Summary
Optogenetic teknikker har gjort det muligt at studere bidrag fra bestemte neuroner til adfærd. Vi beskriver en metode i larvernes zebrafisk til aktivering enkelt somatosensoriske neuroner udtrykker et channelrhodopsin variant (kok) med en diode-pumpet solid state (DPSS) laser og registrere fremkaldte adfærd med en high-speed video kamera.
Abstract
Larvestadium zebrafisk dukker op som en model til at beskrive udviklingen og funktionen af simple neurale kredsløb. På grund af deres eksterne befrugtning, hurtige udvikling, og gennemskinnelighed, er zebrafisk særlig velegnet til optogenetic fremgangsmåder til at undersøge neural kredsløbsfunktion. I denne fremgangsmåde er lysfølsomme ionkanaler udtrykkes i specifikke neuroner, således eksperimentatoren for at aktivere eller inhibere dem efter behag og derved vurdere deres bidrag til specifikke adfærd. Anvendelse af disse metoder i larvernes zebrafisk er begrebsmæssigt enkel, men kræver optimering af tekniske detaljer. Her har vi demonstrere en procedure til at udtrykke et channelrhodopsin variant i larvernes zebrafisk somatosensoriske neuroner, foto-aktiverende enkelte celler, og registrere deraf adfærd. Ved at indføre et par ændringer til tidligere etablerede metoder, kan denne fremgangsmåde anvendes til at fremkalde adfærdsmæssige reaktioner fra enkelte neuroner aktiverede optil mindst 4 dage efter befrugtning (DPF). Konkret har vi skabt et transgen ved hjælp af en somatosensoriske neuron enhancer, CREST3, at drive ekspressionen af den mærkede channelrhodopsin variant, Chef-tdTomato. Injektion af dette transgen i 1-celle embryoer resulterer i mosaik ekspression i somatosensoriske neuroner, der kan afbildes med konfokal mikroskopi. Illuminating identificerede celler i disse dyr med lys fra en 473 nm DPSS laser, guidet gennem et fiberoptisk kabel, fremkalder adfærd, der kan optages med en high-speed video kamera og analyseret kvantitativt. Denne teknik kan tilpasses til at studere adfærd fremkaldt ved at aktivere nogen zebrafisk neuron. Ved at kombinere denne tilgang med genetiske eller farmakologiske forstyrrelser vil være en effektiv måde til at undersøge kredsløb dannelse og funktion.
Introduction
Udviklingen af optogenetic fremgangsmåder til at fremme eller inhibering af neuronal excitabilitet med definerede bølgelængder af lys har gjort det muligt at studere funktionen af forskellige populationer af neuroner i neurale kredsløb der styrer adfærd 1, 19, 21. Denne teknik anvendes ofte til at aktivere grupper af neuroner, men det kan også anvendes til aktivering af individuelle neuroner. Zebrafisk larver er særligt modtagelige for disse metoder, da de er gennemsigtige, deres nervesystem udvikler sig hurtigt, og skabe transgene dyr er hurtig og rutine. Dog skal betydelige tekniske forhindringer overvindes til pålideligt at opnå en enkelt neuron aktivering.
For at optimere en procedure for optogenetic aktivering af enkelte zebrafisk neuroner, vi fokuserede på somatosensoriske neuroner. Zebrafisk larver opdage en bred vifte af somatosensoriske stimuli ved hjælp af to populationer af neuroner: trigeminale neuroner, der innerverer hoved og Rohon-skæg (RB) neuroner, som innerverer resten af kroppen. Hver trigeminal og RB neuron forventer en perifer Axon, at filialer i udstrakt grad i huden til at opdage stimuli og en central axon, der forbinder til downstream neurale kredsløb. Dyr reagerer at røre så tidligt som 21 timer efter befrugtning (HPF), hvilket indikerer, at en sammenhængende somatosensoriske kredsløb har dannet 5, 18. Under larveudvikling mindste nogle trigeminal og RB neuroner synapse på Mauthner cellen for at aktivere klassiske escape reaktioner, men akkumulerende beviser tyder på, at der er flere klasser af somatosensoriske neuroner med forskellige mønstre til tilslutning, der kan fremkalde variationer på escape adfærd 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Vores motivation for at udvikle denne metode var at karakterisere den adfærdsmæssige funktion af forskellige klasser af somatosensoriske neuroner, men denne fremgangsmåde kunne i princippet anvendes til at studere funktionen af næsten enhver neuron eller population af neuroner i larval zebrafisk.
