التطور السريع، والشفافية، وبشكل خاص مناسبة الزرد لنهج optogenetic للتحقيق الوظيفة العصبية الدائرة. في هذا النهج، يتم التعبير عن القنوات الأيونية الحساسة للضوء في الخلايا العصبية المحددة، مما يتيح للمجرب لتنشيط أو تثبيط لهم في الإرادة، وبالتالي مساهمتها في تقييم سلوكيات معينة. تطبيق هذه الأساليب في الزرد اليرقات المفهوم بسيط ولكنه يتطلب الاستفادة المثلى من التفاصيل التقنية. نحن هنا يبرهن على وجود إجراءات التعبير عن البديل channelrhodopsin في الخلايا العصبية الحسية الجسدية اليرقات الزرد، الصور تفعيل الخلايا واحدة، وتسجيل السلوكيات الناتجة عن ذلك. من خلال إدخال بعض التعديلات على أساليب المحددة سابقا، يمكن أن تستخدم هذه الطريقة للحصول الاستجابات السلوكية واحدة من الخلايا العصبية تصل تنشيطعلى الأقل 4 أيام بعد الإخصاب (DPF). على وجه التحديد، أنشأنا التحوير باستخدام الخلايا العصبية الحسية الجسدية محسن، CREST3، لدفع التعبير عن المتغير channelrhodopsin الموسومة، الشيف، tdTomato. حقن هذا التحوير في الخلية 1-مرحلة الأجنة النتائج في التعبير في الخلايا العصبية الحسية الجسدية الفسيفساء، والتي يمكن تصويرها مع المجهري متحد البؤر. تحديد الخلايا في إلقاء الضوء على هذه الحيوانات مع ضوء ليزر من DPSS نانومتر 473، يسترشد من خلال كابل من الألياف البصرية، يثير السلوكيات التي يمكن تسجيلها مع كاميرا فيديو عالية السرعة وتحليلها كميا. يمكن تعديل هذا الأسلوب لدراسة السلوكيات التي تسببها تفعيل أي الخلايا العصبية الزرد. سوف يجمع هذا النهج مع الاضطرابات الوراثية أو الدوائية تكون وسيلة قوية للتحقيق في تشكيل الدوائر وظيفة.
Introduction
جعلت تطوير أساليب optogenetic لتعزيز أو تثبيط الخلايا العصبية مع استثارة موجات محددة من الضوء من الممكن دراسة وظيفة للسكان متميزة من الخلايا العصبية في الدارات العصبية السيطرة على السلوك 1، 19، 21. وغالبا ما تستخدم هذه التقنية لتفعيل مجموعات من الخلايا العصبية، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لتنشيط الخلايا العصبية الفردية. اليرقات الزرد هي أكثر ملاءمة لهذه الأساليب لأنها شفافة، الجهاز العصبي يتطور بسرعة، وخلق الحيوانات المعدلة وراثيا بسرعة والروتينية. ومع ذلك، لا بد من التغلب على العقبات الفنية الهامة لتحقيق موثوق واحد تفعيل الخلايا العصبية.
لتحسين إجراء لتفعيل optogenetic من الخلايا العصبية الزرد واحد، ركزنا على الخلايا العصبية الحسية الجسدية. اليرقات الزرد كشف مجموعة متنوعة من المحفزات الحسية الجسدية باستخدام اثنين من السكان من الخلايا العصبية: مثلث التوائم الخلايا العصبية، والتي يعصب رأسه، وحية Rohon-(RB) الخلايا العصبية، وهي عصب باقي الجسم. كل الخلايا العصبية والعصب الثلاثي التوائم RB مشاريع محور عصبي الطرفية التي الفروع على نطاق واسع في الجلد للكشف عن المنبهات ومحور عصبي المركزي الذي يتصل الدوائر العصبية المصب. الحيوانات تستجيب للمس في وقت مبكر الى 21 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، مشيرا إلى أن دوائر متماسكة الحسية الجسدية شكلت 5، 18. خلال نمو اليرقات على الأقل بعض الخلايا العصبية المشبك الثلاثي التوائم وعلى RB الخلية ماوتنر لتفعيل استجابات الهروب الكلاسيكي، ولكن تراكم الأدلة تشير إلى أن هناك فئات متعددة من الخلايا العصبية الحسية الجسدية مع أنماط مختلفة من الاتصال التي قد تثير اختلافات على سلوك الهروب 2، 4، 10 و 12 و 14 و 15 و 16 و 17. كان لدينا الدافع لتطوير هذه الطريقة لتوصيف وظيفة السلوكية لفئات مختلفة من الخلايا العصبية الحسية الجسدية، ولكن من حيث المبدأ يمكن أن تستخدم هذه الطريقة لدراسة وظيفة الخلايا العصبية من أي تقريبا أو السكان من الخلايا العصبية في لارفال الزرد.
