Summary
Optogenetic technieken het mogelijk gemaakt om de bijdrage van specifieke neuronen te bestuderen. We beschrijven een werkwijze voor het activeren larvale zebravis enkele somatosensorische neuronen die een channelrhodopsin variant (CHEF) met een diode-gepompte vaste stof (DPSS) laser en registreren van gedrag opgewekt met een hoge snelheid video camera.
Abstract
Larvale zebravis zijn in opkomst als een model voor het beschrijven van de ontwikkeling en functie van eenvoudige neurale circuits. Vanwege hun externe bevruchting, snelle ontwikkeling en doorschijnendheid zijn zebravis bijzonder geschikt voor optogenetic benaderingen neurale circuitfunctie onderzoeken. In deze benadering worden lichtgevoelige ionenkanalen uitgedrukt in specifieke neuronen, waardoor de experimentator te activeren of te remmen op en zal derhalve evalueren hun bijdrage aan specifiek gedrag. Het toepassen van deze methoden in larvale zebravis is conceptueel eenvoudig, maar vereist de optimalisatie van de technische details. Hier tonen een procedure voor het tot expressie channelrhodopsin een variant in larvale zebravis somatosensorische neuronen, foto-activerende afzonderlijke cellen en het registreren van de resulterende gedrag. Door enkele wijzigingen eerder vastgestelde werkwijzen, kan deze benadering worden gebruikt om gedragsreacties ontlokken enkele neuronen geactiveerd uptot minstens 4 dagen na de bevruchting (DPF). Concreet hebben we een transgen met behulp van een somatosensorische neuron versterker, CREST3, om de uitdrukking van de gelabelde channelrhodopsin variant, chef-tdTomato rijden. Injecteren van deze transgen in 1-cel embryo's resulteert in mozaïek expressie in somatosensorische neuronen, die kunnen worden afgebeeld met confocale microscopie. Illuminating geïdentificeerd cellen in deze dieren met licht van een 473 nm laser DPSS, geleid door een glasvezelkabel, ontlokt gedrag dat kan worden opgenomen met een high-speed video camera en geanalyseerd kwantitatief. Deze techniek kan worden aangepast aan studie gedrag opgewekt door activeren van een zebravis neuron. De combinatie van deze aanpak met genetische of farmacologische storingen zal een krachtige manier om circuit vorming en functie te onderzoeken zijn.
Introduction
De ontwikkeling van optogenetic methoden voor het bevorderen of remmen van neuronale prikkelbaarheid met bepaalde golflengten is het mogelijk de functie van verschillende populaties van neuronen in neurale circuits controle gedrag 1, 19, 21 bestuderen. Deze techniek wordt vaak gebruikt om groepen van neuronen activeren, maar kan ook worden gebruikt om individuele neuronen activeren. Zebravis larven bijzonder vatbaar voor deze methoden omdat zij translucent, het zenuwstelsel ontwikkelt zich snel en het creëren van transgene dieren is snel en routine. Moet echter aanzienlijke technische obstakels worden overwonnen om betrouwbaar bereiken enkel neuron activatie.
Om een procedure voor optogenetic activering van enkele zebravis neuronen te optimaliseren, hebben we ons gericht op somatosensorische neuronen. Zebravis larven detecteren verschillende somatosensorische stimuli met twee populaties van neuronen: trigeminale neuronen, die het hoofd innerveren en ROHON-Beard (RB) neuronen, die de rest van het lichaam innerveren. Elke trigeminus en RB neuron projecteert een perifere axon die takken op grote schaal in de huid op prikkels en een centrale axon die verbinding maakt met downstream neurale circuits op te sporen. Dieren reageren op zo vroeg 21 uur na de bevruchting (HPF) aan te raken, wat aangeeft dat coherente somatosensorische circuits zijn 5 gevormd, 18. Tijdens de larvale ontwikkeling tenminste een driehoeks-en RB neuronen synaps op de Mauthner cel klassieke escape reacties activeren, maar geaccumuleerd bewijs suggereert dat er meerdere klassen van somatosensorische neuronen met verschillende patronen van verbindingen die opwekken variaties op de vluchtgedrag 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. De motivatie voor het ontwikkelen van deze werkwijze was het gedrag functie van verschillende klassen van somatosensorische neuronen karakteriseren, maar deze benadering kan in principe worden gebruikt om de functie van vrijwel elk neuron of populatie van neuronen in lar bestuderenval zebravis.