Douglass et al. Tidligere beskrevet en fremgangsmåde til aktivering Channelrhodopsin-2-udtrykkende somatosensoriske neuroner med blåt lys, fremkalde escape adfærd 3. Deres tilgang anvendes en enhancer element fra isl1 genet at drive ekspression af CHR2-EYFP i somatosensoriske neuroner. Dette transgen blev imidlertid rapporteret at vise relativt svag fluorescens, der kræver co-injektion af en anden reporter, at UAS :: GFP, tillade visualisering af celler, der udtrykker CHR2-EYFP. Denne fremgangsmåde blev anvendt til at fremkalde adfærd reaktioner mellem 24-48 HPF, men aldrig kunne fremkalde en reaktion forbi 72 HPF. Mens denne metode virker for at studere neurale kredsløb i meget tidlige larvestadier (24-48 HPF), det er utilstrækkeligt til at karakterisere neurale kredsløb og adfærdsmæssige reaktioner hos ældre larver, når flere forskellige adfærdsmæssige reaktioner er synlige og neurale kredsløb er mere modne.
Vi forsøgte atforbedre følsomheden af denne teknik for at karakterisere funktionen af subpopulationer af larve-RB neuroner. At forbedre ekspression brugte vi en somatosensoriske-specifik enhancer (CREST3) 20 at drive ekspression af LexA-VP16 og en strækning af LexA-operator-sekvenser (4xLexAop) 11 til at amplificere ekspressionen af en fluorescerende mærket lysaktiveret kanal. Denne konfiguration amplificeret ekspression af kanalen, hvilket eliminerer behovet for co-ekspression af en anden reporter, og tillader os at direkte bestemme den relative forekomst af kanalen i hver neuron. Ved hjælp af LexA / LexAop-sekvensen havde den yderligere fordel at tillade os at indføre transgenet i zebrafisk reporter linjer, der bruger Gal4/UAS system. Forbigående ekspression af dette transgen resulterede i varierende niveauer af ekspression, men var sædvanligvis tilstrækkelig robust til at visualisere både cellelegemet og axonale projektioner af individuelle neuroner over flere dage. For at optimere følsomtet at tænde vi brugte lyset aktiverede kanal Chef, en channelrhodopsin variant, der består af en kimære af channelopsin-1 (Chop1) og channelopsin-2 (Chop2) med en crossover websted på helix loop EF 13. Denne kanal er aktiveret ved den samme bølgelængde som CHR2, men kræver lavere lysintensitet for aktivering, hvilket gør det mere følsomme end andre almindeligt anvendte kanaler, herunder CHR2. Kokken protein blev fusioneret til rødt fluorescerende protein, tdTomato, så vi kan screene for proteinekspression uden at aktivere kanalen. Som lyskilde, anvendte vi en diode pumpet solid-state (DPSS) laser koblet til et fiberoptisk kabel til at levere en præcis, kraftig impuls af blåt lys i en specifik region af larverne. Dette tillod os at fokusere laserlys på individuelle neuroner, hvilket eliminerer behovet for at finde sjældne transgene dyr, der udtrykker kanalen på en enkelt neuron. Ved hjælp af denne metode, var vi i stand til at aktivere en enkelt RB neuroner, optage adfærdsmæssig reaktions med en high-speed video kamera, og billedet de aktiverede neuroner i høj opløsning med konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forbered følgende før tid.
