Optogenetic तकनीक विशिष्ट न्यूरॉन्स के व्यवहार के लिए योगदान का अध्ययन करने के लिए यह संभव बना दिया है. हम एकल somatosensory एक लेजर डायोड पंप ठोस राज्य (DPSS) के साथ एक channelrhodopsin variant (बावर्ची) को व्यक्त करने और एक वीडियो कैमरा के साथ उच्च गति हासिल व्यवहार रिकॉर्डिंग न्यूरॉन्स सक्रिय करने के लिए लार्वा zebrafish में एक विधि का वर्णन है.
लारवल zebrafish और सरल तंत्रिका सर्किट के विकास कार्य का वर्णन करने के लिए एक मॉडल के रूप में उभर रहे हैं. उनके बाह्य निषेचन, तेजी से विकास, और translucency कारण, zebrafish optogenetic दृष्टिकोण के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल हैं तंत्रिका सर्किट समारोह की जांच की. इस दृष्टिकोण में, प्रकाश के प्रति संवेदनशील आयन चैनल विशिष्ट न्यूरॉन्स में व्यक्त कर रहे हैं, को सक्रिय करने के लिए या करेंगे पर उन्हें रोकना और इस प्रकार विशिष्ट व्यवहार के लिए उनके योगदान का आकलन experimenter सक्षम. लार्वा zebrafish में इन तरीकों को लागू धारणात्मक आसान है, लेकिन तकनीकी जानकारी के अनुकूलन की आवश्यकता है. यहाँ हम लार्वा zebrafish somatosensory न्यूरॉन्स तस्वीर को सक्रिय एकल कोशिकाओं में एक channelrhodopsin संस्करण व्यक्त और जिसके परिणामस्वरूप व्यवहार रिकॉर्डिंग के प्रदर्शन के लिए एक प्रक्रिया है. पहले से स्थापित तरीकों के लिए कुछ संशोधनों को शुरू करके, इस दृष्टिकोण के लिए एक सक्रिय न्यूरॉन्स से व्यवहार प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैकम से कम 4 दिन बाद निषेचन (DPF). विशेष रूप से, हम एक somatosensory न्यूरॉन बढ़ाने, CREST3, का उपयोग करने के लिए टैग channelrhodopsin variant, महाराज tdTomato के अभिव्यक्ति ड्राइव transgene बनाया. Somatosensory न्यूरॉन्स में मोज़ेक अभिव्यक्ति है, जो confocal माइक्रोस्कोपी के साथ imaged किया जा सकता है में एक कोशिका चरण भ्रूण परिणामों में इस transgene इंजेक्शन. रोशन इन जानवरों में एक 473 एनएम DPSS लेजर से प्रकाश के साथ कोशिकाओं, की पहचान एक फाइबर ऑप्टिक केबल के माध्यम से निर्देशित, व्यवहार है कि उच्च गति एक वीडियो कैमरे के साथ दर्ज किया जा सकता है और मात्रात्मक विश्लेषण किया elicits. इस तकनीक अध्ययन किसी भी zebrafish न्यूरॉन सक्रिय द्वारा हासिल व्यवहार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. आनुवंशिक या औषधीय perturbations के साथ इस दृष्टिकोण के संयोजन सर्किट गठन और समारोह की जांच के लिए एक शक्तिशाली तरीका होगा.
को बढ़ावा देने या प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के साथ परिभाषित बाधा neuronal excitability के लिए optogenetic तरीकों के विकास तंत्रिका सर्किट व्यवहार 1, 19, 21 को नियंत्रित करने में न्यूरॉन्स की विशिष्ट आबादी के समारोह का अध्ययन करने के लिए यह संभव बना दिया है. न्यूरॉन्स के समूहों को सक्रिय करने के लिए इस तकनीक को कई बार प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह भी व्यक्तिगत न्यूरॉन्स सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Zebrafish लार्वा विशेष रूप से इन तरीकों के लिए उत्तरदायी हैं क्योंकि वे पारदर्शी हैं, उनके तंत्रिका तंत्र तेजी से विकसित करता है, और ट्रांसजेनिक जानवर बनाने के तेजी से और नियमित है. बहरहाल, महत्वपूर्ण तकनीकी बाधाओं के लिए मज़बूती से न्यूरॉन सक्रियण को प्राप्त करने के लिए दूर किया जाना चाहिए.
