乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

Summary

タイムラプスイメージングは​​、特定の行動のパラメータと異なる遺伝的病変の間に相関があるかどうかを判断するために乳癌リスクの遺伝子改変モデルマウス由来の初代前腫瘍性乳腺上皮細胞の挙動を評価するために使用される。

Abstract

タイムラプスイメージングは​​、乳がんのさまざまな遺伝子改変マウスモデル由来初代培養前腫瘍性乳腺上皮細胞の挙動を比較するために使用できます。例えば、細胞分裂（細胞寿命）、アポトーシス細胞数、形態学的変化の進化、およびコロニー形成のメカニズムの間の時間を定量することができるし、特定の遺伝子損傷を持つ細胞で比較。プライマリ乳腺上皮細胞培養物は、触知可能な腫瘍なし乳腺から生成されます。腺が慎重に周囲の筋肉から明確に分離することで切除され、リンパ節を除去し、濃縮された乳腺上皮細胞の単一細胞懸濁液は、酵素的解離と濾過に続いミンチ乳腺組織によって生成されます。単細胞懸濁液は、ライブセルイメージングのためのインキュベーターチャンバー内に播種し、顕微鏡下に直接配置されます。各ワットから4x4の構成で16 650ミクロン×700μmのフィールド6ウェルプレートのエルは、5日間の15分ごとに結像される。タイムラプス画像は、直接最初の24セルのめっき時間（集計対細胞増殖）、アポトーシスの発生率、および形態学的変化の位相の中で細胞コロニー形成のメカニズムと周波数を含めることができます携帯電話の行動を測定するために検査されます。単一セルのトラッキングは、個々の細胞の寿命と細胞分裂パターンの調査の測定のための細胞運命のマップを生成するために使用されます。定量的なデータは統計的に特定の遺伝子損傷と相関行動の大きな違いを評価するために分析される。

Introduction

遺伝子改変マウスモデルは、異なる遺伝的病変は、乳がんの発症リスクに寄与する方法を勉強し、理解するためのツールです。例えば、遺伝子組み換えマウスは3つの要因の組み合わせが示されている：完全長乳がん1、乳腺上皮細胞における早期発症（BRCA1）遺伝子、腫瘍タンパク質p53（TP53）生殖系列ハプロ不全、および乳腺上皮の損失をセル^（f）は^{11/f11/Mouse乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）-Cre/p53 + / -/tetracycline-operator（BRCA1フロックス化}の100％で乳腺癌の開発においてアップレギュレートエストロゲン受容体α（ERA）式の結果を標的^{TET-op）が-ER/MMTV-reverseテトラサイクリントランスアクチベーター（BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53}で報告された低い割合と比較して、生後12ヶ月^{rtTAマウス}が⁺ - ^/ - （〜50過剰発現時代を持たないマウスTP53 haploinsufなし60％）、BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-CreマウスFICIENCY（<5％）。1}

前癌一次乳腺上皮細胞の挙動の動的タイムラプスイメージングが少なく簡単に静的な組織切片で高く評価されている細胞の挙動の違いを明らかにする。増殖と分化の変化はヒトBRCA1変異保因者からの主な乳腺細胞で観察されています。正常及び遺伝子改変マウスからプライマリ乳腺上皮細胞の単一細胞懸濁液の²作成は切除乳腺組織の酵素的解離によって生成されます^。3タイムラプス画像は、細胞コロニーの外観と上皮間葉移行（EMT）とアポトーシスを含む細胞の形態学的変化の発生のメカニズムとタイミングを評価するために見ている。細胞の運命マップの生成が、細胞分裂（細胞寿命）と、細胞分裂のパターンの決定の間の時間の長さの定量化は、単一セルの追跡の使用によって促進されています。ティムのトラッキングツール（TTT）は、単一セルの運命マップを生成するために使用される公に利用可能にするソフトウェアです。細胞の運命決定のメカニズムの解明にその有用性は、通常の造血幹細胞の発達^6-9およびニューロンの生成を調べる^4,5確立されています¹⁰