1. Forbered Optic Cable
- Skabe en opbevaringsenhed for den optiske kabel ved at smelte den tilspidsede hals på en glas Pasteur-pipette over en bunsenbrænder at skabe et ~ 150 ° vinkel.
- Ved hjælp af en bidetang eller et barberblad, omhyggeligt skåret den optiske kabel i to stykker. Hvert stykke skal have den ene ende med en FC / PC adapter og en eksponeret ende. Gem et stykke som en reserve-kabel.
- Afisoler optisk kabel ned til beklædningen ved at fjerne fiberen jakke og styrkelse fibre (figur 1A) fra 5,0 cm af afskårne ende af kablet.
- Sæt optisk kabel i forberedt Pasteur pipette. Sørg for, at kablet kan nemt flytte ind og ud af pipettespidsen.
- Med optisk kabel stikker ud fra spidsen af Pasteur pipette forsigtigt klippe og fjerne fiberkappe fra omkring glasfiber. ~ 2 mm fra afskårne ende
- Ved hjælp af en diamant pen / glasskærer, glasfiberen nick og bryde off enden for at skabe et rent snit / overflade ved enden af fiberen (figur 1 B).
- Trække optisk kabel i Pasteur-pipette til opbevaring. Gentag trin (1,6), hvis spidsen af optisk fiber bliver tilhugget eller pauser ujævnt.
- Position optisk kabel i Pasteur-pipette under anvendelse af en mikromanipulator (figur 1C).
Procedurer 2-8 beskriver en metode til injektion af transgener i embryoner der normalt gælder for mange zebrafisk eksperimenter. Variationer af denne metode, ligesom dem beskrevet i andre Jové videoer 6, 7, 8, 9, 22 er lige effektive.
2. Træk kanyler
- Ved hjælp af en nål aftrækker, borsilicatglas rør trække i to kanyler med en gradvist tilspidset spids. Puller indstillinger varierer. (På en Sutter Instruments nål aftrækker vi bruger indstillinger: P = 500, Heat = 720, Pull = 50, Velocity = 70 og tid = 150). Hver nål aftrækker er forskellige, så optimere aftrækker-indstillinger empirically. For mere koniske nåle, øge varme og / eller Træk. For mindre koniske nåle, øge tid og / eller fald Pull.
- Opbevar nåle i en sikker beholder (dvs. en petriskål med rullet tape, klæbende side ud).
3. Hæld sprøjtestøbeforme
- Smelt 0,5 g agarose i 30 ml embryo / blå vand, indtil agarose er helt opløst.
- Hældes i nederste halvdel af en petriskål.
- Placer rektangulær form med montering brønde (figur 2) i agarose, være omhyggelig med at begrænse bobledannelse omkring brøndene.
- Tillad agarose at størkne.
- Fjern mug og fyld petriskål med blå / foster vand.
- Opbevares opretstående, fyldt med rent vand, ved stuetemperatur i fra dag til dag anvendelse eller ved 4 ° C til fremtidig brug.
4. Gør Plasmid DNA Mix til injektionsvæsker
- Fortynd plasmid-DNA til en koncentration på 50 ng / pi med 1:10 phenolrødt i ddH 2 O. Foreksempel:
1,0 ml plasmid DNA (250 ng / ml) 0,5 ml phenolrødt 3,5 ml ddH 2 O - DNA mix kan opbevares ved stuetemperatur, hvis der anvendes straks eller opbevares ved 4 ° C i adskillige dage.
5. Konfigurer Parring Pairs
Dette bør gøres aftenen før du planlægger at gøre injektioner.
- Fyld avl tanke med systemet vand og sted mandlige og kvindelige fisk sammen. Hvis injektioner ikke kan udføres, så snart lyset tændes i anlægget, separat mandlige og kvindelige fisk med en skillevæg.
6. Forbered til injektion (kan gøres mens man venter på embryoner)
- Tænd pres injektor rig. Sørg for, at systemet er indstillet til at pulsere. Start med pulsvarighed sat til 1.
- Tænd for luftventilen ogjuster trykket injektor til ~ 20 psi.