Douglass et al.. Eerder beschreven een werkwijze voor het activeren Channelrhodopsin-2-expressie somatosensorische neuronen met blauw licht opwekken vluchtgedrag 3. Hun aanpak gebruikt een versterker element van de isl1 gen tot expressie van ChR2-EYFP rijden somatosensorische neuronen. Dit transgen werd echter gemeld relatief zwakke fluorescentie weergegeven, waarbij co-injectie van het reporter te UAS :: GFP, zodat visualisatie van cellen die ChR2-EYFP. Deze benadering werd gebruikt om het gedrag van responsen op te wekken tussen de 24 tot 48 hpf, maar kon nooit een reactie uitlokken Afgelopen 72 hpf. Terwijl deze methode werkt voor het bestuderen neurale circuits in zeer vroege larvale stadia (24-48 HPF) is onvoldoende voor het karakteriseren neurale circuits en gedragsreacties in oudere larven, wanneer meer diverse gedragsreacties duidelijk zijn en neurale circuits rijper.
We zochten naarverbetering van de gevoeligheid van deze techniek om de functie van subpopulaties van neuronen larvale RB karakteriseren. Om expressie verbeteren we een somatosensorische-specifieke enhancer (CREST3) 20 tot expressie van LexA-VP16 en een gedeelte van LexA operatorsequenties (4xLexAop) 11 rijden naar de expressie van een fluorescent gelabeld licht geactiveerde kanaal amplificeren. Deze configuratie versterkte expressie van het kanaal, waardoor de noodzaak voor co-expressie van een tweede verslaggever en waardoor we de relatieve overvloed van het kanaal direct te bepalen in elk neuron. Met de LexA / LexAop sequentie hadden een bijkomende voordeel dat wij het transgen te introduceren in zebravis reporter lijnen die de Gal4/UAS systeem. Tijdelijke expressie van deze transgene resulteerde in variërende niveaus van expressie, maar was gewoonlijk sterk genoeg om zowel het cellichaam en axonale projecties van individuele neuronen te visualiseren gedurende meerdere dagen. Om handschoe optimaliserenheid aan het licht dat we het gebruikte licht geactiveerde kanaal chef-kok, een channelrhodopsin variant bestaat uit een hersenschim van channelopsin-1 (Chop1) en channelopsin-2 (Chop2) met een crossover site op helix-lus EF 13. Dit kanaal wordt geactiveerd op dezelfde golflengte als ChR2, maar vereist lagere lichtintensiteit voor activering, waardoor het gevoeliger dan andere veelgebruikte kanalen, waaronder ChR2. De chef-kok eiwit werd gefuseerd met het rode fluorescerende eiwit, tdTomato, waardoor we voor eiwitexpressie scherm zonder het activeren van het kanaal. Als lichtbron, gebruikten we een diode gepompte solid-state (DPSS) laser gekoppeld met een glasvezelkabel aan een nauwkeurige, krachtige puls van blauw licht leveren aan een specifiek gebied van de larven. Dit liet ons toe laserlicht gericht op individuele neuronen, waardoor de noodzaak voor het vinden van zeldzame transgene dieren die het kanaal in een neuron. Met behulp van deze aanpak zijn we in staat waren om een RB neuronen te activeren, gedrags-respons op te nemens met een hoge snelheid video camera en beeld de geactiveerde neuronen hoge resolutie met confocale microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bereid de volgende van tevoren.
1. Bereid Optic Cable
- Maak een geheugen voor de opslag van de optische kabel door het smelten van de taps toelopende hals van een glazen Pasteur pipet over een bunsenbrander met een ~ 150 ° hoek te maken.