دوغلاس وآخرون. سبق وصفها وسيلة لتفعيل Channelrhodopsin-2-معربا عن الخلايا العصبية الحسية الجسدية مع الضوء الأزرق، انتزاع السلوك هروب 3. تستخدم نهجها عنصر محسن من الجين isl1 لدفع التعبير عن ChR2-EYFP في الخلايا العصبية الحسية الجسدية. هذا التحوير، ومع ذلك، أفادت التقارير لعرض مضان ضعيفة نسبيا، وتتطلب المشاركة في حقن مراسل الثاني، UAS GFP ::، للسماح التصور من الخلايا معربا عن ChR2-EYFP. وقد استخدم هذا النهج الحصول على ردود السلوك بين 24-48 HPF، ولكن لا يمكن أبدا أن استثارة رد فعل الماضي 72 HPF. وهكذا، في حين أن هذا الأسلوب يعمل لدراسة الدوائر العصبية في مراحل اليرقات في وقت مبكر جدا (24-48 HPF)، فإنه غير كاف لوصف الدوائر العصبية واستجابات سلوكية لدى كبار السن اليرقات، عند أكثر الاستجابات السلوكية المتنوعة واضحة والدوائر العصبية هي أكثر نضجا.
سعينا إلىتحسين حساسية هذه التقنية من أجل تميز وظيفة الخلايا العصبية مجموعات سكانية فرعية RB اليرقات. لتحسين التعبير استخدمنا محسن الحسية الجسدية الخاصة (CREST3) 20 لطرد التعبير عن وبه lexa-VP16 امتداد تسلسل المشغل به lexa (4xLexAop) 11 لتضخيم التعبير عن قناة ضوء تنشيط الموسومة fluorescently. هذا التكوين تضخيم التعبير عن القناة، مما يلغي الحاجة لمشاركتها في التعبير عن مراسل الثاني والسماح لنا مباشرة لتحديد الوفرة النسبية للقناة في كل الخلايا العصبية. باستخدام تسلسل به lexa / LexAop كان ميزة إضافية تتمثل في السماح لنا لتقديم التحوير إلى خطوط مراسل الزرد التي تستخدم نظام Gal4/UAS. أدى هذا التعبير عابرة التحوير في مستويات مختلفة من التعبير، ولكن عادة ما كان قويا بما يكفي لتصور كل من جسم الخلية والتوقعات من الخلايا العصبية محواري الفردية على مدى عدة أيام. لتحسين sensitivإيتي إلى النور استخدمنا ضوء تنشيط قناة الشيف، وهو البديل channelrhodopsin يتألف من الوهم من channelopsin-1 (Chop1) وchannelopsin-2 (Chop2) مع موقع كروس في حلقة الحلزون EF 13. يتم تنشيط هذه القناة في نفس الطول الموجي ChR2، ولكنها تتطلب كثافة أقل للتنشيط ضوء، مما يجعلها أكثر حساسية من غيرها من القنوات شائعة الاستخدام، بما في ذلك ChR2. وتنصهر البروتين الشيف لبروتين فلوري الأحمر، tdTomato، مما يمكننا من فحص للتعبير البروتين دون تنشيط القناة. كمصدر الضوء، كنا الصمام الثنائي ضخ الحالة الصلبة (DPSS) الليزر بالإضافة إلى كابل من الألياف البصرية لتقديم دقة، عالية القدرة نبض أزرق خفيف إلى منطقة محددة من اليرقات. هذا سمح لنا للتركيز ضوء الليزر على الخلايا العصبية الفردية، مما يلغي الحاجة لإيجاد الحيوانات المعدلة وراثيا نادرة معربا عن الخلايا العصبيه في قناة واحدة. باستخدام هذا النهج، كنا قادرين على تنشيط الخلايا العصبية RB واحدة، دون الإجابة السلوكيةق مع كاميرا الفيديو عالية السرعة، والصورة الخلايا العصبية المنشط بدقة عالية مع المجهري متحد البؤر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
إعداد ما يلي في وقت مبكر.