- Ved hjælp af en dissektionsmikroskop på højeste forstørrelse, bryde spidsen af nålen med tang eller poker for at oprette en ~ 2 um åbning (Figur 3, Movie 1).
- Fyld nåle med DNA mix af: 1. Anbringelse af nålen, spids opad, ind i DNA mix og nålen fill ved kapillarvirkning eller 2. Under anvendelse af en lang nå tip at pipettere 1-2 pi DNA blandes direkte ind i nålen.
- Sted fyldt kanyle i et sikkert sted, indtil klar til at injicere.
7. Saml Embryoner
- Efter facility lys har tændt, skal du fjerne skillevægge (hvis relevant). Saml embryoner med en si / lille si og overføre dem til en petriskål med frisk blå / embryo vand.
8. Injicere Embryoner på 1-2 Cell Stage
- Overfør høstede embryoner til sprøjtestøbeforme ved hjælp af en plastik pipette.
- Ved hjælp af en dissektionsmikroskop til forsigtigt at skubbe embryoner ibrønde med pincet eller en stump poker (figur 4, Movie 2).
- Anbring loaded nål i en mikromanipulator og position over embryoner.
- Kalibrer injektionsvolumen ved at justere impulsvarighed i 1-trin på indtil du opnår den ønskede lydstyrke (~ 1 nl). Dette kunne kalibreres med et mikrometer slide, som beskrevet i en tidligere Jové videoer 8, 22, men for dette forsøg præcision ikke er nødvendig, da en lang række injektionsvolumener vil resultere i tilstrækkelig ekspression.
- Injicere ~ 1 nl DNA blandes direkte i cellen og gentag for alle embryoner. DNA kan også injiceres i blommen, men dette har tendens til at være mindre effektiv (figur 5, Movie 3).
- Fjern injicerede embryoner fra skimmel ved hjælp af en blid strøm af blå / embryo vand.
- Store injicerede embryoner ved 28,5 ° C i mørke.
- Fjern ubefrugtede, beskadigede eller døde fostre med jævne mellemrum.
- Behandl embryoner with PTU mellem 18-24 HPF at forhindre pigmentering.
9. Skærm for transgenekspression
- Manuelt dechorionate 24-48 HPF embryoner ved hjælp af pincet.
- Bedøve larver anvendelse af 0,02% tricaine.
- Ved hjælp af en fluorescerende dissektionsmikroskop, identificere larver med RB eller trigeminal neuron udtryk og overføre disse til en ny skål med frisk PTU blå / embryo vand. Embryoner med sparsom ekspression i let identificerbare celler er optimal, men individuelle neuroner vil blive målrettet til aktivering med et fiberoptisk kabel, således en bred vifte af ekspression densitet er acceptabel.
- Store embryoer ved 28,5 ° C i mørke, indtil det ønskede forsøgsstadiet.
10. Mount Larver for adfærd Eksperimenter
- Lav 1,5% lavtsmeltende agarose i ddH 2 O og opbevares i en 42 ° C varmeblok for at forhindre det i at størkne.
- Brug et glas Pasteur pipette en af de præ-screenede larver i en baljee på 1,5% lavtsmeltende agarose med så lidt blå / embryo vand som muligt.
- Overfør larver i en dråbe agarose på en lille petriskål.
- Under et dissektionsmikroskop, position larve dorsal op.
- Når agarose er størknet, skæres væk agarosen med et tyndt barberblad (# 11 skalpel), hvilket efterlader en kile af agar rundt om hele larve.
- Lav to diagonale snit på hver side af blommen, sørge for ikke at nick larven.
- Fyld området omkring agarose med embryo / blå vand.
- Træk agarose væk fra stammen og hale af larven (fig. 6).
11. Forbered High-speed kamera og billedbehandlingssoftware
- Mount high-speed kamera på dissekere rækkevidde.
- Slut kameraet til computeren.
- Tænd computeren.
- Slå high-speed kamera.
