Summary
Optogenetic teknikker har gjort det mulig å studere bidraget av spesifikke nerveceller til atferd. Vi beskriver en metode i larve sebrafisk for aktivering enkelt somatosensoriske nevroner uttrykker en channelrhodopsin variant (kokk) med en diode-pumpet solid state (DPSS) laser og registrering av elicited atferd med et høyhastighets videokamera.
Abstract
Larve sebrafisk er fremstår som en modell for å beskrive utvikling og funksjon av enkle nevrale kretser. På grunn av deres ytre befruktning, rask utvikling, og gjennomskinnelighet blir sebrafisk spesielt godt egnet for å undersøke optogenetic tilnærminger nevrale krets funksjon. I denne tilnærmingen, er lys-sensitive ionekanaler uttrykt i bestemte nerveceller, slik at eksperimentator å aktivere eller hemme dem på vilje, og dermed vurdere deres bidrag til spesiell oppførsel. Anvende disse metodene i larve sebrafisk er konseptuelt enkle, men krever optimalisering av tekniske detaljer. Her viser vi en prosedyre for å uttrykke en channelrhodopsin variant i larve sebrafisk somatosensoriske nevroner, foto-aktiverende enkeltceller, og opptak de resulterende atferd. Ved å introdusere noen modifikasjoner til tidligere etablerte metoder, kan denne tilnærmingen brukes til å lokke fram atferdsresponser fra enkle nevroner aktiveres opptil minst 4 dager etter befruktning (DPF). Spesielt har vi opprettet en transgen med en somatosensoriske neuron enhancer, CREST3, for å drive uttrykk for tagget channelrhodopsin variant, kokk-tdTomato. Injisere dette transgenet i 1-celle stadiet embryoer fører mosaikk ekspresjon i somatosensoriske nevroner, som kan avbildes med konfokal mikroskopi. Illuminating identifisert celler hos disse dyrene med lys fra en 473 nm DPSS laser, guidet gjennom en fiberoptisk kabel, utløser atferd som kan tas opp med en high-speed videokamera og analysert kvantitativt. Denne teknikken kan tilpasses til studie atferd elicited ved å aktivere noen sebrafisk neuron. Kombinere denne tilnærmingen med genetiske eller farmakologiske forstyrrelser vil være en effektiv måte å undersøke krets dannelse og funksjon.
Introduction
Utviklingen av optogenetic metoder for å fremme eller hemme neuronal eksitabilitet med definerte bølgelengder av lys har gjort det mulig å studere funksjonen av distinkte populasjoner av nevroner i neural kretser kontrollerende 1 oppførsel, 19, 21. Denne teknikken er ofte brukt til å aktivere grupper av nerveceller, men det kan også brukes til å aktivere enkelte nerveceller. Sebrafisk larver er spesielt mottagelig for disse metodene siden de er gjennomsiktig, utvikler nervesystemet raskt, og skape transgene dyr er rask og rutine. Må imidlertid betydelige tekniske hindrene må overvinnes for å pålitelig oppnå enkelt Nevron aktivering.
For å optimalisere en prosedyre for optogenetic aktivering av enkle sebrafisk nevroner, fokuserte vi på somatosensoriske nerveceller. Sebrafisk larver oppdage en rekke somatosensoriske stimuli ved hjelp av to populasjoner av nerveceller: trigeminal nevroner, som innerverer hodet, og Rohon-Beard (RB) nevroner, som innerverer resten av kroppen. Hver trigeminal og RB neuron projiserer en perifer axon som grener i stor utstrekning i huden for å oppdage stimuli og en sentral axon som kobles til nedstrøms nevrale kretser. Dyr reagerer når du trykker så tidlig som 21 timer etter befruktning (HPF), noe som indikerer at sammenhengende somatosensoriske kretser har dannet 5, 18. Under larveutvikling minst noen trigeminal og RB nevroner synapse på Mauthner celle for å aktivere klassiske flukt svar, men samler bevis tyder på at det er flere klasser av somatosensoriske nevroner med ulike mønstre av tilkoblingsmuligheter som kan lokke fram variasjoner på flukt atferd 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Vår motivasjon for å utvikle denne metoden var å karakterisere de atferdsmessige funksjon av ulike klasser av somatosensoriske nevroner, men denne tilnærmingen kan i prinsippet brukes til å studere funksjonen til nesten alle nervecellen eller populasjon av nevroner i Larval sebrafisk.