1. إعداد كابل الألياف البصرية
- إنشاء وحدة التخزين للكابلات الالياف بواسطة ذوبان الرقبة مدبب من ماصة باستور الزجاج أكثر من موقد بنزن لخلق زاوية ° ~ 150.
- باستخدام قطع الأسلاك أو شفرة حلاقة، وقطع بعناية الكابلات البصرية إلى قطعتين. ينبغي لكل قطعة واحدة مع نهاية FC / PC ومحول أحد طرفي عرضة للخطر. تخزين قطعة واحدة كما كبل احتياطي.
- تجريد الكابل البصري وصولا الى الكسوة عن طريق إزالة سترة الألياف والألياف تعزيز (الشكل 1A) من 5.0 سم من نهاية قطع من الكابل.
- إدراج كابلات الالياف إلى ماصة باستور المعدة. تأكد من الكابل يمكن ان تتحرك بسهولة ويخرجون من طرف ماصة.
- مع الكابل البصري جاحظ من طرف ماصة باستور، وقطع بعناية وإزالة الألياف الكسوة من جميع أنحاء الألياف الزجاجية، ~ 2 مم من نهاية القطع.
- باستخدام القلم الماس / الزجاج القاطع، نيك الألياف الزجاجية وكسر سوما يليها نهاية لإنشاء قطع نظيفة / سطح في نهاية الألياف (1B الشكل).
- سحب الكابلات البصرية إلى ماصة باستور للتخزين. كرر الخطوة (1.6) إذا كان يحصل على نقطة وغيض من الألياف البصرية أو فواصل بشكل غير متساو.
- الكابل البصري في موقف ماصة باستور باستخدام مياداة مجهرية (الشكل 1C).
الإجراءات 2-8 تصف طريقة لحقن الجينات المحورة في الأجنة المطبقة عادة على التجارب الزرد كثيرة. الاختلافات على هذا الأسلوب، مثل تلك الموضحة في الفيديو إن الرب الأخرى 6، 7، 8، 9، 22 هي نفس القدر من الفعالية.
2. سحب حقن الإبر
- باستخدام إبرة مجتذب، وسحب أنابيب الزجاج البورسليكات في الإبر حقن اثنين مع تلميح مدبب تدريجيا. سوف الإعدادات مجتذب تختلف. (على إبرة سوتر الآلات التي نستخدمها مجتذب إعدادات: P = 500، الحرارة = 720، سحب = 50، السرعة والوقت = 70 = 150). كل إبرة مجتذب هو مختلف، حتى تحسين إعدادات مجتذب مpirically. لمزيد من الإبر مدبب، وزيادة الحرارة و / أو سحب. لإبر أقل مدبب، وزيادة الوقت و / أو سحب انخفاض.
- الإبر في وعاء تخزين آمنة (أي طبق بتري مع الشريط توالت لاصقة من جانب).
3. صب قوالب حقن
- تذوب 0.5 غ الاغاروز في الجنين مل 30 / المياه الزرقاء، حتى أنه قد حلت تماما الاغاروز.
- تصب في النصف السفلي من طبق بيتري.
- وضع قالب مستطيل مع تصاعد الآبار (الشكل 2) في الاغاروز، والحرص على تشكيل للحد من فقاعة حول الآبار.
- السماح لترسيخ الاغاروز.
- إزالة العفن وملء طبق بتري مع الأزرق / المياه الجنين.