- Åbn video / imaging software (Vi bruger AOS imaging software og vil beskrive procedurerne for at bruge det her, men andre imagingsoftware kan også accepteres).
- Juster kameraets indstillinger tilsvarende (dvs. 1.000 frames per sekund (fps), 50% udløser buffer eller andre foretrukne indstillinger).
- Start optagelsen.
12. Aktiver enkelte neuroner Brug af en 473 nm Laser
- Vedhæfte stimulator, laser og optisk kabel.
- Slå stimulatoren.
- Sæt stimulator til højst 5 volt og en pulsvarighed af 5 msek.
- Tænd laser ifølge producentens instruktioner.
- Anvende et dissektionsmikroskop for at placere spidsen af optisk kabel nær cellelegeme af en neuron med CHEF-tdTomato ekspression (figur 6).
- Lever puls af blåt lys til at aktivere sensorisk neuron.
- Optag adfærd ved hjælp af en high-speed kamera indstillet til 500 eller 1.000 frames per sekund.
- Gentag eksperimentet som ønsket, venter 1 minut mellem hver aktivering for at undgå tilvænning. (Vi optager mindst tre svar for hver neuron).
- Tilrelease larver, lirke fra hinanden agarose med pincet, pas på ikke at skade dyret. Dette dyr kan få lov til at udvikle sig yderligere, og proceduren kan gentages med et ældre trin til karakterisering af udviklingen af adfærd. Embryonet kan også genmonteres for høj opløsning konfokal afbildning af aktiveret celle at korrelere adfærd med cellestruktur, som beskrevet nedenfor.
- Overførsel larve til dyrkningsplade med frisk blå / embryo vand. Vi anvender en 24-brønds plade til at holde styr på individuelle larver.
13. Billede Neuron (r) med en konfokal mikroskop
- Bedøve larver med 0,02% tricaine.
- Mount larver, dorsalsiden op i 1,2% lavtsmeltende agarose eller i en dorsal støbeform.
- Billede Chef-tdTomato neuroner med en 543 nm laser og passende filter og objektiv. Vi bruger en 20x objektiv.
- Fjern larver fra agarose og vende tilbage til individuel brønd med blå / embryo vand.
- Opbevares ved 28,5 ° C i mørke for further analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. Optisk kabel oprettet. (A) lag af et fiberoptisk kabel. (B) Afisoleret fiberoptisk kabel i en Pasteur-pipette. (C) Fiberoptisk kabel i Pasteur pipette placeres ved hjælp af en mikromanipulator.
Figur 2. Sprøjtestøbe skabelon.
Figur 3. (Film 1). Nålen til at knække.
Figur 4. (Film 2). Anbringelse embryoer ind i sprøjtestøbeformen.
ther.within-page = "altid"> 
Figur 5. (Film 3). Injektion 1 nl DNA mix i 1-celle stadie embryo.
Figur 6. Diagram af en monteret zebrafisk larve og repræsentative neuroner involveret i larvestadiet anslagsfølsomt. Zebrafisk larver blev delvist monteret i 1,5% lavtsmeltende agarose (repræsenteret ved stiplede linier omkring rostrum del af larve). A trigeminal neuron (i hovedet) og en Rohon-Beard neuron (i bagagerummet) er vist i rødt. Mauthner celler er skitseret med stiplede linier i larve. Den optisk kabel (hvidt) er vist anbragt over RB neuron cellelegemet.
oad/50184/50184fig7.jpg "alt =" Figur 7 "fo: indhold-bredde =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50184/50184fig7highres.jpg "/>
Figur 7. (Film 4). Aktivering af en enkelt RB neuron expressingChEF fremkalder en adfærdsmæssig reaktion. (A) Still rammer skildrer aktivering af en enkelt RB neuron udtrykker Chef-tdTomato. Enkelte neuroner blev aktiveret ved en 5 msek impuls fra en 473 nm blå laser via en 200 um fiberoptisk kabel. Spænding kørsel den blå laser blev fastsat til et maksimum på 5 volt. Den resulterende adfærd blev registreret ved 1.000 frames per sekund ved en high-speed kamera. (B) Konfokal mikroskopi blev anvendt til at afbilde den aktiverede RB neuron. Arrow viser region stimuleret i adfærd stills. (C) Forstørret billede af RB neuron angivet i (B). Scale bar, 100 pm. (Film 5 og 6) samme fisk, (Movie 5) trigeminal aktivering, (Movie 6) RB neuron løbet æggeblomme forlængelse.p_upload/50184/50184fig7large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Figur 8. Latens af adfærd under variable betingelser. For de fleste eksperimenter vi aktiveret en enkelt neuron i ~ 35 HPF larver udtrykker Chef-tdTomato med 5 msek impuls fra en 473 nm blå laser drevet af en 5 V strømkilde (figur 6). For bedre at forstå dynamikken i Chef aktivering, vi varierede parametre for at fastslå deres effekt på adfærd. (A) Varigheden af lys stimulation (5 msek versus 10 msek) påvirkede ikke latens når kvantificeret fra starten af lyspuls. (B) ved ~ 35 HPF, spænding omvendt påvirker latency. Lavere spænding resulterede i en stigning i latenstid bevægelighed. For vores eksperimenter brugte vi den maksimale spænding (5 V) permissible for vores laser apparat, der udløste pålideligt stereotype adfærd fra de fleste lyst-udtrykkende RB neuroner.
Figur 9. (Film 7). Aktivering af Chef-tdTomato udtrykker RB neuroner i 60 HPF larver. (A) Stillbilleder skildrer aktivering af RB neuroner udtrykker Chef-tdTomato af en 10 msek impuls fra en 473 nm blå laser via en 200 um fiberoptisk kabel. Den resulterende adfærd blev registreret ved 1.000 frames per sekund ved en high-speed kamera. (B) Konfokal mikroskopi blev anvendt til at afbilde den aktiverede RB neuron (s). Arrow viser region stimuleret i adfærd stills. Scale bar, 100 pm.
o: src = "/ files/ftp_upload/50184/50184fig10highres.jpg" />
Figur 10. (Film 8). Aktivering af Chef-tdTomato udtrykker RB neuroner i 4 dpf larver. Stillbilleder skildrer aktivering af RB neuroner udtrykker Chef-tdTomato af en 20 msek impuls fra en 473 nm blå laser via en 200 um fiberoptisk kabel. Den resulterende adfærd blev registreret ved 1.000 frames per sekund med et high-speed kamera.
Movie 1. Klik her for at se film .
Movie 2. Klik her for at se film .
Movie 3. Klik her for at se film .
Movie 4.ttp :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50184/50184movie4.mpg "target =" _blank "> Klik her for at se film.
Movie 5. Klik her for at se film .
Movie 6. Klik her for at se film .
Movie 7. Klik her for at se film .
Movie 8. Klik her for at se film .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en metode til optogenetic aktivering af enkelte RB neuroner i levende zebrafisk. Vores metode anvender forbigående transgenese at udtrykke en fluorescens mærket channelrhodopsin variant, Chef-tdTomato 13, i særlige somatosensoriske neuroner. Denne fremgangsmåde kan let tilpasses til anvendelse i andre larve zebrafisk cellepopulationer.
Brug af denne tilgang, vi konsekvent fremkaldte adfærdsmæssige reaktioner fra 34 til 48 HPF larver udtrykker Chef-tdTomato. Anvendelse af en 5 msek puls af blåt lys ved 5 V, var vi i stand til at aktivere enkelt RB neuroner (fig. 7). Ved at placere den optiske fiber i forskellige punkter langs dyret, fandt vi, at det var nødvendigt at sigte mod det blå lys direkte på en celle organ til at fremkalde en adfærdsmæssig reaktion. Lysimpulser fremkaldte ikke en reaktion fra larver, der ikke udtrykte Chef. Desuden aldrig lysimpulser langs den centrale axon eller det perifere axon fremkaldte et respons, even i unge larver (data ikke vist). Denne egenskab var fordelagtigt, da vi trygt kunne aktivere enkelte neuroner i dyr, hvor flere neuroner blev mærket, selv om de centrale axoner af andre neuroner passerede tæt forbi målrettet neuron celle organ (Film 4-6).