Protocol

1。全体的なスキーム

1. 遺伝子組み換えの乳腺から前腫瘍性乳腺上皮細胞の初代培養を生成し、野生型マウスを制御します。
2. 15分毎に最大5日間までVolocity画像取得ソフトウェア（バージョン5.3.1、エルマー、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して生細胞の画像をキャプチャします。
3. タイミングと上皮細胞のコロニー形成のメカニズム、アポトーシスの発生率、および形態学的変化の位相を評価するために直接タイムラプス画像を見ることができます。
4. MetaMorph顕微鏡オートメーション＆画像解析ソフトウェア（Molecular Devices社、LLCはサニーベール、カリフォルニア州）を用いて、JPGファイルは生成された。TIFFスタックがVolocityに変換して、デジタル画像ファイルを（リネーム2.1.6、リネームhttp://www.softpedia.com/get /システム/ファイル管理/-Rename.shtml Timmさんのトラッキングツールソフトウェア（TTT、との互換性を有効にする）tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "ターゲット=" _blank "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index。 html）を。
5. TTT使用して、細胞分裂（細胞寿命）や細胞分裂のパターン（対称対非対称）の間の時間を測定するための細胞の運命マップを生成する。
6. 異なる遺伝子改変マウスモデルおよび/または野生型コントロールとの間に統計的に有意な差があるかどうかを判断するには、手順3と上記5からの定量的なデータを分析します。

2。プライマリ乳腺上皮細胞培養の世代

1. メーカーの指示の変動（EpiCult-Bマウスミディアムキット、Stemcellテクノロジーズ、バンクーバー、BC）に続く単一乳腺上皮細胞の単離のための完全なメディアを準備します。 450ミリリットルエピカルト-B培地、50ミリリットルエピカルトB増殖サプリメント、5％ウシ胎児血清（FBS）、50μg/ mlのペニシリン/ストレプトマイシン（PenStrを組み合わせるEP）および10 ng / mlの上皮増殖因子（EGF）。
2. 2.1から9部完全メディアで10xのコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ混合物の1部を組み合わせることにより、解離メディアを準備します。
3. マウスを安楽死させると直ちに剖検に進みます。場所は発泡スチロールの剖検プラットフォーム上でその背中の上にマウスと腹側皮膚がピンと張っているように、すべての四肢を固定します。ことは、70％エタノールで、手足を覆うなど、腹側皮膚と髪を飽和させる。皮膚を通して正中切開を行うことで、＃2月3日（胸部）と＃4/5（鼠径）乳腺を公開（腹膜を入力しません）各前肢の内側の皮膚を介してY字切開に拡張されていると各後部肢の内側の皮膚を介してY切開逆さま。
4. 鈍的切開を使用して、underlyingperitoneumから皮膚を分離し、それがピンと張ったようになるまで皮膚の両側に引き戻すと、ピンを使って発泡スチロールの剖検プラットフォームに固定します。外側から始めて、disseの賢明な使用で鈍的切開を使用ctionはさみは無傷鼠径部および/または下層の結合組織や筋肉から胸部乳腺を単離する。 10センチメートル滅菌ペトリ皿に2つ以下の乳腺を置き、組織培養フードに移動します。
5. 組織培養フードでは、黄色がかった色で小さく、十分に限局性結節として識別され胸リンパ節のための腺を調べます。滅菌メスや鉗子を用いて周囲の腺からのリンパ節を切除する。 2つの滅菌メス、それぞれの手で1つを使用して、約1mm ³の立方体に乳腺組織をミンチ。
6. 場所は静かに10ミリリットルピペットを用いて2〜3回上下にピペッティングすることによって5ミリリットル解離メディア、ミックスの中で乳腺組織を細切し、5％CO ₂で37℃のインキュベーター内（最大〜16時間）で一晩インキュベート緩めキャップ付50mlコニカルチューブ。
7. 翌朝、赤BLを促進する塩化アンモニウム溶液をバッファ2％FBS及び4部を含む1部ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）の冷混合物を調製するOOD細胞溶解（HFAmCl）だけでなく、2％のFBS（HF）を補充した冷HBSS。プリ暖かい修正ハンクス平衡塩溶液中でトリプシン-EDTA（0.25％）、5 mg / mlのディスパーゼ、1 mg / mlのDNase Iを、そして完全メディア。
8. インキュベーターと優しくパルス渦2〜3秒から乳腺組織で2回コニカル遠心チューブを外します。 5分（室温または4℃）、450×gでチューブを遠心し、上清を捨てる。
9. 5分（室温または4℃）、450×gで10ミリリットルのHFAmClと遠心分離機の最小でペレットを再懸濁し、上清を捨てる。
10. ペレットに3ミリリットルトリプシン-EDTAを加え、5ミリリットルピペットを用いて第一混合し、次いで糸状（1-3分）までP1000マイクロピペッターで。 5分（室温または4℃）、450×gで10ミリリットル、HF、遠心分離機を追加し、上清を捨てる。
11. ペレットと1分間P1000マイクロピペッターとミックスに5 mg / mlのディスパーゼ2ml及び1 mg / mlのDNase Iを200μlを加える。サンプルはCLOであるべきudyはなく、糸のような。糸のような場合、DNアーゼI100μlを追加して再度混ぜる。
12. 5分（室温または4℃）で450×gで10 mlの冷HF、40μmのセルストレーナーや遠心分離機を通して歪みを追加し、上清を捨てる。
13. 完全培地中最終ペレットを再懸濁します。セルの総数（血球計算盤またはコールターカウンターを用いて）を定量化。二つの乳腺は、約1×10 ^{6〜1×10 7個の}細胞を得ることができます。ウェル当たり1.5×10 ⁵細胞の密度で平底6穴プレートにプレート一次上皮細胞。

