Summary

בידוד והתמיינות של תאי כלי דם לתאי סטרומה בז'ים / Brite

Published: March 28, 2013
doi:

Summary

preadipocytes הלבן העיקרי שבודד מרקמות שומן לבנות בעכברים יכול להיות מובחן לתאים בז'ים / brite. מוצג כאן הוא מודל למערכת סלולרית אמינה ללמוד רגולציה המולקולרית של "השחמה" של שומן לבן.

Abstract

adipocytes בראון יש את היכולת להפריד בין שרשרת הנשימה במיטוכונדריה, ולפזר את האנרגיה כימית בצורה חומה. פיתוח adipocytes החום UCP1 החיובי ברקמות שומן לבנות (כך נקרא תאי צבע בז'ים או brite) מושרה מאוד על ידי מגוון של רמזים סביבתיים כמו חשיפה לקור כרונית או על ידי אגוניסטים PPARγ, ולכן, סוג תא זה יש פוטנציאל כמטרה טיפולית עבור טיפול בהשמנה. למרות קווי adipocyte רוב הנציחו לא יכולים לסכם את התהליך "ההשחמה" של שומן לבן בתרבות, adipocytes העיקרי מבודד משבריר כלי דם סטרומה ברקמת שומן לבן תת עורית (WAT) לספק רשת סלולרית אמינה ללמוד בקרה המולקולרית של התפתחות תא בז' / brite . כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד יעיל של preadipocytes היסודי וגרימת התמיינות לתאים בז'ים / brite בתרבות. אפקט ההשחמה יכול להיות מוערך על ידי הביטוי של מארק בראון שומן סלקטיביתהתעמלות כגון UCP1.

Introduction

השמנת יתר היא להגדיל באופן משמעותי בעולם וכיום הוא נחשב לאחד מהחששות הכבדים ביותר לבריאות ציבור 1. מצב זה קשור לmisbalance בצריכת אנרגיה ביחס להוצאות ותוצאות בעודף אנרגיה מאוחסנת כשומן ברקמת שומן לבנה (WAT). WAT המוגדל קשור למסת גוף מוגבר ומשקל, בעוד שרקמת שומן חום יש את היכולת לפזר אנרגיה עודפת כדי לייצר חום. לפיכך BAT יכול לתפקד כהגנה מפני קור והן השמנת 2,3. זו מושגת על ידי תרה של מעבר האלקטרונים במיטוכונדריה ידי מתיר חלבון 1 (UCP1). חלבון זה נחשב סימן היכר לnonshivering התרמוגנזה בBAT 3. מספר מחקרים בשנים האחרונות גילו כי בני אדם בוגרים יש 4-8 BAT פונקציונליים וכתוצאה מכך, מניפולציה של BAT בבני אדם יכולה להיות התערבות טיפולית פוטנציאלית במאבק נגד השמנת יתר והמחלות הקשורות בו.

jove_content "> ראיות נוכחיות מצביע על כך ששני סוגים של adipocytes החום קיימים במכרסמים;" קלסי "או" קיים מראש "שומן החום מתפתח בשלב טרום הלידה ומהווה מחסני שומן חומים ייעודיים באזור interscapular ורקמות היקפיות אחרות מצד השני. , טופס "מושרה" של שומן חום (כך נקרא תאי Brite או בז'ים) מתפתח בשלב שלאחר הלידה וביניהם מופיע ברקמות שומן לבנות. שני הסוגים של adipocytes החום גם הם מופרדים על ידי מקורות התפתחותיים שונים. אמנם קיים מראש adipocytes החום נובע מmyoblastsic הדמוי Myf5 מבשרים, את התאים המושרים Brite / בז'ים שזורים בWAT לנבוע משושלת הלא Myf5 9,10. בנוסף, מסלולים רגולטוריים של סוג תא זה עשויים להיות שונה מהחום המופק מMyf5 adipocytes 11. ההתפתחות של תאים בצבע הבז'ים (כלומר "השחמה" של שמן ולבן) ניתן להפעיל בתגובה לחשיפה לקור כרונית וכדיβ3-adrenoceptor-אגוניסטים או אגוניסטים PPARγ במבוגרים 12-14. התאים הבז'ים / brite עשויים להיות מטרה טיפולית מבטיחה עבור מניפולציה של מאזן אנרגיה כוללת ובאופן פוטנציאלי יכולים להיות חלק מטיפול בהשמנה, ולכן, חשוב להבין מנגנונים מולקולריים מדויקים ומסלולי איתות שבו רמזים סביבתיים שולטים פיתוח בז' תאים.