- Met behulp van een kniptang of een scheermesje, snijd voorzichtig de optische kabel in twee stukken. Elk stuk moet het ene uiteinde een FC / PC-adapter en een open einde. Bewaar een stuk als reserve kabel.
- Strip de optische kabel naar de bekleding door verwijderen van de vezel en mantel versterking vezels (Figuur 1A) van 5,0 cm afgesneden uiteinde van de kabel.
- Steek glasvezelkabel in de voorbereide Pasteur pipet. Zorg ervoor dat kabels kunnen gemakkelijk in-en uit te gaan van de pipetpunt.
- Met optische kabel uitsteken van de punt van Pasteur pipet voorzichtig geknipt en vezel bekleding te verwijderen uit de hele glasvezel, ~ 2 mm van afgesneden uiteinde.
- Met behulp van een diamant pen / glassnijder, de glasvezel nick en breken off het einde van een zuivere snede / grond aan het einde van de vezel (Figuur 1B) maken.
- Trek optische kabel in Pasteur pipet voor opslag. Herhaal stap (1,6) als punt van optische vezel wordt afgebroken of breekt ongelijk.
- Positie glasvezelkabel in Pasteur pipet met een micromanipulator (Figuur 1C).
Procedures 2-8 beschrijven een werkwijze voor het injecteren van transgenen in embryo algemeen voor vele zebravis experimenten. Variaties op deze methode, zoals die beschreven in andere Jupiter's 6, 7, 8, 9, 22 zijn even effectief.
2. Trek injectienaalden
- Met behulp van een naald trekker, trek borosilicaatglas buis in twee injectienaalden met een geleidelijk taps toelopende tip. Puller instellingen variëren. (Op een Sutter Instruments naald trekker gebruiken we instellingen: P = 500, warmte = 720, Pull = 50, Velocity = 70 en Time = 150). Elke naald trekker is anders, dus optimaliseren trekker instellingen empirically. Voor meer taps toelopende naalden, verhoging van de warmte-en / of trekken. Voor minder taps toelopende naalden, verhogen Tijd en / of afname Pull.
- Bewaar naalden in een beveiligde container (dat wil zeggen een petrischaal met opgerolde tape, zelfklevende kant naar buiten).
3. Giet Spuitgietmatrijzen
- Smelt 0,5 g agarose in 30 ml embryo / blauw water, totdat agarose volledig is opgelost.
- Giet in onderste helft van een petrischaal.
- Plaats rechthoekige vorm met montage putten (figuur 2) in agarose, zorg dat de blaasvorming te beperken rond de putten.
- Laat agarose te stollen.
- Verwijder schimmel en vul petrischaal met blauw / embryo water.
- Rechtop bewaren, met schoon water, bij kamertemperatuur voor dezelfde dag gebruik of bij 4 ° C voor toekomstig gebruik.
4. Maak Plasmide DNA Mix voor injecties
- Plasmide DNA verdund tot een concentratie van 50 ng / ul met 1:10 fenolrood in ddH 2 O. Voorvoorbeeld:
1,0 ml plasmide DNA (250 ng / ml) 0,5 ml fenolrood 3,5 ml ddH 2 O - DNA mix kan worden bewaard bij kamertemperatuur bij gebruik onmiddellijk of bewaard bij 4 ° C gedurende meerdere dagen.
5. Stel Mating paren
Dit dient te gebeuren de avond voordat u van plan om injecties te doen.
- Vul fokkerij tanks met het systeem water en plaats mannelijke en vrouwelijke vissen samen. Als injecties niet zo snel worden uitgevoerd als lichten aan te steken in de faciliteit, aparte mannelijke en vrouwelijke vis met een scheidingswand.
6. Bereid je voor op Injecties (Kan worden gedaan tijdens het wachten voor embryo's)
- Zet druk injector rig. Zorg ervoor dat het systeem is ingesteld op puls. Begin met de pulsduur ingesteld op 1.
- Zet de luchtklep enStel de druk injector tot ~ 20 psi.