3。ライブセルイメージング

1. すぐに細胞を播種後、5％CO ₂ /飽和humidity/37℃の温度インキュベーションチャンバー内に確実に顕微鏡ステージ上6ウェルプレートを配置します。ケーラー照明および中心位相リング用のコンデンサを調整します。ここで紹介する実験では、ディスク共焦点スピニング反転ニコンエクリプスTE300/PerkinElmer10倍の対物レンズと広視野位相コントラストモードでの顕微鏡システムを用いた。
2. 開いている画像取得ソフトウェアは、作成してタイムラプス画像用ライブラリに名前を付けて、大容量のファイルのための十分なスペースを使っている場所に保存します。実験では、ここで用いVolocity画像取得ソフトウェア（バージョン5.3.1、エルマー、マサチューセッツ州ウォルサム）を提出した。
3. プレートは15​​分の最低顕微鏡インキュベーター中で平衡化させます。ステージレンズの干渉を避けるためにレンズを下げます。 "ステージ"の見出しの下に、 "ステージのキャリブレーション"を選択します。 、焦点面を再取得 "ステージ"の見出しの下に "追加点"を選択することにより、集合Z =ゼロのx、y、z]タブおよびマークイメージングポイントの下にある。位相コントラストイメージングなどのイメージングのための6ウェルプレートの各ウェルの中央に置きポイントはプラスチック井戸の周囲近傍乱れることがあります。 4×4フィールド（650ミクロン×700ミクロンフィールド）、小さな重なり（約5％）とそれぞれの正方形内の点を配置​​します。クワガタ "の下に選択した点を保存のe。 "
4. "ステージ"の下に選択して "フォーカスマップを作ってください"と、各点のフォーカスを設定する指示に従います。時間あたり4枚（15分毎に）キャプチャする画像取得タイミングを設定します。これは、特定の実験の要件に応じて調整することができます。 "ステージ"の下にフォーカスマップを保存します。
5. 右右サイドツールバーの "画像取得"をクリックして、画像の設定を保存します。イメージングを開始するには、録音ボタンを押します。 1時間後、任意の調整が必要であるかどうかを確認するために、画像のフォーカスを確認してください。
6. 監視し、細胞がコンフルエントになったときに終了し、5日間のライブイメージングを続ける。