एकल zebrafish न्यूरॉन्स की optogenetic सक्रियण के लिए एक प्रक्रिया का अनुकूलन, हम somatosensory न्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित किया. त्रिपृष्ठी न्यूरॉन्स, जो सिर अंदर आना और Rohon दाढ़ी (: Zebrafish लार्वा somatosensory न्यूरॉन्स की दो आबादी का उपयोग उत्तेजनाओं की एक किस्म का पता लगानेआरबी) न्यूरॉन्स, जो शरीर के बाकी अंदर आना. प्रत्येक त्रिपृष्ठी और आरबी न्यूरॉन एक परिधीय अक्षतंतु कि त्वचा में बड़े पैमाने पर शाखाओं उत्तेजनाओं का पता लगाने के लिए और एक केंद्रीय अक्षतंतु है कि नीचे की ओर तंत्रिका सर्किट को जोड़ता परियोजनाओं. पशु के रूप में जल्दी के 21 घंटे के बाद निषेचन (HPF) के रूप में स्पर्श का जवाब है, यह दर्शाता है कि सुसंगत somatosensory सर्किट 5 का गठन किया है, 18. लार्वा के विकास के दौरान कम से कम कुछ त्रिपृष्ठी और आरबी Mauthner सेल पर न्यूरॉन्स synapse क्लासिक भागने प्रतिक्रियाओं को सक्रिय करने के लिए, लेकिन जमते सबूत से पता चलता है कि वहाँ कनेक्टिविटी के विभिन्न पैटर्न है कि 2 भागने व्यवहार, 4 पर बदलाव बटोर सकता है के साथ somatosensory न्यूरॉन्स के कई वर्गों हैं, 10, 12, 14, 15, 16, 17. इस पद्धति के विकास के लिए हमारी प्रेरणा somatosensory न्यूरॉन्स के विभिन्न वर्गों के व्यवहार समारोह को चिह्नित किया गया था, लेकिन इस दृष्टिकोण सिद्धांत रूप में लगभग किसी भी या lar में न्यूरॉन्स की न्यूरॉन आबादी के समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैवैल zebrafish.
डगलस एट अल. पहले सक्रिय करने के लिए एक विधि का वर्णन Channelrhodopsin-2-व्यक्त नीले प्रकाश के साथ somatosensory न्यूरॉन्स, eliciting भागने व्यवहार 3. उनके दृष्टिकोण isl1 जीन से इस्तेमाल करने के लिए एक बढ़ाने तत्व somatosensory न्यूरॉन्स में ChR2 EYFP की अभिव्यक्ति ड्राइव. इस transgene, तथापि, अपेक्षाकृत कमजोर प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करने के लिए, एक दूसरे पत्रकार के सह इंजेक्शन की आवश्यकता के लिए सूचित किया गया था, :: यूएएस GFP, ChR2 EYFP व्यक्त कोशिकाओं के दृश्य की अनुमति देने के लिए. इस दृष्टिकोण के लिए 24-48 HPF के बीच व्यवहार प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन 72 HPF पिछले एक प्रतिक्रिया बटोर कभी नहीं हो सकता. इस प्रकार, जबकि इस विधि बहुत जल्दी लार्वा चरणों (24-48 HPF) में तंत्रिका circuitry का अध्ययन करने के लिए काम करता है, यह बड़े लार्वा, जब अधिक विविध व्यवहार प्रतिक्रियाओं स्पष्ट कर रहे हैं और तंत्रिका सर्किट अधिक परिपक्व हैं में तंत्रिका सर्किट और व्यवहार प्रतिक्रियाओं निस्र्पक के लिए अपर्याप्त है.