- Met behulp van een dissectie scope op het hoogste vergroting, breek punt van de naald met een pincet of een poker om een ~ 2 micrometer opening (Figuur 3, Movie 1) te creëren.
- Vul naalden met DNA mix van: 1. Het plaatsen van de naald, tip zijde naar boven in de DNA-mix en laat de naald te vullen door capillaire werking of 2. Met behulp van een long-reach-tip tot 1-2 pi van het DNA pipetteer meng direct in de naald.
- Plaats gevuld naald op een veilige plaats totdat klaar om te injecteren.
7. Verzamel embryo's
- Na installatie lichten zijn ingeschakeld, verwijdert u verdelers (indien van toepassing). Verzamel embryo's met een filter / kleine zeef en breng ze naar een petrischaal met fris blauw / embryo water.
8. Injecteer Embryo's op de 1-2 cellig stadium
- Overdracht geoogst embryo's spuitgietmatrijzen met behulp van een plastic pipet.
- Met behulp van een dissectiemicroscoop, duw embryo's inputten met een pincet of een stomp poker (Figuur 4, Movie 2).
- Plaats geladen naald in een micromanipulator en positie over embryo's.
- Kalibreer injectievolume door het aanpassen van de pulsduur in 1-stappen van totdat u het gewenste volume (~ 1 nl). Dit kan worden gekalibreerd met een micrometer, zoals beschreven in een eerdere Jupiter's 8, 22, maar dit experiment precisie niet noodzakelijk, omdat een groot aantal injectievolumes resulteert in adequate expressie.
- Injecteer ~ 1 nl DNA mix direct in de cel en herhaal voor alle embryo's. DNA kan ook worden geïnjecteerd in de dooier, maar dit schijnt minder efficiënt (figuur 5, Movie 3).
- Verwijder geïnjecteerde embryo's van mal met behulp van een zachte stroom van blauw / embryo water.
- Store geïnjecteerde embryo's op 28,5 ° C in het donker.
- Periodiek verwijderen van onbevruchte, beschadigde of dode embryo's.
- Behandel embryo with PTU tussen 18-24 hpf aan pigmentatie te voorkomen.
9. Scherm voor Transgene Expressie
- Handmatig dechorionate 24 tot 48 hpf embryo's met behulp van een tang.
- Verdoven larven met 0,02% tricaine.
- Met behulp van een fluorescerende dissectiemicroscoop, identificeren larven met RB of trigeminus neuron expressie en breng deze in een nieuw gerecht met verse PTU blauw / embryo water. Embryo's met dunne expressie in gemakkelijk te identificeren cellen optimaal, maar individuele neuronen worden gericht op activering met een glasvezelkabel zodat allerlei expressie dichtheid aanvaardbaar.
- Bewaren embryo's bij 28,5 ° C in het donker totdat de gewenste experimenteel stadium.
10. Monteer Larven voor Gedrag Experimenten
- Maak 1,5% laag smeltpunt agarose in ddH 2 O en op te slaan in een 42 ° C warmte blok om te voorkomen dat stollen.
- Met behulp van een glazen Pasteur pipet, overdracht een van de vooraf gescreend larven in een bade van 1,5% laag smeltpunt agarose met zo weinig blauw / embryo water mogelijk te maken.
- Breng larven in een druppel agarose op een kleine petrischaal.
- Onder een dissectiemicroscoop, positie larve dorsaal op.
- Wanneer agarose is gestold, weggesneden de agarose met een dunne scheermesje (# 11 scalpel), waardoor een wig van agar rondom de hele larve.
- Maak twee diagonale sneden aan beide zijden van de dooier; let op dat nick de larve.
- Vul de omgeving van de agarose met embryo / blauw water.
- Trek agarose van de stam en de staart van de larve (Figuur 6).
11. Bereid High-speed Camera and Imaging software
- Monteer high-speed camera op het ontleden van omvang.
- Sluit de camera aan de computer.
- Zet de computer.
- Zet high-speed camera.