4。形態学的変化のタイミングと初期上皮細胞コロニー形成のメカニズム、アポトーシスの発生率、フェーザーを評価するためのタイムラプス画像を直接見る

1. タイムラプス画像の直接観察は、互換性のある任意のビデオ視聴ソフトウェア（ 例えば使用して行うことができますhttpを：/ / www.real.com/ RealPlayerまたは他のフリーウェアまたは市販ソフト）。画像は、この段階で、または。JPGファイル（ステップ5を参照）に変換した後。TIFF形式で表示することができます。
2. 初期のコロニー形成のメカニズムを決定するために、プレート上の1つの撮像部位を表す単一イメージのスタックで始まります。最初のフレームでは、細胞はフローティングになります。第一上皮細胞がプレートに付着したときを決定する連続画像に従ってください。このステップでは、上皮細胞を識別することができ、彼らのより立方形態によって線維芽細胞から分化した。シリアル画像を通して、この単一の上皮細胞に従い、後続の24時間かけてその運命に従ってください。それは追加の上皮細胞に囲まれた、または細胞分裂やアポトーシスを受けるとなった場合、記録します。上皮細胞に囲まれている場合は、コロニー形成のメカニズムは、周囲の細胞は、または初期接着細胞（s）と、集約浮遊細胞に由来している場合は表示することによって直接決定することができる初期接着細胞の分裂から。最初の24時間中に細胞凝集対細胞分裂によって形成されたコロニー数を記録します。
3. 特定の期間にわたってアポトーシスを最初に接着した細胞の数を決定するために、接着されているセルに発展アポトーシスの古典的な機能の外観の連続画像に従う（ http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ）、およびイメージングの全期間中、または記録された特定の時間枠内で識別されたアポトーシス細胞の数。
4. 時間が経つにつれて、培養中の上皮細胞は、EMTと一貫性より細長い外観に初期直方体形状からその形態を変化させる。これが発生した場合、メッキ後の日/時間を決定するために、連続画像に従ってください。

5。イメージファイルの修正

1. ティムの追跡ツールソフトウェアの必要条件に応じて画像のフォルダやファイルの名前を変更名前の変更2.1.6（のようなフリーウェアのプログラム使用http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtmlをグループ内のファイルの名前を変更する）。実験のすべてのフォルダとファイルを含むフォルダを1つ作成します（ 例えば、フォルダに名前を付ける
2. 文化が撮像された各点/位置のサブフォルダを作成します。 EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER：サブフォルダの名前を付けます。位置番号は、3桁の数字を持っている必要があります。例：072511RN_p001。サブフォルダ内の個々の位置のすべての画像ファイルを入れてください。
3. この形式で、それぞれのファイル名の末尾の時点（5桁を使用）とチャンネル番号（1つだけの明視野チャンネルがあるので、 "0"を使用）を追加します。
   EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample：072511RN_p001_t00001_w0.jpg
4. 第一TTTのWebサイトから無料でプログラムTTTlogfileconverterをダウンロードすることにより、各位置のためのログファイルを生成します。 TTTlogfileconverter·プログラムを開始して、実験のフォルダを選択します。入力画像の間隔（秒単位）。 15分毎に撮影した写真については、900秒を入力します。次に緑色隠密ログファイルボタンを押します。