Douglass et al. Tidligere beskrevet en fremgangsmåte for aktivering av Channelrhodopsin-2-uttrykkende somatosensoriske nevroner med blått lys, fremlokkende flykte atferd 3. Deres tilnærming brukte en forsterker element fra isl1 genet til å kjøre uttrykk for ChR2-EYFP i somatosensoriske nerveceller. Denne transgenet, ble imidlertid rapportert å vise relativt svak fluorescens, krever samtidig injeksjon av en andre reporter til UAS :: GFP, tillate visualisering av celler som uttrykker ChR2-EYFP. Denne tilnærmingen ble brukt til å lokke fram atferd svar mellom 24-48 HPF, men kunne aldri lokke fram en reaksjon forbi 72 HPF. Således, mens denne metoden fungerer for å studere nevrale kretser på veldig tidlig larvestadier (24-48 HPF), er det utilstrekkelig for å karakterisere nevrale kretser og atferdsmessige reaksjoner på eldre larver, når flere ulike atferdsmessige reaksjoner er tydelige og nevrale kretser er mer moden.
Vi søkt åforbedre følsomheten av denne teknikken for å karakterisere funksjonen av subpopulasjoner av larve RB nerveceller. For å forbedre uttrykk vi brukte en somatosensoriske-spesifikk forsterker (CREST3) 20 for å drive uttrykk for Lexa-VP16 og en strekning av Lexa operatør sekvenser (4xLexAop) 11 å forsterke uttrykk for en fluorescently merket lysaktivert kanal. Denne konfigurasjonen forsterket uttrykk for kanalen, noe som eliminerer behovet for koordinering uttrykker en andre reporter og tillater oss å direkte bestemme den relative overflod av kanalen i hver neuron. Bruke Lexa / LexAop sekvens hadde den ekstra fordelen av å la oss til å introdusere transgene inn sebrafisk reporter linjer som bruker Gal4/UAS system. Forbigående ekspresjon av denne transgenet resulterte i varierende nivåer av uttrykk, men var vanligvis robust nok til å visualisere både cellen kroppen og aksonal projeksjoner av individuelle nevroner over flere dager. For å optimalisere sensitivligheten til å lyse vi brukte lyset aktiveres kanalen kokk, en channelrhodopsin variant som består av et fantasifoster av channelopsin-1 (Chop1) og channelopsin-2 (Chop2) med en crossover nettsted på helix sløyfe EF 13. Denne kanalen er aktivert på samme bølgelengde som ChR2, men krever lavere lysintensitet for aktivering, noe som gjør den mer følsom enn andre brukte kanaler, inkludert ChR2. Kokken protein ble smeltet sammen til den røde fluorescerende protein, tdTomato, slik at vi kan skjerme for protein expression uten å aktivere kanalen. Som lyskilde, vi brukte en diode pumpet solid state (DPSS) laser koplet til en fiberoptisk kabel for å levere en presis, høyeffekts puls av blått lys til en spesifikk region av larvene. Dette tillater oss å fokusere laserlys på individuelle nevroner, som eliminerer behovet for å finne sjeldne transgene dyr som uttrykker en kanal i enkelt neuron. Ved hjelp av denne tilnærmingen, var vi i stand til å aktivere enkelt RB nevroner, ta atferdsresponsens med en høyhastighets videokamera og bilde de aktiverte nevronene i høy oppløsning med konfokalmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forbered følgende forhånd.