- Open video / imaging software (We maken gebruik van AOS imaging software en zal de procedures beschreven voor het gebruik ervan hier, maar andere beeldvormendesoftware is even aanvaardbaar).
- Pas de camera-instellingen dienovereenkomstig (dwz 1.000 frames per seconde (fps), 50% trekker buffer of andere voorkeursinstellingen op).
- Start de opname.
12. Activeer Single Neuronen Met behulp van een 473 nm laser
- Bevestig stimulator, laser-en optische kabel.
- Zet stimulator.
- Stimulator ingesteld maximaal 5 volt en een pulsduur van 5 msec.
- Schakel laser volgens instructies van de fabrikant.
- Gebruik een dissectiemicroscoop aan het uiteinde van de optische kabel bij cellichaam van een neuron met chef-tdTomato expressie (Figuur 6) positioneren.
- Lever puls van blauw licht op zintuiglijke neuron te activeren.
- Record gedrag met behulp van een high-speed camera in te stellen op 500 of 1.000 frames per sec.
- Herhaal experiment naar wens, wacht 1 minuut tussen elke activering om gewenning te vermijden. (We minimaal drie reacties houden voor elk neuron).
- Naarversie larven, los te wrikken uit elkaar agarose met een pincet, zorg ervoor dat u het dier verwonden. Dit dier kan worden toegestaan verder te ontwikkelen en de procedure kan worden herhaald op latere stadium van de ontwikkeling van het gedrag karakteriseren. De embryo kan weer worden aangebracht voor hoge resolutie confocale beeldvorming van de geactiveerde cel gedrag correleren met celstructuur, zoals hieronder beschreven.
- Overdracht larve tot cultuur plaat met verse blauwe / embryo water. We gebruiken een 24-well plaat bijhouden van individuele larven.
13. Afbeelding Neuron (s) met een confocale microscoop
- Verdoven larven met 0,02% tricaine.
- Mount larven-, rug-kant naar boven, in 1,2% laag smeltpunt agarose of in een dorsale mal.
- Afbeelding Chef-tdTomato neuronen met een 543 nm laser en geschikt filter en objectief. We maken gebruik van een 20x doelstelling.
- Verwijder larven uit agarose en goed terug te gaan naar iemand met blauw / embryo water.
- Bewaren bij 28,5 ° C in het donker voor de further analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1. Optische kabel set-up. (A) Lagen van een glasvezelkabel. (B) Stripped glasvezelkabel in een Pasteur pipet. (C) Glasvezelkabel in Pasteur pipet gepositioneerd met behulp van een micromanipulator.
Figuur 2. Spuitgietmatrijs sjabloon.
Figuur 3. (Film 1). Het doorbreken van de naald.
Figuur 4. (Film 2). Plaatsen embryo's in de spuitgietmatrijs.
ther.within-page = "always"> 
Figuur 5. (Film 3). Het injecteren van een nl-DNA mix in 1-cellig stadium embryo.
Figuur 6. Diagram van een gemonteerde zebravis larve en representatieve neuronen die betrokken zijn in het larvale aanslaggevoeligheid. Zebravis larven werden gedeeltelijk gemonteerd in 1,5% laag smeltpunt agarose (vertegenwoordigd door stippellijnen rond de rostrale deel van de larve). Een trigeminus neuron (in het hoofd) en een ROHON-Beard neuron (in de kofferbak) zijn weergegeven in rood. Mauthner cellen worden beschreven met streeplijnen in de larve. De optische kabel (wit) wordt weergegeven boven de RB neuron cel lichaam.