כדי להבין את השליטה המולקולרית של ההשחמה של שמן ולבן, בניסויים במבחנה הם מתאימים ביותר כבידול של preadipocytes מתרחש ולא באופן אסינכרוני, וקשה לזהות את התאים באתר 15. למרות שמחקרים על התפתחות adipocyte שעד כה בוצעו בעיקר על שורות תאים כגון-L1 3T3, 3T3-F442A או HIB1, שורות תאים אלה נראות חסרי החתימה המולקולרית של תאים בצבע בז'ים. מצד השני, adipocytes העיקרי שבודד מתת עורית WAT הוא סיכוי טוב ביותר לסכם על procesהים של השחמה של שומן לבן בצורה אוטונומית תא. כאן אנו מספקים פרוטוקול לבידוד יעיל של שבריר סטרומה וכלי דם מרקמות שומן וגרימת ההשחמה של שומן לבן בתגובה לאגוניסטים PPARγ. Rosiglitazone הוכח להיות מתווך יעיל במיוחד של השחמה בתאים אלה. כפי שהציע בעבר 16, רשת סלולרית זה יכול לשמש כדי לשרת את המערכת סלולרית אמינה ללמוד על התפתחות תאים בז'ים / brite.

Protocol

1. הכן בינוני עיכול הפוך 5 מ"ל לכל 5 עכברים לרקמות (/ רקמת שומן כ 1 מ"ל 1 ז). לשקול באנזימי עיכול: – D Collaginase: 1.5 u / מ"ל ​​(1108874103, 1 גרם, רוש, 70334223) – Dispase השני: 2.4 u / מ"ל ​​(049420780…

Representative Results

בראונינג adipocytes העיקרי ניתן לגשת על ידי מדידת ביטוי mRNA של Ucp1 וגנים חומים אחרים שומן ספציפיים או סלקטיבית ידי qRT-PCR. מוצג באיור 1 הוא נתוני ביטוי גנים במפשעת adipocytes העיקרי WAT-נגזר. התאים היו מושרים להבחין בנוכחותם של שני מינונים שונים של rosiglitazone ב50 ננומטר ו 500 …

Discussion

כאן אנו מציגים מערכת סלולרית אמינה ללמוד על התפתחות תאים בז'ים / brite בadipocytes תרבית הראשוני בעכברים. בהשוואה לכמה שורות תאים הנציחו זמינות, מערכת זו היא צפויה להציע רלוונטית משופרת להשחמה של לבן שומן בגוף חי.

למרות שהמחקר של ad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים Haruya אונו, Kosaku ינודה, לואיס ארפ, אמי Tomoda, ולורן רואיז לדיון, עזרה טכנית וסיוע בעריכת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (DK087853), מהתכנית למחקר ביו פריצת הדרך ומAsubio פארם בע"מ לSKULA היה נתמך על ידי מלגות מנית דוקטורט מאוניברסיטת קופנהגן והאיחוד האירופי FP7 פרויקט DIABAT (בריאות-F2 -2,011-278,373) לליז מדסן וקרסטן Kristiansen. אנחנו גם מכירים DERC מרכז המענק (NIH P30 DK063720).

Materials

Reagent
Collaginase D Roche 11088874103
Dispase II Roche 04942078001
CaCl2
DMEM medium Fisher 10017-CV With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate
Insulin
T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine) Sigma T-2877
Indomethacin Sigma I-7378
Dexamethasone Sigma D-1756
IBMX Sigma I-5879
Rosiglitazone Sigma R-2408
Equipment
Collagen coated dishes BD 354450 10 cm plates
70 μm filter BD Falcon 352350 Cell strainer,70 μm nylon 1/ea

References

  1. Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
  2. Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A (1979).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  4. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
  5. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
  6. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
  7. Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
  8. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
  9. Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
  10. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
  11. Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
  12. Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
  13. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
  14. Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
  15. Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
  16. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
  17. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
  18. Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
  19. Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
  20. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
  21. Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
  22. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
  23. Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
  24. Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
  25. Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
  26. Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
  27. Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).

Play Video

Cite This Article
Liisberg Aune, U., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. J. Vis. Exp. (73), e50191, doi:10.3791/50191 (2013).

View Video