- تخزين تستقيم، مليئة المياه النظيفة، في درجة حرارة الغرفة لاستخدام نفس اليوم أو في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل.
4. جعل البلازميد الحمض النووي لحقن مزيج
- تمييع DNA البلازميد إلى تركيز من 50 نانوغرام / ميكرولتر مع أحمر الفينول 1:10 في DDH 2 O. إلىعلى سبيل المثال:
1.0 مل بلازميد الحمض النووي (250 نانوغرام / مل) 0.5 مل الفينول الأحمر 3،5 مل DDH 2 O - يمكن أن تظل مزيج DNA في درجة حرارة الغرفة في حالة استخدام فورا أو تخزينها في C ° 4 لعدة أيام.
5. إعداد أزواج التزاوج
وينبغي أن يتم هذا المساء قبل كنت تخطط للقيام الحقن.
- ملء خزانات المياه مع نظام التربية ومكان الأسماك الذكور والإناث معا. إذا لم يكن يتم تنفيذ الحقن بمجرد تشغيل أضواء في منشأة منفصلة الأسماك الذكور والإناث مع مقسم.
6. (يمكن القيام أثناء انتظار الأجنة) الاستعداد للحقن
- بدوره على الضغط حاقن تلاعب. تأكد من تعيين النظام إلى النبض. تبدأ مع مجموعة PULSE DURATION إلى 1.
- بدوره على صمام الهواء وضبط ضغط حاقن لPSI 20 ~.
- باستخدام نطاق تشريح على أعلى التكبير، وكسر غيض من إبرة مع ملقط أو لعبة البوكر لخلق ~ افتتاح ميكرومتر 2 (الشكل 3، فيلم 1).
- ملء مع الإبر مزيج من DNA: 1. وضع الجانب إبرة غيض، وحتى، في مزيج الحمض النووي والسماح للإبرة ملء من عمل شعري أو 2. باستخدام تلميح طويلة تصل إلى 1-2 ماصة ميكرولتر من الحمض النووي مزيج مباشرة في الإبرة.
- شغل الإبرة مكان في مكان آمن حتى جاهزة للحقن.
7. جمع الأجنة
- بعد أضواء مرفق تم تشغيل، وإزالة فواصل (إن وجد). جمع الأجنة مع مصفاة / غربال الصغيرة ونقلها إلى طبق بتري مع الأزرق الطازجة / المياه الجنين.
8. حقن الأجنة في مرحلة الخلية 1-2
- نقل الأجنة إلى حصاد قوالب حقن البلاستيك باستخدام ماصة.
- باستخدام مجهر تشريح، ودفع برفق الأجنة فيالآبار مع ملقط أو لعبة البوكر حادة (الشكل 4، فيلم 2).
- وضع الإبرة المحملة إلى مياداة مجهرية وموقف أكثر الأجنة.
- معايرة حجم الحقن عن طريق ضبط مدة PULSE في الخطوة 1-زيادات حتى تحصل على الصوت المطلوب (~ 1 NL). يمكن معايرة ذلك مع شريحة ميكرون، كما هو موضح في الفيديو لإن الرب السابق 8 و 22، ولكن لهذه الدقة التجربة ليست ضرورية، لأن مجموعة واسعة من حجم الضخ سيؤدي إلى التعبير الملائم.
- حقن مزيج 1 ~ NL DNA في الخلية مباشرة وتكرار لجميع الأجنة. ويمكن أيضا أن DNA حقنها في صفار، ولكن هذا يميل إلى أن يكون أقل كفاءة (الشكل 5، الفيلم 3).
- إزالة الأجنة المحقونة من العفن باستخدام تيار لطيف من اللون الأزرق / المياه الجنين.
- متجر حقن الأجنة في C ° 28،5 في الظلام.
- إزالة غير مخصبة، أجنة ميتة أو التالفة بشكل دوري.
- علاج الأجنة وايال PTU بين 18-24 HPF لمنع تصبغ.
9. الشاشة للتعبير التحوير
- dechorionate يدويا باستخدام HPF 24-48 الأجنة ملقط.
- تخدير اليرقات باستخدام 0.02٪ tricaine.