oad/50184/50184fig7.jpg "alt =" Figuur 7 "fo: inhoud-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50184/50184fig7highres.jpg "/>
Figuur 7. (Film 4). Activering van een RB neuron expressingChEF lokt een gedragsmatige respons. (A) Stilstaande beelden beeltenis van de activering van een enkel neuron RB uiten chef-tdTomato. Enkele neuronen werden geactiveerd door een 5 msec puls van een 473 nm blauwe laser via een 200 urn glasvezel. Spanning besturen van de blauwe laser werd vastgesteld op een maximum van 5 volt. Het resulterende gedrag werd op 1000 frames per sec door een snelle camera. (B) Confocale microscopie werd gebruikt om het imago van de geactiveerde RB neuron. Arrow toont regio gestimuleerd in gedrag foto's. (C) vergroot beeld van RB neuron aangegeven in (B). Schaalbalk 100 pm. (Film 5 en 6) dezelfde vis, (Film 5) trigeminus activering, (Film 6) RB neuron meer dan dooier extensie.p_upload/50184/50184fig7large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 8. Latency gedrag onder wisselende omstandigheden. Voor de meeste experimenten een neuron geactiveerd ~ 35 hpf larven expressie CHEF-tdTomato met een 5 msec puls van een 473 nm blauwe laser aangedreven door een 5 V voedingsbron (Figuur 6). Om beter te begrijpen van de dynamiek van chef-kok activering, we varieerde parameters om het effect te bepalen op gedrag. (A) De duur van het licht stimulatie (5 msec versus 10 msec) had geen invloed op latency wanneer gekwantificeerd vanaf het begin van lichtpuls. (B) op ~ 35 hpf, spanning beïnvloedt omgekeerd latentie. Lagere spanningen tot een toename in vertraging van de beweging. Voor onze experimenten hebben we de maximum voedingsspanning (5 V) permissible voor onze laser apparaat, dat op betrouwbare wijze stereotiepe gedragingen ontlokt meest helder uitdrukken RB neuronen.
Figuur 9. (Film 7). Activering van chef-tdTomato uitdrukken RB neuronen in 60 hpf larven. (A) Stilstaande beelden beeltenis van de activering van RB neuronen die Chef-tdTomato door een 10 msec puls van een 473 nm blauwe laser via een 200 micrometer glasvezelkabel. Het resulterende gedrag werd op 1000 frames per sec door een snelle camera. (B) Confocale microscopie werd gebruikt om de geactiveerde beeld RB neuron (s). Arrow toont regio gestimuleerd in gedrag foto's. Schaalbalk 100 pm.
o: src = "/ files/ftp_upload/50184/50184fig10highres.jpg" />
Figuur 10. (Film 8). Activering van chef-tdTomato uitdrukken RB neuronen in 4 dpf larven. Stilstaande beelden beeltenis van de activering van RB neuronen die Chef-tdTomato door een 20 msec puls van een 473 nm blauwe laser via een 200 micrometer glasvezelkabel. Het resulterende gedrag werd op 1000 frames per sec met een snelle camera.
Film 1. Klik hier om naar de film te bekijken .
Movie 2. Klik hier om naar de film te bekijken .
Movie 3. Klik hier om film te bekijken .
Movie 4.ttp :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50184/50184movie4.mpg "target =" _blank "> Klik hier om film te bekijken.
Film 5. Klik hier om naar de film te bekijken .
Film 6. Klik hier om naar de film te bekijken .
Movie 7. Klik hier om naar de film te bekijken .
Film 8. Klik hier om naar de film te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben beschreven een aanpak voor optogenetic activering van een RB neuronen in levende zebravis. Onze methode maakt gebruik van voorbijgaande transgenese een fluorescent gelabeld channelrhodopsin variant, chef-tdTomato 13, uit te drukken in specifieke somatosensorische neuronen. Deze benadering kan eenvoudig worden aangepast voor gebruik in andere larvale zebravis celpopulaties.
Met deze aanpak hebben we consequent gedragsreacties opgewekt 34-48 hpf larven uiten chef-tdTomato. Een 5 msec puls van blauw licht bij 5 V, konden we enkele RB neuronen (Figuur 7) te activeren. Door positionering van de optische vezel op verschillende punten langs het dier, vonden we dat het noodzakelijk was om het blauwe licht direct gericht op een cellichaam met een gedragsrespons wekken. Lichtpulsen lokte geen reactie van larven die niet uitdrukken chef-kok. Bovendien lichtpulsen langs de centrale axon of de perifere axon nooit uitgelokt antwoord, even in larven (data niet getoond). Deze eigenschap is voordelig omdat we met vertrouwen activeren enkele neuronen bij dieren waarbij meerdere neuronen werden gelabeld, zelfs indien de centrale axonen van andere neuronen gepasseerd nabijgelegen cel gerichte neuron lichaam (Movie 4-6).
