Optogenetic Stimulering av Escape Behavior i<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Genetisk kodet optogenetic muliggjør ikke-invasiv manipulering av spesifikke nerveceller i<em> Drosophila</em> Hjernen. Slike verktøy kan identifisere nevroner som aktivering er tilstrekkelig til å utløse eller undertrykke bestemte atferd. Her presenterer vi en metode for å aktivere Channelrhodopsin2 som uttrykkes i målrettede nevroner i fritt vandre fluer.
Abstract
Et økende antall av genetisk kodet verktøy blir tilgjengelig som tillater ikke-invasiv manipulering av den nevrale aktiviteten av bestemte nerveceller i Drosophila melanogaster en. Chief blant disse er optogenetic verktøy, som gjør det mulig aktivering eller stanse konkrete nevroner i intakt og fritt bevegelige dyr ved hjelp sterkt lys. Channelrhodopsin (ChR2) er et lysaktivert kation kanal som, når den aktiveres med blått lys, forårsaker depolarisering av nevroner som uttrykker det. ChR2 har vært effektiv for å identifisere nevroner kritiske for spesiell oppførsel, for eksempel CO 2 unngåelse, snabel forlengelse og gigantiske fiber mediert sjokkrespons 2-4. Men som den intense lyskilder som brukes til å stimulere ChR2 også stimulere fotoreseptorene, har disse optogenetic teknikkene ikke tidligere vært brukt i det visuelle systemet. Her kombinerer vi en optogenetic tilnærming med en mutasjon som svekker fototransduksjonskaskade til demonstrate at aktivering av en klynge av vevstol-sensitive nevroner i fly er optisk lapp, FOMA-1 nevroner, kan kjøre en flukt atferd brukes til å unngå kollisjon. Vi brukte en null allel av en kritisk komponent i fototransduksjonskaskade kaskade, til fosfolipase C-β, kodet av norpA genet, gjengi flyr blind og også bruke Gal4-UAS transcriptional aktivator systemet til å kjøre uttrykk for ChR2 i Foma-1 nerveceller. Individuelle fluer er plassert på en liten plattform omgitt av blå lysdioder. Når lysdiodene lyser, fluene raskt ta-off i flukt, på lignende måte å visuelt drevet vevstol-flukt atferd. Vi tror at denne teknikken kan enkelt tilpasses til å undersøke andre atferd i fritt bevegelige fluer.
Introduction
En voksende arsenal av genetisk kodet verktøy har blitt utviklet for å manipulere nevrale aktiviteten i bestemte celler i Drosophila melanogaster en. Disse verktøyene gjør det mulig ikke-invasiv aktivering eller stanse konkrete nevroner i intakt og fritt bevegelige dyr. Blant disse, tilbyr Channelrhodopsin2 (ChR2), en lys-aktivert kation kanal, viktige fordeler, siden det kan være temporært kontrollert og raskt indusert. Når nerveceller som uttrykker ChR2 blir utsatt for lys blå (470 nm) lys de raskt depolarize og viser forhøyede skyting priser 3-5. Slik målrettet aktivering av spesifikke nerveceller i fritt bevegelige dyr har avdekket tilstrekkelighet av bestemte nerveceller for atferd som CO 2 unngåelse 3, snabel forlengelse 2,4 og gigantiske-fiber medierte skremme svar 4. Men som den intense lyskilder er nødvendige for å stimulere ChR2 også stimulere fotoreseptorene, søker optogenetic teknikker til det visuelle systemet har vært begrenset. Ved å kombinere en optogenetic tilnærming med en mutasjon som svekker fototransduksjonskaskade har vi vist at aktiveringen av en spesifikk klynge av nerveceller i fly er optisk lapp kan kjøre flukten atferd brukes for å unngå kollisjon 6.
De fleste, om ikke alle, visuelle dyr viser en flukt atferd for å unngå kollisjoner med motgående objekter. Gå eller stasjonær fluer, når presentert med et truende kollisjon, take-off på flukt, vekk fra møtende kollisjon 7-9. Disse take-offs er preget av hevet vinger før take-off og en ustabil fly bane 10,11. Dette svaret er forskjellig fra den gigantiske fiber mediert skremmeeffekt, hopp som ikke etterfølger hevet vinger, og vanligvis resultere i en fritt fall riste 4,9. Etter å ha identifisert en bestemt klynge av vevstol sensitive nevroner i den optiske lapp, Foma-1 nevroner, som er uniquely innstilt til kode nærmer objekter, forsøkte vi å undersøke deres engasjement i fly er vevstol flukt atferd. Her har vi demonstrere bruk av optogenetics å selektivt aktivere disse nevronene og framprovosere flua flukt atferd.
Vi bruker Gal4-UAS transcriptional aktivator systemet til å kjøre uttrykk for ChR2 i FOMA-1 nerveceller. ChR2 krever kofaktor all-trans-retinal og som dette er funnet i lave nivåer i Drosophila sentralnervesystemet det må suppleres i fluene 'diett. 3,4 Som sterkt lys brukes til å aktivere ChR2 og fluer viser sterke phototactic atferd 12, søkte vi å eliminere muligheten for en visuell respons på stimulans. For å gjøre dette, brukte vi dyr som var homozygot mutant for en null allelet av norpA genet, som koder for et kritisk komponent i fototransduksjonskaskade cascade, fosfolipase C-β. Fotoreseptorene i slike muterte fluer ikke kan ansvaretd til lys 13. For å teste optogenetic stimulering av flukten respons, må vi isolere en enkel flue og bade den i lys blå lys. For å gjøre dette, legger vi enkelte fluer i pipettespisser. Ett pipettespiss er plassert i en tilpasset holder, slik at fly vil geotactically gå opp spissen og ut på en rektangulær plattform. Fly er i stand til å gå rundt fritt på toppen av denne plattformen. Plattformen er omgitt av fire blå LED arrays, hver med tre LED, fokusert på toppen av plattformen. Etter fly er på plattformen, er LED lyser, og flua svar er tatt opp med et høyhastighetskamera 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har vist optogenetic stimulering av escape atferd ved bading fritt vandre fluer i lyse blå lys. Denne tilnærmingen kan enkelt tilpasses til å undersøke andre atferd i fritt vandre fluer, og kan skaleres til større plattformer ved å flislegging LED arrays vi brukte over et større område. Ved hjelp av enten billig kamera vi beskriver, eller andre tilgjengelige kamerasystemer kan brukeren skreddersy bildefrekvens og romlig oppløsning av bildene ervervet, spesialtilpasset oppførselen av interesse. Tillegg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av en Stanford Dean Fellowship (SEJdV), en National Institutes of Health Regissørens Pioneer Award (TRC DP0035350), en McKnight Foundation Scholars Award (TRC) og R01 EY022638 (TRC).
Materials
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific & Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼” ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼” NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 |
References
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O’Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