6。 TTTを用いた単一細胞の細胞運命マップの生成

1. C言語TTTexportというフォルダとすべてのセルの追跡データはTTTのソフトウェア命令に続いて格納されるTTTfilesという名前のサブフォルダをreate
2. TTTプログラムを起動し、ユーザーのイニシャルを選択し、 "続ける"をクリックします。
3. 押して "設定NASを"、 "TTTexport"フォルダを作成したユーザーを選択し、[OK]をクリックします。ブラウザで、キーを押して "ロード位置"ボタンを位置のフォルダを選択し、実験のフォルダを選択し、。
4. 眼に係数を設定した "10倍。"必要なイメージの数を読み込む（すべてのイメージのロードが初めてのために推薦されています）。
5. セルエディタ]ウィンドウで、[ファイル]メニューの下に "新植民地"を選択します。ムービーウィンドウでは、セルのトラッキングを開始する "トラックセル"またはF2キーを押します。
6. M内のセルを識別OVIEウィンドウとセルの上にカーソルを配置するために、マウスを使用しています。 F2キーがクリックされた後のセルの数とサークルが表示されるはずです。次の画像にセルと事前の位置を追跡するために、キーボードのテンキーの "0"キーを使用します。各フレームを介して各セルの配置に従うようにカーソルを移動します。トラックを削除して、テンキーの前の画像を押して "デル"に戻ります。 "、3"セルプレスを追跡することなく、フレームを転送移動するとテンキーのEnterキーを押し "1"を追跡することなく後方へ移動する。
7. 細胞分裂をマークするには、ムービーウィンドウの "分割"ボタンをクリックしてください。細胞死をマークするには、ムービーウィンドウの "細胞死"ボタンをクリックしてください。除算が発生した後、娘細胞は、自動的にモードの追跡を開始するには、セルエディタウィンドウ内の指定された娘細胞の円形の記号を右クリックして、同じ細胞の運命マップ内で追跡することができます。
8. 木を保存するには、F10を押します。各ツリーには、指定された出力倍で保存されますER（TTTExport）。新しい細胞の運命マップを起動するには、セルエディタウィンドウの "ファイル"→ "開く"メニューの下に "新植民地"を選択します。
9. セルエディタウィンドウで "セル·データ"タブから収集した後、細胞寿命データを集計。

7。統計分析

1. 異なる遺伝子型間のEMTの出現まで、そのような初期細胞コロニー、細胞の寿命や時間数などのパラメトリックデータの違いは統計的にあるかどうかを判断するためにどちらかのスチューデントのt検定を（2つの遺伝子型を比較した場合）を使用するか、またはANOVA（> 2つの遺伝子型を比較した場合）著しい。アポトーシスの周波数は数/スチューデントのt検定またはANOVAを用い総数播種した細胞として、または付着細胞の割合（％）として導出マン·ホイットニーまたはKruskal-Wallisと比較することができます。
2. 実行され、細胞の運命マップが適切sの各反復から生成する必要がありますどのように多くの実験が複製を決定するために、初期の実験の分析からのデータを使用して電源のテストを実行利用可能なフリーウェアを使用してtatistical電力（ 例えば http://statpages.org/ ）。ここで紹介する実験では、遺伝子型ごとに3つのマウス由来の細胞培養では、特定の遺伝子改変がなされた時、細胞コロニー形成と細胞寿命の統計的に有意な違いがあったかどうかを判断するのに十分であった。

Representative Results

上皮細胞と線維芽細胞は、細胞の形態によって区別す​​ることができる。上皮細胞は立方形の形状（ 図1A-B）とフォーム細胞コロニー（ 図1A）を持っています。線維芽細胞、間質細胞の種類は、細長い形態（ 図1C）を持っています。

細胞は丸く、イメージングの開始（ 図2A-D）に浮かんでいた。プレートへの取り付け後、彼らはフラットになり、立方体型の外観（ 図2E、H）を実証した。培養4日目までに上皮細胞の大多数は、EMT様の形態（ 図2I-L）に伸長する。この変更は、調査したすべての遺伝子型で同じ年表で発生していました。ケーラー照明と位相リングアライメントが（ 図2D、H、L）が正しく設定されていないため、一部のデジタル画像がぼやけていた。

定義されている個々の上皮細胞コローニに開発した浮遊細胞めっき後の24時間でES（ 図3A、B）。シリアル画像解析では、これらのコロニーは細胞凝集ではなく、細胞分裂によって生成されたことを明らかにした。単独でBRCA1の破壊が形成されたコロニー数、TP53ハプロ不全の付加を変えることはなかったものの大幅に形成されたコロニーの数を減らし、ERαの添加が過剰発現は有意に（ 図3C）に形成されたコロニーの数を増加させた。