Om de betrouwbaarheid van de benadering voor het vaststellen kinematische parameters testen bepaalden wij de latentie van de escape response (de tijd van licht activatie gedragsrespons) tussen 40 en 48 HPF, een parameter die bekend staat als zeer stereotype. Om te bepalen of de duur van het licht stimulus beïnvloedt neuron activeren, richten we ons neuronen verlicht voor 5 of 10 msec (Figuur 8A). Omdat het gedrag latency zowel waren dezelfde als gerekend vanaf het begin van de lichtpuls, concludeerden we dat de duur van de lichtpuls niet latentie van beïnvloeden. Echter, vinden we dat het verminderen van de spanning ste toegenomene tragere gedrag (Figuur 8B). Bij 5 V echter vele reacties (9 van de 16 vissen) 20 ± 5 msec, vergelijkbaar met de gerapporteerde latentie voor natuurlijke escape reacties. Aldus activeren neuronen met 5 V benadert maximale activering.
Parameters voor effectieve opwekken gedragsreacties het activeren enkele RB neuronen gevarieerd oudere larven. Wij hebben met succes gedragsreacties opgewekt van dieren zo oud als 4 dpf, aanzienlijk later dan eerder werd gemeld. Echter, terwijl de inschakeling van een RB neuronen met een 5 msec lichtpuls bij 5 V consequent resulteerde in een gedragsmatige reactie vóór 48 hpf, activering van oudere larven (> 60 HPF) was niet zo consistent. Langere pulsen (10-100 msec) licht vaak noodzakelijk neuronen in oudere larven (figuur 9 en 10, Movie 7 en 8, respectievelijk) activeren. Daarom kan de activering parameters moetenworden geoptimaliseerd / gekalibreerd op basis van experimenteel stadium.
De aanpak die we hier beschrijven kunnen worden gebruikt voor veel potentiële toepassingen. We gebruiken deze methode om de gedragsreacties opgewekt door verschillende subtypes van neuronen te definiëren, maar het kan ook worden gebruikt om de ontwikkeling van gedrags-responsen het dier rijpt, de effecten van drugs of mutanten gedrag of in combinatie met fysiologie of beeldvorming, aan downstream circuits geactiveerd door een geïdentificeerde neuronen karakteriseren. Omgekeerd kan remmende kanalen, zoals halorhodopsin, worden gebruikt om specifieke neuronen in een neuraal netwerk remmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financieel belang hebben.
Acknowledgments
Wij danken Fumi Kubo, Tod Thiele en HerwigBaier (UCSF / Max Planck Instituut) om advies over het gedrag van experimenten en DPSS laser ingesteld; Heesoo Kim en Chiara Cerri uit de MBL Neurobiologie cursus om te helpen bij Chef-tdTomato experimenten; PetronellaKettunen (Universiteit van Göteborg ) voor de eerste samenwerking op het optogenetic experimenten; bouwen en Roger Tsien (UCSD) voor de chef-tdTomato; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca en John Milligan (UCLA) voor technisch advies. Dit werk werd ondersteund door een NRSA (5F31NS064817) gunning aan AMSP en een subsidie van de NSF (RIG: 0819010) naar AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
| Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Petri dish (60x15 mm) | Any | Any | |
| Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
| Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
| Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
| Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
| Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C incubator | any | any | |
| 42 °C heat block | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
| Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
| Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
| Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
| Reagent | |||
| Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| Methylene blue | Fisher | S71325 | |
| Phenol red | Sigma | P4758 | |
| Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
| phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
| Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
| ~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |
||
References
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).
- Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
- Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).
- Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).
- Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).
- Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. , (2012).
- Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
- Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
- Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).
- Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