- باستخدام المجهر الفلورسنت تشريح وتحديد اليرقات أو مثلث التوائم مع RB التعبير الخلايا العصبية ونقل هذه إلى طبق جديد مع المياه العذبة الزرقاء / PTU الجنين. الأجنة مع التعبير متفرق في الخلايا يسهل التعرف عليها هي الأمثل، ولكن سيتم استهداف الخلايا العصبية الفردية للتنشيط مع كابل من الألياف البصرية لذلك مجموعة واسعة من كثافة التعبير مقبولة.
- الأجنة في متجر 28.5 ° C في الظلام حتى المرحلة التجريبية المطلوبة.
10. تحميل ليرقات التجارب السلوك
- جعل منخفضة 1.5٪ الاغاروز ذوبان في DDH 2 O وتخزينها في كتلة الحرارة ° 42 C لمنعها من التصلب.
- باستخدام ماصة باستور الزجاج، ونقل اليرقات واحدة من فرزهم في حوض(ه) من 1.5٪ الاغاروز ذوبان منخفضة مع والمياه الزرقاء / الجنين أقل قدر ممكن.
- نقل اليرقات في قطرة من الاغاروز على طبق بتري الصغيرة.
- تحت المجهر تشريح يرقة الموقف، حتى الظهرية.
- وقد عززت عندما الاغاروز، وقطع بعيدا الاغاروز مع شفرة حلاقة رقيقة (# 11 مشرط)، وترك اسفين من أجار حول يرقة بأكمله.
- جعل اثنين تخفيضات قطري في جانبي صفار؛ الحرص على عدم نيك اليرقة.
- ملء المنطقة المحيطة الاغاروز مع الجنين / المياه الزرقاء.
- سحب الاغاروز بعيدا عن الجذع والذيل من يرقة (الشكل 6).
11. إعداد الكاميرا فائقة السرعة وبرامج التصوير
- تحميل كاميرا عالية السرعة على نطاق تشريح.
- توصيل الكاميرا إلى جهاز الكمبيوتر.
- بدوره على جهاز الكمبيوتر.
- تشغيل الكاميرا عالية السرعة.
- فتح الفيديو / برامج التصوير (نحن نستخدم AOS برامج التصوير وسوف يصف الإجراءات لاستخدامه هنا، ولكن التصوير الأخرىالبرنامج هو مقبول على حد سواء).
- ضبط إعدادات الكاميرا وفقا لذلك (أي 1000 لقطة في الثانية (في الثانية)، 50٪ العازلة الزناد أو إعدادات المفضل الأخرى).
- بدء التسجيل.
12. تنشيط الخلايا العصبية واحدة باستخدام الليزر نانومتر 473
- إرفاق مشجعا، والكابلات البصرية بالليزر.
- بدوره على تحفيز.
- تعيين مشجعا إلى حد أقصى من 5 فولت ومدة النبضة من 5 ميللي ثانية.
- بدوره على الليزر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- استخدام المجهر تشريح لوضع غيض من كابلات الالياف بالقرب من جسم الخلية العصبية مع وجود الشيف-tdTomato التعبير (الشكل 6).
- تقديم نبض الضوء الأزرق لتفعيل الخلايا العصبية الحسية.
- تعيين السلوك سجل باستخدام كاميرا عالية السرعة على 500 أو 1،000 لقطة في الثانية.
- تكرار التجربة على النحو المرغوب فيه، والانتظار 1 دقيقة بين كل تفعيل لتجنب التعود. (نسجل ما لا يقل عن ثلاث إجابات لكل الخلايا العصبية).
- إلىاليرقات الإفراج عنهم، وبصرف النظر نقب الاغاروز مع ملقط، مع الحرص على عدم إصابة الحيوان. يمكن أن يسمح هذا الحيوان لمواصلة تطوير ويمكن تكرار الإجراء في مرحلة قديمة لوصف تطور السلوك. ويمكن أيضا أن الجنين remounted عالية الدقة لتصوير مبائر للخلية المنشط لربط السلوك مع بنية الخلية، كما هو موضح أدناه.