これは、取得したデジタル画像を監視し、細胞が細胞が焦点と文化に残るようプレートに付着した後少なくとも1日2回として、最初の24時間中に頻繁に焦点マップを調整することが重要で汚染されていない。画像化された細胞（ 図4）焦点が合っていない場合は解析の精度が損なわれます。

ここに提示され、代表的な実験では、重要な問題は、発現レベルの変化かどうかを判断することであった乳癌リスクに影響を及ぼすことが知られている遺伝子のs（BRCA1、TP53、エストロゲン受容体^{1（ESR1）1）}細胞分裂（細胞寿命）の間の時間数を変更または非癌に分裂のパターン（対称対非対称）の影響プライマリー乳腺上皮細胞。これを達成するために、個々の細胞の運命マップは（木）TTTを使用して生成された。テストした4遺伝子型のそれぞれについて、代表的な細胞の運命マップの例（ 図5A〜D）に示されている。テストセルの4つの遺伝子型が、（ 図5A）（無遺伝子操作）フルレングスBRCA1の消失（BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre）（} 図5B）の組み合わせで、フルレングスのBRCA1の喪失、野生型であった（BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - ）（} 図5C）およびTP53 haploinsufficiと組み合わせたフルレングスのBRCA1の損失TP53ハプロ不全とESR1のencyとゲイン（BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER）（} 図5D）。細胞がコンフルエントになった細胞の運命マップの生成は、単一細胞の明確な追跡はその後もはや可能でなかったので、（3〜4世代）を停止させた。の世代0（最初の細胞分裂までの時間）は、細胞の生存期間の分析に含まれていなかったため、持続 0世代は長かったとその後の世代よりも可変。セルの平均寿命またはこれらの世代間の平均（​​SEM）の標準誤差に有意差はなかったので、世代1、2、3、および4は、最終的な分析のために一緒にグループ化された。異なる遺伝子型（ 図5E）との間の平均細胞寿命の比較は、その全長のBRCA1の損失は21.3から細胞分裂の間の時間数を減らし±1.6 hrを（野生型）16.5に明らかに±1.0時間^（/ BRCA1 ^{f11/f11 MMTV-CRE）。}ノーフルレングスのBRCA1の損失に加えて、1つの対立遺伝子TP53の損失が乳癌development1の大幅な増加に関連付けられているもののtably、細胞寿命しかBRCA1を欠損させたマウスに比べ、（16.3±1.2 hr）は変化しなかったことを意味します。これらのマウスは持っているとはいえ興味深いBRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53}でESR1のゲインセル寿命を復元^{+ / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER}マウス^は 、近くに野生型レベル（19.3±2.1時間）への継続時間here.1これらの知見を学び、すべてのモデルの乳腺癌の開発の最も高い発生率ではなく、これが過剰発現し、ERαによって変更されました、その全長のBRCA1の損失が常に短く、細胞の寿命に関連付けられていないことを示しました。この技術を利用可能な次の段階の実験では、異なる遺伝backgroで細胞寿命に与える影響を測定するために、異なるエストロゲン、他の成長因子、または候補治療薬を用いた用量反応の実験かもしれないunds。細胞寿命の期間に与える影響とは対照的に、遺伝的変化のいずれも、ここに変更された細胞分裂のパターンを研究していません。

図1。線維芽細胞はより細長く見えるけれども上皮細胞コロニーの出現（）は、上皮細胞（B）と、タイムラプスイメージングから線維芽細胞（C）上皮細胞は、多くの立方体が表示されます。サイズバー=50μmである。

図2。時刻0からの代表的なシリアルタイムラプス画像は、2と4日には、時間ととの外観の違いを越えてコールせずに細胞形態の変化を実証えーイルミネーションが。0の時点でメッキされた細胞は、それらが付着しており、立方体型の形態を（太い矢印E、H）を展示し、文化の中で4日までに、彼らは細長いと示されることがある文化の中で2日間で、（矢印のAD）に浮遊しているEMT様の形態（細い矢印IL）。ケーラー照明はパネル、AC、EGとIKに存在しています。パネルD、H、Lはケーラー照明なしで画像を示す。示されている画像は、一定期間内で同一の結像点からのものである。サイズ棒=200μmである。 拡大図を表示するにはここをクリック 。