For at teste pålideligheden af metode for vurdering kinematiske parametre, vi fastslået latenstiden for flugt respons (tiden fra lysaktivering til adfærdsmæssig reaktion) mellem 40 og 48 HPF, en parameter, som er kendt for at være yderst stereotyp. At bestemme, om varigheden af lysstimulus påvirker neuron aktivering, vi belyste skive neuroner til 5 eller 10 msek (figur 8A). Da den adfærdsmæssige latens i begge betingelser var de samme, når beregnet fra begyndelsen af lyspulsen, konkluderede vi, at varigheden af lyspulsen ikke påvirker latenstiden for adfærd. Men vi finder, at reducere spændingen øget the latens af en adfærd (figur 8B). Ved 5 V dog mange reaktioner (9 ud af 16 fisk) var 20 ± 5 ms, svarende til latensen rapporteret for naturlige escape reaktioner. Således aktivere neuroner med 5 V nærmer maksimal aktivering.
Parametre for effektivt at fremkalde adfærdsmæssige reaktioner fra aktivering enkelt RB neuroner varierede i ældre larver. Vi har med held fremkaldte adfærdsmæssige reaktioner fra dyr så gammel som 4 dpf, væsentligt senere end tidligere rapporteret. Men medens aktivering af enkelte RB neuroner med en 5 msek lysimpuls ved 5 V konsekvent resulteret i en adfærdsmæssig respons inden 48 HPF, aktivering af ældre larver (> 60 HPF) ikke var så ensartet. Længere impulser (10-100 msek) af lys var ofte nødvendigt at aktivere neuroner i gamle larver (figur 9 og 10, Movie 7 og 8, henholdsvis). Derfor kan aktivering parametre skaloptimeres / kalibreret baseret på forsøgsstadiet.
Den fremgangsmåde vi beskriver her, kan anvendes til mange potentielle anvendelser. Vi benytter denne metode til at definere de adfærdsmæssige reaktioner fremkaldt af forskellige undertyper af neuroner, men det kunne også anvendes til at karakterisere udviklingen af adfærdsmæssige reaktioner, som dyret modnes, virkningerne af narkotika eller mutanter på adfærd eller, i kombination med fysiologi eller billedbehandling, til at karakterisere downstream bliver aktiveret via en identificeret neuron. Omvendt kan inhibitoriske kanaler såsom halorhodopsin, anvendes til at inhibere specifikke neuroner i et neuralt netværk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomisk interesse.
Acknowledgments
Vi takker Fumi Kubo, Tod Thiele og HerwigBaier (UCSF / Max Planck Institute) for rådgivning om adfærd eksperimenter og DPSS laser iværksat; Heesoo Kim og Chiara Cerri fra MBL Neurobiologi Kursus for at bistå i Chef-tdTomato eksperimenter, PetronellaKettunen (Göteborgs Universitet ) for første samarbejde om optogenetic eksperimenter, BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca og John Milligan (UCLA) for teknisk rådgivning og Roger Tsien (UCSD) til Chef-tdTomato konstruere. Dette arbejde blev støttet af en NRSA (5F31NS064817) tildeling til AMSP og en bevilling fra NSF (RIG: 0.819.010) til AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
| Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Petri dish (60x15 mm) | Any | Any | |
| Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
| Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
| Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
| Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
| Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C incubator | any | any | |
| 42 °C heat block | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
| Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
| Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
| Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
| Reagent | |||
| Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| Methylene blue | Fisher | S71325 | |
| Phenol red | Sigma | P4758 | |
| Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
| phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
| Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
| ~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |
||
References
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).
- Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
- Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).
- Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).
- Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).
- Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. , (2012).
- Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
- Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
- Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).
- Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