1. Forbered Optic Cable
- Registrer oppbevaringsenhet for den optiske kabelen ved smelting avsmalnende hals av et glass Pasteur-pipette over en Bunsen-brenner til å opprette en ~ 150 ° vinkel.
- Ved hjelp av en wire cutter eller et barberblad, må du kutte optisk kabel i to deler. Hver del bør ha en ende med en FC / PC adapter og en eksponert ende. Lagre ett stykke som en reserve-kabel.
- Stripe optisk kabel ned til kapslingen ved å fjerne fiber jakke og styrking fibre (figur 1A) fra 5,0 cm snitt enden av kabelen.
- Sett optisk kabel inn i forberedt Pasteur pipette. Sørg for at kabelen kan enkelt flytte inn og ut av pipettespissen.
- Med optisk kabel som stikker ut fra spissen av Pasteur pipette, må du kutte og fjerne fiber kledning fra rundt glassfiber, ~ 2 mm fra kutt slutten.
- Ved hjelp av en diamant penn / glass cutter, glassfiber nick og bryte off slutten å lage et rent kutt / overflate ved enden av fiberen (figur 1B).
- Trekke optisk kabel inn Pasteur pipette for lagring. Gjenta trinn (1,6) hvis tuppen av optisk fiber blir kuttet eller pauser ujevnt.
- Stilling optisk kabel i Pasteur pipette med en micromanipulator (Figur 1C).
Prosedyrer 2-8 beskriver en metode for å injisere transgener i embryo generelt gjelder for mange sebrafisk eksperimenter. Varianter av denne metode, som de som er beskrevet i andre JOVE videoer 6, 7, 8, 9, 22 er like effektive.
2. Trekk injeksjonsnåler
- Ved hjelp av en nål avtrekker, trekke borsilikatglass rør i to kanyler med en gradvis tips. Puller innstillingene vil variere. (På en Sutter Instruments nål avtrekker bruker vi innstillinger: P = 500, Heat = 720, Trekk = 50, Velocity = 70 og Tid = 150). Hver nål avtrekker er forskjellige, så optimalisere puller innstillinger empirically. For mer konisk nåler, øke varmen og / eller trekk. For mindre koniske nåler, øke tid og / eller redusere Pull.
- Oppbevar nåler i en sikker beholder (dvs. en petriskål med valset tape, selvklebende siden ut).
3. Hell sprøytestøpeformer
- Smelt 0,5 g agarose i 30 ml embryo / blått vann, inntil agarose er helt oppløst.
- Hell over i nedre halvdel av en petriskål.
- Plasser rektangulær form med montering brønner (figur 2) inn i agarose, er forsiktig med å begrense bobledannelse rundt brønnene.
- Tillat agarose å stivne.
- Fjerne mugg og fyll petriskål med blå / embryo vann.
- Lagre oppreist, fylt med rent vann, ved romtemperatur i samme dag bruk eller ved 4 ° C for fremtidig bruk.
4. Gjør Plasmid DNA Mix for injeksjoner
- Fortynn plasmid DNA til en konsentrasjon på 50 ng / pl med 1:10 fenolrødt i DDH 2 O. Foreksempel:
1,0 ml plasmid DNA (250 ng / ml) 0,5 ml fenolrødt 3,5 ml DDH 2 O - DNA blanding kan oppbevares i romtemperatur hvis du bruker umiddelbart eller oppbevares ved 4 ° C i flere dager.
5. Sett opp Mating Pairs
Dette bør gjøres om kvelden før du har tenkt å gjøre injeksjoner.
- Fyll avl tanker med systemet vann og legg mannlige og kvinnelige fisk sammen. Hvis injeksjoner kan ikke utføres så snart lysene slås på i anlegget, separat mannlige og kvinnelige fisk med en skillelinje.
6. Forbered deg på Injeksjoner (Kan gjøres mens du venter på embryo)
- Slå på trykk injektor riggen. Kontroller at systemet er satt til puls. Starte med PULS satt til 1.
- Slå på luftventilen ogJuster trykket injektor til ~ 20 psi.
- Ved hjelp av en dissecting omfang på høyeste forstørrelse, brekke tuppen av nålen med tang eller en poker å opprette en ~ 2 mikrometer åpning (figur 3, Film 1).
- Fyll nåler med DNA blanding av: 1. Plassere nålen, spissen vendt opp, inn i DNA blandingen og la nålen fylles ved kapillarvirkning eller 2. Ved hjelp av en langtrekkende tips pipettere 1-2 pl av DNA bland direkte inn i nålen.
- Sted fylt nål på et trygt sted til den er klar til å injisere.
7. Samle Embryoer
- Etter anlegget lysene har slått på, fjerne skillevegger (hvis aktuelt). Samle embryoer med en sil / liten sil og overføre dem til en petriskål med fersk blå / embryo vann.
8. Injiser embryo på den 1-2 Cell Stage
- Overfør høstet embryoene sprøytestøpeformer ved hjelp av en plast pipette.
- Ved hjelp av en disseksjonsmikroskop, skyv embryoer innbrønner med tang eller en stump poker (figur 4, Movie 2).
- Plasser loaded nål inn i en micromanipulator og posisjon over embryoer.
- Kalibrer injeksjonsvolum ved å justere PULS i 1-trinns intervaller til du oppnår ønsket volum (~ 1 nl). Dette kan bli kalibrert med en mikrometer lysbilde, som beskrevet i en tidligere JOVE videoer 8, 22, men for dette eksperimentet presisjon er ikke nødvendig, siden en rekke injeksjonsvolumer vil resultere i tilstrekkelig uttrykk.
- Injisere ~ 1 nl DNA blande direkte inn i cellen og gjenta for alle embryoer. DNA kan også bli injisert inn i eggeplomme, men dette har en tendens til å være mindre effektiv (Figur 5, Film 3).
- Fjern injisert embryoer fra formen ved hjelp av en svak strøm av blått / embryo vann.
- Butikken injisert embryoer ved 28,5 ° C i mørket.
- Fjern ubefruktet, skadde eller døde embryoer med jevne mellomrom.
- Unn embryo with PTU mellom 18-24 HPF å hindre pigmentering.
9. Screen for transgene uttrykk
- Manuelt dechorionate 24-48 HPF embryo ved hjelp tang.
- Anesthetize larver med 0,02% Tricaine.
- Ved hjelp av et fluorescerende disseksjonsmikroskop, identifisere larver med RB eller trigeminal neuron uttrykk og overføre disse til en ny tallerken med fersk PTU blå / embryo vann. Embryoer med sparsom uttrykk i lett identifiserbare celler er optimale, men individuelle nevroner vil være målrettet for aktivering med en fiberoptisk kabel, slik at en rekke uttrykk tetthet er akseptabelt.
- Lagre befruktede egg ved 28,5 ° C i mørket til ønsket eksperimentelle stadiet.
10. Monter Larver for Behavior Experiments
- Gjør 1,5% lav smelte agarose i DDH 2 O og oppbevar i en 42 ° C varme blokk for å hindre den fra solidifying.
- Ved hjelp av et glass Pasteur pipette, overføring en av de pre-screenet larver i et kare på 1,5% lavt smeltepunkt agarose med så lite blått / embryo vann som mulig.
- Overfør larver i en dråpe av agarose på en liten petriskål.
- Under et disseksjonsmikroskop, posisjon larve dorsal opp.
- Når agarose har befestet, kutte vekk agarose med en tynn barberblad (# 11 skalpell), forlater en kile av agar rundt hele larve.
- Lag to diagonale kutt på hver side av eggeplomme, tar seg ikke å nick larven.
- Fylle området rundt agarose med embryo / blått vann.
- Pull agarose unna stammen og halen av larve (figur 6).
11. Forbered Høyhastighets Camera and Imaging Software
- Monter høyhastighetskamera på dissekere omfang.
- Koble kameraet til datamaskinen.
- Slå på datamaskinen.
- Slå på høyhastighetskamera.
- Åpne video / bildebehandling (Vi bruker AOS bildebehandlingsprogrammer og vil beskrive prosedyrer for å bruke det her, men andre bildebehandlingsprogrammerprogramvare er like akseptabelt).
- Juster kamerainnstillingene deretter (dvs. 1000 bilder per sekund (fps), 50% trigger buffer eller andre foretrukne innstillinger).
- Starte innspillingen.
12. Aktiver Enkelt Neurons Bruke en 473 nm laser
- Fest stimulator, laser og optisk kabel.
- Slå på stimulator.
- Still stimulator til maksimalt 5 volt og en pulsvarighet av 5 msek.
- Slå på laser i henhold til produsentens instruksjoner.
- Bruk et disseksjonsmikroskop for å posisjonere spissen av den optiske kabelen nær celle kroppen av et nevron med Chef-tdTomato uttrykk (figur 6).
- Lever puls av blått lys for å aktivere sensoriske nevron.
- Record atferd ved hjelp av en high-speed kamera satt til 500 eller 1000 bilder per sekund.
- Gjenta eksperimentet som ønsket, venter 1 min mellom hver aktivering for å unngå tilvenning. (Vi registrerer et minimum av tre svar for hver nervecelle).
- Tilutgivelse larver, lirke fra hverandre agarose med tang, tar seg ikke å skade dyret. Dette dyret kan få lov til å utvikle seg videre og prosedyren kan gjentas på en eldre stadium å karakterisere utviklingen av virkemåten. Embryoet kan også monteres på nytt for høyoppløselig konfokal avbildning av aktivert celle å korrelere atferd med cellestruktur, som beskrevet nedenfor.
- Overføre larve til kultur plate med fersk blå / embryo vann. Vi bruker en 24-brønners plate for å holde styr på individuell larver.
13. Bilde Neuron (r) med Confocal Microscope
- Anesthetize larver med 0,02% Tricaine.
- Mount larver, dorsal side opp, i 1,2% lav smelte agarose eller i en dorsal mold.
- Bilde Chef-tdTomato nevroner med en 543 nm laser og egnet filter og objektiv. Vi bruker en 20x objektiv.
- Fjern larver fra agarose og gå tilbake til individuell godt med blå / embryo vann.
- Oppbevares ved 28,5 ° C i mørket for further analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. Optisk kabel satt opp. (A) lagene i en fiberoptisk kabel. (B) Stripped fiberoptisk kabel i en Pasteur pipette. (C) Fiberoptisk kabel i Pasteur pipette posisjonert ved hjelp av en micromanipulator.
Figur 2. Injeksjon mold mal.
Figur 3. (Movie 1). Breaking nålen.
Figur 4. (Movie 2). Plassere embryo i injeksjon mold.
ther.within-page = "always"> 
Figur 5. (Movie 3). Injisere en nl DNA bland inn 1-celle embryo.
Figur 6. Diagram av en montert sebrafisk larve og representative nevroner involvert i larvenes touch respons. Sebrafisk Larvene ble delvis montert i 1,5% lavt smeltepunkt agarose (representert ved stiplede linjer rundt rostral delen av larve). En trigeminal nevron (i hodet) og en Rohon Storskjegg nevron (i bagasjerommet) er avbildet i rødt. Mauthner celler er skissert med stiplede linjer i larve. Den optisk kabel (hvit) er vist plassert over RB neuron cellelegemét.
oad/50184/50184fig7.jpg "alt =" Figur 7 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50184/50184fig7highres.jpg "/>
Figur 7. (Movie 4). Aktivering av en enkelt RB Nevron expressingChEF utløser et atferdsmessig respons. (A) Stillbilder viser aktivering av en enkelt RB nervecellen uttrykker Chef-tdTomato. Enkle nevronene ble aktivert av en 5 msek puls fra en 473 nm blå laser via en 200 mikrometer fiberoptisk kabel. Spenning kjøring blå laser ble satt til et maksimum av 5 volt. Den resulterende atferden ble spilt inn i 1000 bilder per sekund med en high-speed kamera. (B) konfokalmikroskopi ble brukt til å avbilde aktivert RB neuron. Pil viser region stimulert i atferd stillbilder. (C) forstørret bilde av RB nevron indikert i (B). Målestokk, 100 um. (Movie 5 og 6) samme fisk, (Movie 5) trigeminal aktivering, (Movie 6) RB nervecellen i eggeplomme forlengelse.p_upload/50184/50184fig7large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Figur 8. Latensen oppførsel under variable forhold. For de fleste eksperimenter aktivert vi en enkelt neuron i ~ 35 HPF larver uttrykker Chef-tdTomato med en 5 msek puls fra en 473 nm blå laser drevet av en 5 V strømkilde (figur 6). For bedre å forstå dynamikken i Chef aktivering, variert vi parametre for å fastslå deres effekt på atferd. (A) varigheten av lys stimulering (5 msek versus 10 msek) påvirket ikke latency når kvantifisert fra start av lyspuls. (B) På ~ 35 HPF, påvirker spenning omvendt ventetid. Lavere spenninger resulterte i en økning i ventetid av bevegelse. For våre eksperimenter, brukte vi den maksimale spenningen (5 V) permissible for vår laser apparat, som fremkalte pålitelig stereotyp atferd fra de fleste brightly-uttrykker RB nerveceller.
Figur 9. (Movie 7). Aktivering av Chef-tdTomato uttrykke RB nevroner i 60 HPF larver. (A) Still rammer som viser aktivering av RB nevroner uttrykker Chef-tdTomato av en 10 ms puls fra en 473 nm blå laser via en 200 mikrometer fiberoptisk kabel. Den resulterende atferden ble spilt inn i 1000 bilder per sekund med en high-speed kamera. (B) konfokalmikroskopi ble brukt skal avbilde aktiverte RB neuron (s). Pil viser region stimulert i atferd stillbilder. Målestokk, 100 um.
o: src = "/ files/ftp_upload/50184/50184fig10highres.jpg" />
Figur 10. (Movie 8). Aktivering av Chef-tdTomato uttrykke RB nevroner i 4 DPF larver. Stillbilder som viser aktivering av RB nevroner uttrykker Chef-tdTomato av en 20 ms puls fra en 473 nm blå laser via en 200 mikrometer fiberoptisk kabel. Den resulterende atferden ble spilt inn i 1000 bilder per sekund med en high-speed kamera.
Movie 1. Klikk her for å se filmen .
Movie 2. Klikk her for å se filmen .
Movie 3. Klikk her for å se filmen .
Movie 4.ttp :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50184/50184movie4.mpg "target =" _blank "> Klikk her for å se filmen.
Movie 5. Klikk her for å se filmen .
Movie 6. Klikk her for å se filmen .
Movie 7. Klikk her for å se filmen .
Movie 8. Klikk her for å se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en tilnærming for optogenetic aktivering av enkle RB nevroner i levende sebrafisk. Vår metode benytter forbigående transgenesis å uttrykke en fluorescently merket channelrhodopsin variant, kokk-tdTomato 13, i bestemte somatosensoriske nerveceller. Denne tilnærmingen kan lett tilpasses for bruk i andre larve sebrafisk cellepopulasjoner.
Ved hjelp av denne tilnærmingen vi konsekvent fremkalte atferdsresponser 34-48 HPF larver uttrykker Chef-tdTomato. Ved hjelp av en 5 ms puls av blått lys på 5 V, var vi i stand til å aktivere enkelt RB nevroner (figur 7). Ved å plassere den optiske fiber på ulike punkter langs dyret, fant vi ut at det var nødvendig å sikte den blå lys direkte på en celle kropp å lokke fram en atferdsmessig respons. Lyspulser ikke lokke fram en reaksjon fra larver som ikke uttrykke kokk. I tillegg, lyspulser langs sentrale axon eller det perifere axon aldri elicited et svar, even i ung larver (data ikke vist). Denne egenskapen var en fordel siden vi kunne trygt aktivere enkelt nevroner i dyr der flere nevroner ble merket, selv om de sentrale axons av andre nerveceller passerte nær målrettet nevronets cellen kroppen (Movie 4-6).