図3。 1日目の上皮細胞のコロニー数は、遺伝子型によって変化した。 （）タイムラプスイメージングの冒頭で浮遊細胞を四捨五入していました。 （B）の2つの代表的な上皮細胞コロニー（矢印）。上皮の（C）の番号遺伝子型によって変化し24時間後に形成されたL細胞コロニー/フレーム。棒グラフは平均値の平均値と標準誤差を示しています。 * P <0.05、ANOVA。サイズ棒=200μmである。 10から触知可能な腫瘍ずに乳腺から単離された細胞- 12ヶ月齢BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre（n} = 4）で、BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-CRE / p53の}は^{+ / -} （n = 3）で、BRCA1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA（n} = 3）であり、野生型（n = 3）のマウスは、研究のために撮像した。野生型および遺伝子改変マウスのさまざまな組み合わせから成るつの独立イメージング実験を行った。メディアは、フェノールレッドが含まれていました。いいえエストロゲンを添加しなかった。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図4。アウトフォーカスの画像は正確にすることはできませんLyは分析した。イメージングプレートの前に、プレートを平衡化し、15分間イメージングインキュベータ内で座ってください。撮影の初日に、フォーカスがチェックされ、数時間ごとに調整する必要があります。その後それは日に2回確認したが、一般的に、より安定したままでなければなりません。矢印はアウトフォーカス上皮細胞のコロニーを示す。

図5（A）は、野生型のためのTTTを使用して、単一細胞追跡から生成された細胞の運命マップ、（B）はBRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre、（C）}はBRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53は+ / - 、}および（D）BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER}マウス。フレームまたはコンフルエントな細胞層への損失切れによる追跡することはできませんセルは疑問符で示されています。時のない疑問符示されているように、トラッキングが意図的にセルの合流かつ明確に単一セルの運命をたどることができないことが原因で終了しました。（E）の遺伝子型によって変化し、細胞の寿命を平均。棒グラフは各遺伝子型について1から4世代にわたる平均細胞の寿命（細胞分裂の間の時間）の平均値と標準誤差を示しています。 BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre}とBRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53}由来乳腺上皮細胞で^{+ /}有意に短かった細胞の寿命を意味しています^-野生型マウスと比較して。 * P <0.05、ANOVA。 10から触知可能な腫瘍ずに乳腺から単離された細胞- 12ヶ月齢BRCA1 ^{f11/f11/MMTV-Cre（n} = 4）で、BRCA1 ^{f11/f11 / MMTV-CRE / p53の}は^{+ / -} （n = 3）で、BRCA1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA（n} = 3）であり、野生型（n = 3）のマウスは、研究のために撮像した。野生型および遺伝的に4832のさまざまな組み合わせで構成される独立した五イメージング実験eeredマウスが行われた。メディアは、フェノールレッドが含まれていました。いいえエストロゲンを添加しなかった。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

Discussion

重要なステップ

それは乳腺が乳腺上皮細胞の挙動の加齢変動を制御するために、同じ年齢のマウスから採取されていることを確認することが重要です。細胞をプレーティングするときに、同じセルの数は、すべての実験のために、各ウェルに播種しなければならない。文化はそれが可能な連続画像を使用して複数のセルを個別にフォローすることが早すぎるコンフルエントになることがないようめっき時の細胞は比較的まばらである必要があります。これは、プレートが平衡化された後にフォーカスが変更されるため、イメージングプレートが前にインキュベーター中で平衡化することが不可欠です。一度撮影が始まっていると、フォーカスは、特に最初の24時間以内に、頻繁にチェックし、必要に応じて調整する必要があります。インキュベータ規制対象と予め温めの温度を持つことが重要です。部屋に出入りする人々の数はできるだけ制限する必要があります。我々は、設定のすべての側面を練習をお勧めしますグラムの再現性と品質管理を確保するため、事前に実験セットアップ。すべての細胞培養実験の場合と同様に、無菌性は重要な問題であり、標準的な無菌細胞培養の実践はすべての回で使用されるべきである。