- نقل اليرقة إلى لوحة زرقاء مع ثقافة جديدة / جنين المياه. نستخدم لوحة 24 أيضا لتتبع اليرقات الفردية.
13. صورة الخلية العصبية (ق) مع مجهر متحد البؤر
- تخدير اليرقات مع tricaine 0.02٪.
- جبل اليرقات، حتى الجانب الظهري، في ذوبان 1.2٪ الاغاروز منخفضة أو في قالب الظهرية.
- صورة الشيف-tdTomato الخلايا العصبية مع ليزر نانومتر 543 و تصفية مناسبة وموضوعية. نستخدم الهدف 20X.
- إزالة اليرقات من الاغاروز والعودة إلى الفرد بشكل جيد مع الأزرق / المياه الجنين.
- متجر 28.5 ° C في في الظلام لفوrther التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1. تعيين ما يصل كابلات الالياف. (A) من الطبقات كابل من الألياف البصرية. (B) كابلات الألياف البصرية في عاري ماصة باستور. (C) وضع كابلات الالياف البصرية في ماصة باستور باستخدام مياداة مجهرية.
الشكل 2. حقن القالب القالب.
الشكل 3. (الفيلم 1). كسر الإبرة.
الشكل 4. (الفيلم 2). وضع الأجنة في القالب حقن.
ther.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 5. (الفيلم 3). 1 مزيج حقن الحمض النووي في 1-NL خلية الجنين المرحلة.
الشكل 6. رسم توضيحي ليرقة الزرد والخلايا العصبية التي شنت ممثل المشاركين في استجابة اللمس اليرقات. وشنت جزئيا يرقات اسماك الزرد في 1.5٪ الاغاروز ذوبان منخفضة (ممثلة الخطوط المتقطعة المحيطة جزء منقاري من اليرقة). وصفت الخلايا العصبية A الثلاثي التوائم (في الرأس) والخلايا العصبيه Rohon-حية (في صندوق) باللون الأحمر. وترد الخلايا ماوتنر من الخطوط المتقطعة في يرقة. يظهر الكابل البصري (أبيض) وضعه فوق الخلية العصبية RB الجسم.
oad/50184/50184fig7.jpg "بديل =" الشكل 7 "FO: المحتوى العرض =" 5in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50184/50184fig7highres.jpg "/>
الشكل 7. (الفيلم 4). تفعيل لexpressingChEF واحد الخلايا العصبية RB يثير استجابة سلوكية. (A) لا يزال الإطارات تصور تفعيل الخلايا العصبيه واحدة معربا عن RB-الشيف tdTomato. تم تنشيط الخلايا العصبية واحدة من قبل نبض ميللي ثانية 5 من 473 نانومتر ليزر زرقاء عبر كابل الألياف ميكرومتر 200 البصري. تم تعيين قيادة الجهد الليزر الأزرق في أقصى 5 فولت. تم تسجيل السلوك الناتج في 1000 لقطة في الثانية بواسطة كاميرا عالية السرعة. (B) كان يستخدم متحد البؤر المجهري لصورة الخلايا العصبية RB المنشط. يظهر سهم في المنطقة حفز اللقطات السلوك. (C) إلى صورة مكبرة من الخلايا العصبية في RB (B). مقياس بار، و 100 ميكرومتر. (الفيلم 5 و 6) السمك نفسه، (الفيلم 5) تفعيل مثلث التوائم، (الفيلم 6) RB الخلايا العصبية أكثر من صفار التمديد.p_upload/50184/50184fig7large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.
الشكل 8. كمون السلوك في ظل ظروف متغيرة. بالنسبة لمعظم التجارب أننا تنشيط الخلايا العصبيه واحدة في يرقات ~ HPF-35 معربا عن الشيف tdTomato مع نبض ميللي ثانية 5 من 473 نانومتر ليزر زرقاء يقودها المصدر 5 السلطة V (الشكل 6). إلى فهم أفضل للديناميات تفعيل الشيف، تباينت نحن المعلمات لتحديد تأثيرها على السلوك. (A) وقال إن مدة التحفيز ضوء (5 ميللي ثانية مقابل ميللي ثانية 10) لا يؤثر استتار عندما كميا من بداية نبضة الضوء. (ب) في ~ 35 HPF، والجهد يؤثر عكسيا الكمون. أدى انخفاض الفولتية إلى زيادة في الكمون الحركة. لتجاربنا، استخدمنا أقصى الجهد (5 V) PErmissible ليزر، أجهزة دينا، والتي أثارت السلوكيات النمطية بشكل موثوق أكثر من الخلايا العصبية RB الزاهية، معربا عن.
الشكل 9. (فيلم 7). تفعيل الشيف-tdTomato معربا عن الخلايا العصبية في يرقات HPF RB 60. (A) ومع إطارات تصور تفعيل الخلايا العصبية RB-معربا عن الشيف tdTomato بواسطة نبضة ميللي ثانية 10 من 473 نانومتر ليزر زرقاء عبر كابل الألياف ميكرومتر 200 البصري. تم تسجيل السلوك الناتج في 1000 لقطة في الثانية بواسطة كاميرا عالية السرعة. (B) كان يستخدم متحد البؤر المجهري لصورة الخلايا العصبية المنشط RB (ق). يظهر سهم في المنطقة حفز اللقطات السلوك. مقياس بار، و 100 ميكرومتر.
س: SRC = "/ files/ftp_upload/50184/50184fig10highres.jpg" />
الشكل 10. (الفيلم 8). تفعيل الشيف-tdTomato معربا عن الخلايا العصبية في يرقات RB DPF 4. ومع تصور اطر تفعيل الخلايا العصبية RB-معربا عن الشيف tdTomato بواسطة نبضة ميللي ثانية 20 من 473 نانومتر ليزر زرقاء عبر كابل الألياف ميكرومتر 200 البصري. تم تسجيل السلوك الناتج في 1000 لقطة في الثانية مع كاميرا عالية السرعة.
الفيلم 1. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
فيلم 2. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
الفيلم 3. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
الفيلم 4.طالبان الباكستانية :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50184/50184movie4.mpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.
الفيلم 5. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
الفيلم 6. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
فيلم 7. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
فيلم 8. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد وصفت لنا نهجا لتفعيل optogenetic من الخلايا العصبية RB واحد في الزرد الحية. لدينا أسلوب يستخدم للتعبير عن transgenesis عابرة البديل channelrhodopsin الموسومة fluorescently، الشيف، tdTomato 13، في الخلايا العصبية الحسية الجسدية المحددة. ويمكن بسهولة أن تتكيف هذا النهج لاستخدامها في غيرها من اليرقات الزرد السكان الخلية.
باستخدام هذا النهج الذي أثار باستمرار الاستجابات السلوكية من اليرقات HPF 34-48 معربا عن الشيف-tdTomato. بعد 5 ميللي ثانية باستخدام نبض الضوء الأزرق في 5 V، كنا قادرين على تنشيط الخلايا العصبية RB واحد (الشكل 7). عن طريق وضع الألياف البصرية عند نقاط مختلفة على طول الحيوان، وجدنا أنه من الضروري أن تهدف الضوء الأزرق مباشرة في جسم الخلية للحصول على رد السلوكية. لم نبضات ضوئية لا استثارة رد فعل من اليرقات التي لم يبد الشيف. وبالإضافة إلى ذلك، نبضات ضوئية على طول محور عصبي محور عصبي مركزي أو محيطي أبدا استدعت ردا على ذلك، هفين في اليرقات الصغيرة (البيانات لا تظهر). وكان هذا العقار مفيد لأننا من الممكن أن ينشط الخلايا العصبية بثقة واحد في الحيوانات التي وصفت الخلايا العصبية متعددة، حتى لو كانت محاور عصبية من الخلايا العصبية المركزية الأخرى يمر قرب جسم الخلية العصبية ويستهدف (الفيلم 4-6).
لاختبار موثوقية لتقييم النهج المعلمات الحركية، توصلنا إلى كمون الاستجابة الهروب (الوقت من الضوء لتفعيل الاستجابة السلوكية) HPF بين 40 و 48، والمعلمة التي يتم المعروفة لتكون نمطية إلى حد كبير. لتحديد إذا كانت مدة التحفيز ضوء يؤثر الخلايا العصبية تفعيل ضوئية ونحن الخلايا العصبية المستهدفة لميللي ثانية 5 أو 10 (الشكل 8A). منذ الكمون السلوكية في كل الظروف هي نفسها عند حسابها من بداية نبضة الضوء، استنتجنا أن مدة نبضة الضوء لم تؤثر كمون السلوك. ومع ذلك، لم نجد أن الحد من زيادة الجهد الالكمون (ه) من سلوك (8B الشكل). كانت الساعة 5 V، ومع ذلك، الكثير من الردود (9 من أصل 16 الأسماك) 20 ± 5 مللي ثانية، على غرار الكمون الإبلاغ عن ردود هروب الطبيعية. وبالتالي، وتفعيل الخلايا العصبية مع 5 V يقترب تفعيل القصوى.
المعلمات من أجل انتزاع استجابات سلوكية فعالة من تفعيل الخلايا العصبية RB واحدة تختلف في أقدم اليرقات. ونحن انتزع بنجاح الاستجابات السلوكية من الحيوانات قديمة إلى 4 DPF، في وقت لاحق بكثير من أفيد سابقا. ومع ذلك، في حين أن تفعيل الخلايا العصبية RB واحد مع نبض 5 مصباح ميللي ثانية في 5 V أدى باستمرار في رد السلوكية قبل 48 HPF، تفعيل أقدم اليرقات (> 60 HPF) لا يتفق و. وتعد البقول (10-100 ميللي ثانية) الضوء غالبا ما يكون ضروريا لتنشيط الخلايا العصبية في كبار السن اليرقات (الشكل 9 و 10، 7 و 8 الفيلم، على التوالي). لذلك، قد تحتاج إلى تفعيل المعلماتأن يكون الأمثل / معايرة على أساس المرحلة التجريبية.
ويمكن استخدام هذا النهج وصفنا هنا للكثير من التطبيقات المحتملة. نحن نستخدم هذا الأسلوب لتحديد الاستجابات السلوكية التي تسببها أنواع فرعية مختلفة من الخلايا العصبية، ولكن يمكن أن تستخدم أيضا لوصف وضع استجابات السلوكية والحيوان ينضج، وآثار المخدرات أو طفرات على السلوك، أو، إلى جانب علم وظائف الأعضاء أو التصوير، لتحديد خصائص دوائر المصب تفعيلها من خلال خلية عصبية محددة. وعلى العكس، يمكن أن تستخدم قنوات المثبطة، مثل halorhodopsin، لمنع الخلايا العصبية معينة ضمن الشبكة العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم أي اهتمام المتنافسة المالية.
Acknowledgments
نشكر فومي كوبو، وتود تييلي HerwigBaier (UCSF / معهد ماكس بلانك) للحصول على المشورة بشأن التجارب السلوك وDPSS الليزر إنشاؤها؛ Heesoo كيم وCERRI كيارا من ملعب البيولوجيا العصبية للمساعدة في MBL الشيف-tdTomato التجارب؛ PetronellaKettunen (جامعة غوتنبرغ ) للتعاون الأولي على التجارب optogenetic؛ BaljitKhakh، اريك هدسون، وجون مايك باكا ميليغان (UCLA) للحصول على المشورة التقنية، وروجر تسين (جامعة كاليفورنيا سان دييغو) لبناء الشيف-tdTomato. وأيد هذا العمل من قبل على جائزة (5F31NS064817) NRSA لAMSP ومنحة من NSF (RIG: 0819010) لAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
| Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Petri dish (60x15 mm) | Any | Any | |
| Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
| Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
| Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
| Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
| Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C incubator | any | any | |
| 42 °C heat block | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
| Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
| Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
| Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
| Reagent | |||
| Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| Methylene blue | Fisher | S71325 | |
| Phenol red | Sigma | P4758 | |
| Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
| phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
| Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
| ~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |
||
References
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).
- Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
- Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).
- Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).
- Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).
- Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. , (2012).
- Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
- Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
- Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).
- Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