हम करने की मांगइस तकनीक की संवेदनशीलता में सुधार के क्रम में लार्वा आरबी न्यूरॉन्स की subpopulations के समारोह विशेषताएँ. करने के लिए अभिव्यक्ति में सुधार के लिए हम एक somatosensory विशिष्ट (CREST3) बढ़ाने 20 Lexa-VP16 की अभिव्यक्ति और Lexa ऑपरेटर (4xLexAop) दृश्यों 11 के एक खंड को ड्राइव करने के लिए एक fluorescently टैग प्रकाश सक्रिय चैनल की अभिव्यक्ति बढ़ाना. यह विन्यास चैनल की अभिव्यक्ति प्रवर्धित, एक दूसरे पत्रकार सह व्यक्त और हमें सीधे प्रत्येक न्यूरॉन में चैनल के रिश्तेदार बहुतायत निर्धारित की अनुमति के लिए नष्ट करने की जरूरत है. Lexa / LexAop अनुक्रम का उपयोग हमें zebrafish संवाददाता लाइनों कि Gal4/UAS प्रणाली का उपयोग करने में transgene शुरू करने के लिए अनुमति के अतिरिक्त लाभ था. Transgene की क्षणिक अभिव्यक्ति अभिव्यक्ति के स्तर बदलती में हुई है, लेकिन आम तौर पर काफी मजबूत करने के लिए कई दिनों से अधिक दोनों सेल शरीर और व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के axonal अनुमानों कल्पना था. Sensitiv का अनुकूलनप्रकाश अल्पसंख्यक हम चैनल महाराज, एक channelrhodopsin variant हेलिक्स पाश एफई 13 में एक विदेशी साइट के साथ एक (Chop1) channelopsin-1 और channelopsin 2 (Chop2) की कल्पना से मिलकर सक्रिय प्रकाश का इस्तेमाल किया. इस चैनल ChR2 के रूप में एक ही तरंग दैर्ध्य में सक्रिय है, लेकिन कम सक्रियण के लिए प्रकाश की तीव्रता की आवश्यकता है, इसे और अधिक ChR2 सहित अन्य चैनलों आमतौर पर इस्तेमाल किया है, की तुलना में अधिक संवेदनशील बनाने के. महाराज प्रोटीन लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, tdTomato से इनकार किया गया था, हमें प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए चैनल को सक्रिय करने के बिना स्क्रीन करने के लिए सक्षम है. एक प्रकाश स्रोत के रूप में, हम एक ठोस राज्य (DPSS) एक फाइबर ऑप्टिक केबल लार्वा के एक विशिष्ट क्षेत्र के लिए एक सटीक, नीले प्रकाश की उच्च स्तरीय पल्स देने के लिए मिलकर लेजर डायोड पंप. यह हमारे व्यक्तिगत न्यूरॉन्स पर लेजर प्रकाश ध्यान केंद्रित करने, दुर्लभ ट्रांसजेनिक एक न्यूरॉन में चैनल व्यक्त जानवरों को खोजने के लिए नष्ट करने की जरूरत है की अनुमति दी. इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम करने के लिए एकल आरबी न्यूरॉन्स सक्रिय करते हैं, व्यवहार प्रतिक्रिया को रिकॉर्ड करने में सक्षम थेएक उच्च गति वीडियो कैमरा, और छवि confocal माइक्रोस्कोपी के साथ उच्च संकल्प में सक्रिय न्यूरॉन्स के साथ है.
हम रहते zebrafish में एक आरबी न्यूरॉन्स की optogenetic सक्रियण के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन किया है. हमारे विधि क्षणिक transgenesis विशिष्ट somatosensory न्यूरॉन्स में एक fluorescently टैग channelrhodopsin संस्करण 13 महाराज tdTomato व्यक्त कार्यरत हैं. ?…
The authors have nothing to disclose.
हम व्यवहार प्रयोगों और DPSS लेजर सेट पर सलाह के लिए Fumi क्युबो, टॉड Thiele और HerwigBaier (UCSF / मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट) धन्यवाद, Heesoo किम और Chiara Cerri महाराज tdTomato प्रयोगों में सहायता के लिए MBL Neurobiology कोर्स (PetronellaKettunen गोटेबोर्ग विश्वविद्यालय ) optogenetic प्रयोगों पर प्रारंभिक सहयोग के लिए, BaljitKhakh, एरिक हडसन, माइक Baca और तकनीकी सलाह के लिए जॉन Milligan (UCLA) और महाराज tdTomato के लिए रोजर Tsien (UCSD) का निर्माण किया. के रूप में यह काम NSF से एक एनआरएसए (5F31NS064817) AMSP और एक अनुदान पुरस्कार (0,819,010 RIG) द्वारा समर्थित किया गया.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
Petri dish (100×15 mm) | Any | Any | |
Petri dish (60×15 mm) | Any | Any | |
Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
28.5 °C incubator | any | any | |
42 °C heat block | Any | Any | |
Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
Reagent | |||
Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
Methylene blue | Fisher | S71325 | |
Phenol red | Sigma | P4758 | |
Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
PTU | Sigma | P7629 | |
Tricaine | Sigma | A5040 | |
blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
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phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
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1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |