Summary
Optogenetic techniques ont permis d'étudier la contribution des neurones spécifiques de comportement. Nous décrivons une méthode larvaire chez le poisson zèbre pour l'activation de simples neurones somatosensoriels exprimant une variante channelrhodopsin (Chef) avec un pompé par diode à l'état solide (DPSS) laser et d'enregistrer les comportements suscité avec une caméra vidéo à grande vitesse.
Abstract
Le poisson-zèbre larvaires sont en train de devenir un modèle pour décrire le développement et la fonction de simples circuits neuronaux. En raison de leur fécondation externe, développement rapide, et la translucidité, le poisson zèbre sont particulièrement bien adaptés pour les approches optogenetic pour étudier la fonction des circuits neuronaux. Dans cette approche, les canaux ioniques sensibles à la lumière sont exprimés dans les neurones spécifiques, permettant à l'expérimentateur d'activer ou d'inhiber les modifier à volonté et ainsi évaluer leur contribution à des comportements spécifiques. L'application de ces méthodes chez le poisson zèbre larvaire est conceptuellement simple mais nécessite l'optimisation des détails techniques. Ici, nous démontrons une procédure pour exprimer une variante channelrhodopsin dans les neurones somatosensoriels larves de poisson zèbre, photo-activation des cellules individuelles, et d'enregistrer les comportements qui en découlent. En introduisant quelques modifications aux méthodes établies précédemment, cette approche pourrait être utilisée pour obtenir des réponses comportementales de neurones isolés activés jusqu'àd'au moins 4 jours post-fécondation (DPF). Plus précisément, nous avons créé un transgène l'aide d'un neurone somatosensoriel amplificateur, CREST3, pour diriger l'expression de la variante marquée channelrhodopsin, chef-tdTomato. L'injection de ce transgène dans embryons en stade 1-cellule se traduit par l'expression dans les neurones de la mosaïque somesthésiques, qui peut être imagé par microscopie confocale. Illuminating identifié les cellules de ces animaux avec de la lumière provenant d'un laser DPSS nm 473, guidé par un câble à fibre optique, suscite des comportements qui peuvent être enregistrées avec une caméra vidéo à grande vitesse et analysés quantitativement. Cette technique pourrait être adapté à l'étude des comportements suscités par l'activation de n'importe quel neurone poisson zèbre. En combinant cette approche avec des perturbations génétiques ou pharmacologiques sera un moyen puissant pour étudier la formation des circuits et de la fonction.
Introduction
Le développement de méthodes optogenetic pour favoriser ou inhiber l'excitabilité neuronale des longueurs d'onde de la lumière défini a permis d'étudier la fonction des populations distinctes de neurones dans les circuits neuronaux contrôlant le comportement 1, 19, 21. Cette technique est souvent utilisée pour activer des groupes de neurones, mais il peut aussi être utilisé pour activer des neurones individuels. Embryons de poisson zèbre sont particulièrement favorables à ces méthodes car elles sont translucides, leur système nerveux se développe rapidement, et la création d'animaux transgéniques est rapide et la routine. Toutefois, d'importants obstacles techniques doivent être surmontés pour atteindre de manière fiable activation seul neurone.
Pour optimiser une procédure pour l'activation des neurones optogenetic poisson zèbre simples, nous nous sommes concentrés sur les neurones somatosensoriels. Embryons de poisson zèbre détecter une variété de stimuli somatosensoriels l'aide de deux populations de neurones: les neurones du trijumeau, qui innervent la tête, et Rohon-Barbe (RB), les neurones qui innervent le reste du corps. Chaque neurone du trijumeau et RB projette un axone périphérique qui se ramifie abondamment dans la peau pour détecter des stimuli et un axone central qui se connecte à circuits neuronaux en aval. Animaux réagissent au toucher dès 21 heures après la fécondation (HPF), indiquant que les circuits cohérents somatosensoriels ont formé 5, 18. Au cours du développement larvaire au moins une synapse du trijumeau et RB neurones sur la cellule de Mauthner pour activer réactions de fuite classiques, mais l'accumulation de preuves suggère qu'il existe plusieurs classes de neurones somatosensoriels avec différents modèles de connectivité qui peuvent susciter des variations sur le comportement Escape 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. Notre motivation pour développer cette méthode était de caractériser la fonction du comportement des différentes classes de neurones somatosensoriels, mais cette approche pourrait en principe être utilisée pour étudier la fonction des neurones presque toute ou d'une population de neurones dans larval poisson zèbre.
Douglass et al. Précédemment décrit un procédé d'activation channelrhodopsin-2-exprimer neurones somatosensoriels avec la lumière bleue, provoquant 3 Comportement fuite. Leur approche utilisée un élément activateur du gène Isl1 pour diriger l'expression de ChR2-EYFP dans les neurones somatosensoriels. Ce transgène, cependant, a été signalé pour afficher une fluorescence relativement faible, ce qui nécessite la co-injection d'un deuxième rapporteur, SAMU :: GFP, pour permettre la visualisation des cellules exprimant ChR2-EYFP. Cette approche a été utilisée pour obtenir des réponses de comportement entre 24-48 hpf, mais n'a jamais pu obtenir une réponse cours des dernières 72 hpf. Ainsi, bien que cette méthode fonctionne pour l'étude de circuits neuronaux à très premiers stades larvaires (24-48 hpf), elle est insuffisante pour caractériser les circuits neuronaux et des réponses comportementales dans les larves plus âgées, quand plus diverses réactions comportementales sont apparentes et les circuits neuronaux sont plus matures.
Nous avons cherché àaméliorer la sensibilité de cette technique dans le but de caractériser la fonction de sous-populations de neurones RB larvaires. Pour améliorer l'expression on utilise un activateur spécifique somesthésiques (CREST3) 20 pour diriger l'expression de LexA-VP16 et un tronçon de séquences d'opérateurs LexA (4xLexAop) 11 pour amplifier l'expression d'un marquées par fluorescence canal activé par la lumière. Cette configuration amplifié expression du canal, ce qui élimine la nécessité d'une co-expression d'un journaliste de seconde et qui nous permet de déterminer directement l'abondance relative de la voie dans chaque neurone. En utilisant la séquence LexA / LexAop a l'avantage supplémentaire de permettre d'introduire le transgène dans des lignes de reporter poisson zèbre qui utilisent le système Gal4/UAS. L'expression transitoire de ce transgène donné lieu à différents niveaux d'expression, mais était généralement assez robuste pour visualiser à la fois le corps cellulaire et les projections axonales des neurones individuels sur plusieurs jours. Pour optimiser la sensibilitélité à la lumière, nous avons utilisé la lumière activée canal chef, une variante channelrhodopsin constitué d'une chimère de channelopsin-1 (Chop1) et channelopsin-2 (Chop2) avec un site de liaison à une hélice boucle EF 13. Ce canal est activé à la même longueur d'onde que ChR2, mais nécessite plus faible intensité lumineuse pour l'activation, la rendant plus sensible que les autres canaux couramment utilisés, y compris ChR2. La protéine chef était fusionnée à la protéine fluorescente rouge, tdTomato, ce qui nous permet de cribler l'expression de protéines sans activer le canal. Comme une source de lumière, nous avons utilisé un pompé par diode à semi-conducteurs (DPSS) laser couplé à un câble à fibre optique pour offrir une précision, une grande puissance d'impulsion de lumière bleue à une région spécifique des larves. Cela nous a permis de focaliser la lumière laser sur les neurones individuels, éliminant ainsi la nécessité de trouver de rares animaux transgéniques exprimant le canal en un seul neurone. En utilisant cette approche, nous avons réussi à activer les neurones RB simples, enregistrer la réponse comportementales avec une caméra vidéo à grande vitesse, et les neurones d'image à haute résolution activés par microscopie confocale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Préparez les éléments suivants à l'avance.
1. Préparer câble optique
- Créer une unité de stockage pour le câble optique en faisant fondre le col effilé d'une pipette Pasteur en verre sur un bec Bunsen à créer un angle de 150 °.
- En utilisant une pince coupante ou une lame de rasoir, coupez soigneusement le câble optique en deux morceaux. Chaque pièce doit avoir une extrémité avec un FC / PC adaptateur et une extrémité exposée. Stocker une seule pièce comme un câble de réserve.
- Dénuder le câble optique vers le revêtement en enlevant la gaine de fibre et de fibres de renforcement (figure 1A) à partir de 5,0 cm de coupe d'extrémité du câble.
- Insérez le câble optique dans préparées pipette Pasteur. Assurez-vous que le câble peut facilement se déplacer dans et hors de la pointe de pipette.
- Avec le câble optique en saillie de l'extrémité de la pipette Pasteur, découpez soigneusement et retirez gaine de la fibre de partout fibre de verre, ~ 2 mm du bout coupé.
- L'utilisation de diamants stylo / tailleur de verre, la fibre de verre pseudo et briser off l'extrémité de créer une coupe nette / surface à l'extrémité de la fibre (figure 1B).
- Rentrer câble optique dans une pipette Pasteur pour le stockage. Répétez l'étape (1,6) si l'extrémité de la fibre optique se ébréchée ou les pauses de façon inégale.
- Position du câble optique dans une pipette Pasteur en utilisant un micromanipulateur (figure 1C).
Procédures 2-8 décrivent un procédé d'injection de transgènes dans des embryons généralement applicables aux expériences de poisson zèbre nombreux. Des variantes de cette méthode, comme celles décrites dans d'autres vidéos Jove 6, 7, 8, 9, 22 sont tout aussi efficaces.
2. Tirer aiguilles d'injection
- L'utilisation d'un tire-aiguille, tirez un tube de verre borosilicate en deux aiguilles d'injection avec une pointe de diminuer progressivement. Extracteur paramètres varient. (Sur un extracteur d'aiguilles Sutter Instruments, nous utilisons les paramètres: P = 500, chaleur = 720, Pull = 50, vitesse = 70 et de l'heure = 150). Chaque extracteur d'aiguilles est différent, donc d'optimiser les paramètres de traction emempiriquement. Pour plus d'aiguilles effilées, augmenter la chaleur et / ou tirer. Pour aiguilles coniques moins, augmenter le temps et / ou Pull baisse.
- Aiguilles Stocker dans un conteneur sécurisé (soit une boîte de Pétri avec du ruban laminé, sur le côté adhésif).
3. Verser moules d'injection
- Faire fondre 0,5 g d'agarose dans 30 ml d'embryon / eau bleue, jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissous.
- Verser dans la moitié inférieure de la boîte de Pétri.
- Placez moule rectangulaire avec fixation puits (figure 2) en agarose, en prenant soin de limiter la formation de bulles autour des puits.
- Permettre d'agarose à se solidifier.
- Retirer du moule et remplir boîte de Pétri avec du bleu / eau embryon.
- Conservez-les debout, rempli avec de l'eau propre, à la température ambiante pour le jour même ou à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.
4. Assurez-Mix ADN plasmidique pour préparations injectables
- Diluer l'ADN plasmidique à une concentration de 50 ng / ul avec rouge de phénol à 1:10 dans ddH 2 O. Pourexemple:
1,0 ml ADN plasmidique (250 ng / ml) 0,5 ml rouge phénol 3,5 ml ddH 2 O - Mélange d'ADN peuvent être conservés à température ambiante si vous utilisez immédiatement ou conservés à 4 ° C pendant plusieurs jours.
5. Mettre en place paires d'accouplement
Cela devrait être fait le soir avant de vous envisagez de faire des injections.
- Remplir les réservoirs d'élevage avec de l'eau du système et le lieu poissons mâles et femelles ensemble. Si les injections ne peut être effectuée dès que s'allument dans l'établissement, distinct poissons mâles et femelles avec un diviseur.
6. Préparer pour préparations injectables (Peut être fait dans l'attente d'embryons)
- Mettez la pression d'injection plate-forme. Assurez-vous que le système est mis à pulser. Commencez par le jeu durée d'impulsion à 1.
- Ouvrir le robinet et AIRRégler la pression d'injection à environ 20 psi.
- En utilisant un microscope à dissection au plus fort grossissement, briser pointe de l'aiguille avec une pince ou un tisonnier pour créer une ouverture ~ um 2 (figure 3, Film 1).
- Remplir avec le mélange de l'ADN aiguilles par: 1. Placer le côté de la pointe d'aiguille, le haut, dans le mélange d'ADN et de laisser l'aiguille remplir par capillarité ou 2. En utilisant une pointe longue portée à pipeter 1-2 pl de l'ADN mélanger directement dans l'aiguille.
- Endroit rempli aiguille dans un endroit sûr avant d'être prêt à injecter.
7. Recueillir des embryons
- Après l'installation lumières ont allumé, retirez diviseurs (le cas échéant). Recueillir des embryons avec une passoire / tamis petites et les transférer sur une boîte de Pétri avec du bleu frais / eau embryon.
8. Injecter embryons au stade 1-2 cellules
- Transfert d'embryons récoltés pour moules d'injection en utilisant une pipette en plastique.
- En utilisant un microscope à dissection, poussez doucement embryons danspuits avec une pince ou un tisonnier contondant (figure 4, Film 2).
- Placez aiguille chargée dans un micromanipulateur et la position sur les embryons.
- Calibrer le volume d'injection en ajustant la durée d'impulsion de 1 par incréments jusqu'à obtenir le volume souhaité (~ 1 nl). Cela pourrait être étalonné avec un micromètre, tel que décrit dans une des vidéos précédentes Jove 8, 22, mais pour cette précision expérience n'est pas nécessaire, car un grand nombre de volumes d'injection se traduira par une expression adéquate.
- Injecter environ 1 nl ADN mélanger directement dans la cellule et répétez l'opération pour tous les embryons. L'ADN peut également être injecté dans le jaune, mais cela tend à être moins efficace (Figure 5, Film 3).
- Retirer embryons injectés de moule à l'aide d'un léger courant d'un bleu / eau embryon.
- Magasin injecté embryons à 28,5 ° C dans l'obscurité.
- Retirez non fécondés, les embryons endommagés ou morts périodiquement.
- Traiter embryons wie PTU entre 18-24 hpf pour prévenir la pigmentation.
9. Ecran pour l'expression du transgène
- Manuellement dechorionate 24-48 embryons HPF aide d'une pince.
- Anesthésier les larves en utilisant 0,02% tricaïne.
- En utilisant un microscope à fluorescence de dissection, identifier les larves avec RB ou l'expression faciale des neurones et les transférer vers un nouveau plat avec des produits frais PTU bleu / embryons eau. Embryons avec une expression rare dans les cellules facilement identifiables sont optimales, mais les neurones individuels seront ciblés pour l'activation d'un câble à fibre optique ainsi un large éventail de la densité d'expression est acceptable.
- Embryons Boutique à 28,5 ° C dans l'obscurité jusqu'à ce stade de l'expérimentation souhaitée.
10. Montez les larves pour les expériences de comportement
- Assurez 1,5% d'agarose bas point de fusion dans le trou DDH 2 O et le ranger dans un bloc de 42 ° C de chaleur pour l'empêcher de se solidifier.
- L'utilisation d'un pipette Pasteur en verre, le transfert de l'un des larves pré-sélectionnés dans une baignoiree de 1,5% d'agarose à bas fondue avec aussi peu bleu / embryon d'eau que possible.
- Transfert des larves dans une goutte d'agarose sur une petite boîte de Petri.
- Sous une loupe binoculaire, jusqu'à la position dorsale larve.
- Lorsque agarose est solidifié, couper le agarose avec une lame de rasoir mince (# 11 scalpel), en laissant un coin de la gélose autour de la larve entière.
- Effectuer deux coupes en diagonale de chaque côté du jaune, prenez soin de ne pas entailler la larve.
- Remplir la zone entourant l'embryon d'agarose / eau bleue.
- Tirez agarose loin du tronc et de la queue de la larve (figure 6).
11. Préparer Caméras grande vitesse et du logiciel d'imagerie
- Montez à haute vitesse caméra sur la dissection étendue.
- Connectez l'appareil photo à l'ordinateur.
- Allumez l'ordinateur.
- Allumez caméra haute vitesse.
- Ouvert vidéo / logiciels d'imagerie (Nous utilisons un logiciel d'imagerie AOS et décriront les procédures pour l'utiliser ici, mais d'imagerielogiciel est également acceptable).
- Réglez les paramètres de la caméra en conséquence (soit 1.000 images par seconde (fps), le tampon de déclenchement de 50% ou d'autres paramètres de préférence).
- Démarrez l'enregistrement.
12. Activer neurones unique à l'aide d'un laser nm 473
- Fixez stimulateur, laser et optiques.
- Mettez le stimulateur.
- Stimulateur fixé à un maximum de 5 volts et une durée d'impulsion de 5 ms.
- Allumez le laser selon les instructions du fabricant.
- Utiliser un microscope à dissection de positionner la pointe du câble optique près du corps cellulaire d'un neurone avec le chef-tdTomato expression (Figure 6).
- Livrer impulsion de lumière bleue pour activer des neurones sensoriels.
- Comportement d'enregistrement à l'aide d'une caméra à grande vitesse fixée à 500 ou 1000 images par seconde.
- Répétez l'expérience en tant souhaitée, attendre 1 min entre chaque activation afin d'éviter l'accoutumance. (On enregistrer au moins trois réponses pour chaque neurone).
- Àlarves libération, essayer de séparer les agarose avec une pince, en prenant soin de ne pas blesser l'animal. Cet animal peut être autorisé à développer davantage et la procédure peut être répétée à une ancienne étape pour caractériser le développement du comportement. L'embryon peut également être remonté à haute résolution imagerie confocale de la cellule activée pour corréler le comportement de la structure cellulaire, comme décrit ci-dessous.
- Transfert larve de plaque de culture avec du bleu frais / eau embryon. Nous utilisons une plaque de 24 puits de garder une trace des larves individu.
13. Image Neuron (s) avec un microscope confocal
- Anesthésier les larves avec 0,02% tricaïne.
- Larves de montage, la face dorsale en place, en 1,2% d'agarose à bas ou à l'état fondu dans un moule dorsale.
- Image Chef-tdTomato neurones avec un laser 543 nm et d'un filtre appropriée et objective. Nous utilisons un objectif 20x.
- Retirer les larves d'agarose et revenir à l'individu bien avec le bleu / eau embryon.
- Entreposer à 28,5 ° C dans l'obscurité pendant fuanalyse rther.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figure 1. Câble à fibres optiques mis en place. (A) Couches d'un câble à fibre optique. (B) câble à fibres optiques Stripped dans une pipette Pasteur. (C) Câble en fibre optique dans une pipette Pasteur positionné à l'aide d'un micromanipulateur.
Figure 2. Modèle de moule d'injection.
Figure 3. (Vidéo 1). Casser l'aiguille.
Figure 4. (Vidéo 2). Placer les embryons dans le moule d'injection.
ther.within pages = "always"> 
Figure 5. (Vidéo 3). L'injection de 1 nl ADN mélange dans 1-cellule embryon au stade.
Figure 6. Schéma d'une larve de poisson zèbre monté et représentatives neurones impliqués dans la réponse au toucher larvaire. Zebrafish larves ont été partiellement monté dans 1,5% d'agarose à bas l'état fondu (représentée en traits pointillés entourant la partie rostrale de la larve). Un neurone trijumeau (dans la tête) et un neurone Rohon-Barbe (dans le coffre) sont représentées en rouge. Mauthner cellules sont délimitées par des lignes en pointillés dans la larve. Le câble optique (blanc) est représenté positionné sur le corps cellulaire du neurone RB.
oad/50184/50184fig7.jpg "alt =" Figure 7 "fo: content-width =" 5po "fo: src =" / files/ftp_upload/50184/50184fig7highres.jpg "/>
Figure 7. (Film 4). L'activation d'un neurone unique expressingChEF RB suscite une réponse comportementale. (A) Nature des cadres représentant l'activation d'un neurone unique RB exprimer chef-tdTomato. Neurones isolés ont été activés par une impulsion de 5 ms à partir de 473 nm d'un laser bleu par l'intermédiaire d'un câble à fibres optiques 200 um. Tension d'excitation du laser bleu a été fixé à un maximum de 5 volts. Le comportement résultant a été enregistré à 1.000 images par seconde par une caméra à grande vitesse. (B) La microscopie confocale a été utilisée pour l'image du neurone activé RB. La flèche indique région stimulée dans des alambics de comportement. (C) l'image agrandie de RB neurone indiqué en (B). La barre d'échelle, 100 um. (Film 5 et 6) même poisson, (Film 5) activation du trijumeau, (Film 6) RB neurone sur l'extension du jaune.p_upload/50184/50184fig7large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
Figure 8. La latence du comportement dans des conditions variables. Pour la plupart des expériences, nous avons activé un seul neurone dans ~ 35 larves hpf exprimer chef-tdTomato avec une impulsion de 5 ms nm d'un laser bleu 473 entraîné par une source d'alimentation de 5 V (figure 6). Afin de mieux comprendre la dynamique de l'activation du chef, nous avons fait varier les paramètres afin de déterminer leur effet sur le comportement. (A) La durée de la stimulation lumineuse (5 ms contre 10 ms) n'affecte pas la latence lors quantifié à partir du début de l'impulsion lumineuse. (B) A ~ 35 hpf, la tension affecte inversement latence. Des tensions plus faibles a entraîné une augmentation de la latence du mouvement. Pour nos expériences, nous avons utilisé le maximum de tension (5 V) permissible de notre appareil laser, ce qui a suscité des comportements stéréotypés fiable de la plupart des neurones exprimant RB vives.
Figure 9. (Film 7). Activation de Chef-tdTomato neurones exprimant RB dans 60 larves hpf. (A) des images fixes représentant l'activation des neurones exprimant RB chef-tdTomato par une impulsion de 10 ms de 473 nm d'un laser bleu par l'intermédiaire d'un câble à fibre optique 200 um. Le comportement résultant a été enregistré à 1.000 images par seconde par une caméra à grande vitesse. (B) La microscopie confocale a été utilisée pour l'image de l'actif RB neurone (s). La flèche indique région stimulée dans des alambics de comportement. La barre d'échelle, 100 um.
o: src = "/ files/ftp_upload/50184/50184fig10highres.jpg" />
Figure 10. (Film 8). Activation de Chef-tdTomato neurones exprimant RB dans 4 larves dpf. Still images illustrant l'activation des neurones exprimant RB chef-tdTomato par une impulsion de 20 ms nm d'un laser bleu 473 via un câble à fibre optique 200 um. Le comportement résultant a été enregistré à 1.000 images par seconde avec une caméra à haute vitesse.
Film 1. Cliquez ici pour voir le film .
Movie 2. Cliquez ici pour voir le film .
Movie 3. Cliquez ici pour voir le film .
Movie 4.ttp :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50184/50184movie4.mpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour voir le film.
Film 5. Cliquez ici pour voir le film .
Film 6. Cliquez ici pour voir le film .
Film 7. Cliquez ici pour voir le film .
Film 8. Cliquez ici pour voir le film .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nous avons décrit une approche pour l'activation des neurones optogenetic RB simples chez le poisson zèbre en direct. Notre méthode utilise la transgenèse transitoire pour exprimer une variante marquées par fluorescence channelrhodopsin, chef-tdTomato 13, dans certains neurones somatosensoriels. Cette approche pourrait être facilement adapté pour une utilisation dans d'autres larves de poisson zèbre populations cellulaires.
En utilisant cette approche nous avons toujours obtenu des réponses comportementales de 34 à 48 larves hpf exprimer chef-tdTomato. L'utilisation d'un 5 ms d'impulsion de lumière bleue à 5 V, nous avons réussi à activer les neurones RB simples (figure 7). En positionnant la fibre optique à différents points le long de l'animal, nous avons constaté qu'il était nécessaire de viser la lumière bleue directement à un corps cellulaire pour induire une réponse comportementale. Impulsions de lumière n'a pas suscité une réponse de larves qui n'ont pas exprimé chef. En outre, des impulsions lumineuses le long de l'axone central ou de l'axone périphérique n'a jamais suscité une réaction, eême dans les jeunes larves (données non présentées). Cette propriété est avantageuse, car nous pourrions avec confiance activer des neurones simples dans les animaux chez lesquels multiples neurones ont été marqués, même si les axones des neurones centraux d'autres passa près du corps cellulaire du neurone ciblé (Vidéo 4-6).
Pour tester la fiabilité de la méthode d'évaluation des paramètres cinématiques, nous avons déterminé la latence de la réponse de fuite (le temps d'activation par la lumière de la réponse comportementale) entre 40 et 48 hpf, un paramètre qui est connu pour être très stéréotypés. Pour déterminer si la durée de stimulus lumineux influence l'activation neuronale, nous avons allumé neurones cibles pour 5 ou 10 ms (figure 8A). Depuis le temps de latence du comportement dans les deux conditions sont les mêmes lorsqu'il est calculé à partir du début de l'impulsion lumineuse, on a conclu que la durée de l'impulsion lumineuse ne pas influencer le comportement de temps de latence. Cependant, nous avons constaté que la réduction de la tension accrue èmee temps de latence d'un comportement (figure 8B). À 5 V, cependant, de nombreuses réponses (9 sur 16 poissons) était de 20 ± 5 ms, le temps de latence similaire à rapporté des réponses d'échappement naturelles. Ainsi, l'activation des neurones à 5 V s'approche activation maximale.
Paramètres pour susciter efficacement les réponses comportementales de l'activation des neurones RB simples varié dans les larves plus âgées. Nous avons réussi a suscité des réactions comportementales des animaux aussi vieux que 4 dpf, beaucoup plus tard que ce qui était indiqué précédemment. Cependant, alors que l'activation des neurones RB simples avec une impulsion de 5 ms léger à 5 V systématiquement donné lieu à une réponse comportementale avant 48 hpf, l'activation des larves plus âgées (> 60 hpf) n'était pas aussi cohérente. Impulsions plus longues (10-100 ms) de la lumière sont souvent nécessaires pour activer les neurones dans les larves plus âgées (figure 9 et 10, Film 7 et 8, respectivement). Par conséquent, les paramètres d'activation peut être nécessaire deêtre optimisées / calibrées en fonction du stade expérimental.
L'approche que nous décrivons ici peut être utilisé pour de nombreuses applications potentielles. Nous utilisons cette méthode pour définir les réponses comportementales provoquées par différents sous-types de neurones, mais il pourrait également être utilisé pour caractériser le développement des réponses comportementales que l'animal arrive à maturité, les effets des drogues sur le comportement ou les mutants, ou, en combinaison avec la physiologie ou d'imagerie, afin de caractériser les circuits en aval activés par un neurone identifié. A l'inverse, inhibiteurs des canaux, tels que halorhodopsin, pourrait être utilisé pour inhiber les neurones spécifiques au sein d'un réseau de neurones.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions Fumi Kubo, Tod Thiele et HerwigBaier (UCSF / Institut Max Planck) pour obtenir des conseils sur des expériences de comportement et DPSS laser mis en place; Heesoo Kim et Chiara Cerri du parcours de MBL Neurobiologie pour aider à Chef-tdTomato expériences; PetronellaKettunen (Université de Göteborg ) pour la collaboration initiale sur les expériences optogenetic; BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike et John Milligan Baca (UCLA) pour obtenir des conseils techniques, et Roger Tsien (UCSD) pour le chef-tdTomato construire. Ce travail a été soutenu par un NRSA (5F31NS064817) prix à AMSP et une subvention de la NSF (RIG: 0819010) à l'AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
| Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
| Petri dish (100x15 mm) | Any | Any | |
| Petri dish (60x15 mm) | Any | Any | |
| Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
| Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
| Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
| Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
| Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C incubator | any | any | |
| 42 °C heat block | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
| Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
| Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
| Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
| Reagent | |||
| Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| Methylene blue | Fisher | S71325 | |
| Phenol red | Sigma | P4758 | |
| Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
| phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
| Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
| ~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |
||
References
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).
- Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
- Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).
- Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).
- Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).
- Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. , (2012).
- Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
- Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
- Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).
- Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