For å teste påliteligheten av tilnærming for å vurdere kinematiske parametrene, bestemt vi latency på flukt respons (tiden fra lysaktivering til atferdsresponsen) mellom 40 og 48 HPF, en parameter som er kjent for å være svært stereotype. Å bestemme om varigheten av lys stimulans påvirker nevron aktivering, belyst vi målretter nevroner for 5 eller 10 msek (Figur 8A). Siden atferdsmessige latens i begge tilstander var de samme når beregnes fra starten av den lyspuls, konkluderte vi at varigheten av lyspulsen ikke påvirket latency atferd. Men vi finner at å redusere spenningen økte the ventetid på en atferd (figur 8B). På 5 V imidlertid mange svar (9 av 16 fisk) var 20 ± 5 ms, lik ventetid rapportert for naturlige escape svar. Dermed aktivere nevronene med 5 V nærmer maksimal aktivering.
Parametere for effektivt fremlokkende atferdsresponser fra å aktivere enkelt RB nevroner varierte i eldre larver. Vi lykkes fremkalte atferdsresponser fra dyr så gammel som 4 DPF, vesentlig senere enn tidligere rapportert. Men mens aktivering av single RB nevroner med en 5 msek lyspuls ved 5 V konsekvent resulterte i en atferdsresponsen før 48 HPF, aktivering av eldre larver (> 60 HPF) var ikke så konsekvent. Lengre pulser (10-100 msek) av lys var ofte nødvendig å aktivere neuroner i eldre larver (figur 9 og 10, film 7 og 8, respektivt). Derfor kan aktivisering parametere måoptimaliseres / kalibrert basert på eksperimentelle stadiet.
Tilnærmingen vi beskriver her kunne brukes til mange potensielle bruksområder. Vi bruker denne metoden for å definere de atferdsmessige responser utløst av forskjellige subtyper av nevroner, men det kan også bli benyttet for å karakterisere utviklingen av atferdsresponser som dyret modnes, virkningene av medikamenter eller mutanter på oppførsel, eller, i kombinasjon med fysiologi eller bildebehandling, å karakterisere nedstrøms kretser aktiveres av en identifisert neuron. Omvendt, en hemmende kanaler, for eksempel halorhodopsin, bli brukt til å inhibere bestemte nevroner innenfor et nettverk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomisk interesse.
Acknowledgments
Vi takker Fumi Kubo, Tod Thiele og HerwigBaier (UCSF / Max Planck Institute) for råd om atferd eksperimenter og DPSS laser satt opp, Heesoo Kim og Chiara Cerri fra MBL nevrobiologi Kurs for å bistå i Chef-tdTomato eksperimenter; PetronellaKettunen (Göteborgs Universitet ) for første samarbeid om optogenetic eksperimenter; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca og John Milligan (UCLA) for teknisk rådgivning, og Roger Tsien (UCSD) for kokk-tdTomato konstruere. Dette arbeidet ble støttet av en NRSA (5F31NS064817) prisen til AMSP og et stipend fra NSF (RIG: 0819010) til AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
| Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Petri dish (60x15 mm) | Any | Any | |
| Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
| Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
| Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
| Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
| Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C incubator | any | any | |
| 42 °C heat block | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
| Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
| Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
| Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
| Reagent | |||
| Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| Methylene blue | Fisher | S71325 | |
| Phenol red | Sigma | P4758 | |
| Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
| phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
| Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
| ~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |
||
References
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).
- Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
- Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).
- Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).
- Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).
- Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. , (2012).
- Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
- Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
- Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).
- Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