大容量の画像ファイルを保存すると操作すると、メモリー·スペースのかなりの量を必要とします。共有ネットワークドライブまたはポータブルハードドライブを使用することができます。いったんファイルがそれはイメージが一貫して正しく命名され、対応するフォルダに配置されていることを確認することが重要である変換されます。頻繁には、プロセス全体を通じて行われるべきデジタルデータで保存されます。

制限事項

この方法は、3次元培養系で明らかになるかもしれない行動の違いの分析のために許可していない2次元培養システムを使用しています。細胞の寿命の持続時間は唯一の再現性のinitに続く最初の細胞分裂に時間数として最初に観察され、細胞分裂した後に測定することができる細胞のIALメッキは可変です。

可能な変更

実験の要件に応じて、タイムラプス画像が多かれ少なかれ頻繁に撮影することができます。一時的な細胞構造を定量化することになっている場合は、5秒間隔がより適切であるかもしれません。プライマリー乳腺上皮細胞培養を生成する他の手順を使用してもよい。任意の撮像装置は、限り、それは実験の要件を満たすことができるように、タイムラプスイメージングを作成するために使用することができる。単一セルの追跡のための代替システムを採用することができる。ここで説明する手順については、標準的なプラスチック平底6穴プレートには十分だった。プラスチック皿は、4倍〜10倍、そして20倍など、すべての長作動距離の空気レンズに使用することができます。これは、位相コントラストイメージングを行う際には、ほとんどのプラスチック皿のエッジ付近に湾曲しているので、プラスチック製の皿の中心付近の領域を選択することが重要であり、光を歪ませます。カバーガラスの厚さのガラス底ウェルは高い倍率で、典型的には正常な作動距離浸レンズ（油、水、グリセロールなど）、のために必要とされるであろう。

トラブルシューティング

細胞がメッキされた場合、メディアは、ステージ上でプレートを操作するための必要性を減少させるために5日間の細胞の成長を維持するのに十分であるべきであるが、必要に応じて、メディアを追加することができます。これは、蒸発を最小限に抑えることをお勧めします。蒸発は、インキュベーター内滅菌脱イオン水の三から四皿を置いて、必要なときにそれらを補充することによって管理されるべきである。滅菌脱イオン水で6ウェルプレートの未使用の井戸を埋めることが可能です。

画像はTTTプログラムにロードしない場合、最初にチェックし、ファイルやフォルダが正しく配置され、名前が付けられていることを確認してください。ログ·ファイルが正しいフォルダにある場合、次に（ステップ5.5を参照）を確認します。

Futuマスタリング·テクニック後の再出願又は方向

同じ一般的な手順は、ヒト初代乳腺上皮細胞ならびに乳がん細胞を含む他の種類の細胞の挙動を解析するために使用することができる。例えば、遺伝子型固有の動作および/または候補治療への応答を解析することができます。あるいは、蛍光活性化細胞（FAC）をソートした細胞集団のイメージングを行っまたは蛍光標識は、特定の細胞型を監視するために追加することができます。

既存の方法に対して、この手法の意義

従来の細胞培養と標識技術へのタイムラプスイメージングと時間をかけて細胞の挙動の解析のほかには時間だけではなく全体の人口動態上の単一細胞からの定量的なデータを提供します。この手法は、離散の時点で観察を可能にする従来の方法とは異なり、単一細胞を連続的に観察することができます。 Moreover、従来の方法は、細胞をここで説明する手法は細胞が転写されずに観察することができ、一方、顕微鏡下でそれらを表示するためにインキュベーターのうちにそれらを取ることによって乱されている必要があります。最後に、タイムラプスイメージングは​​、さらなる分析のために戻すことができ、観察中の細胞の持続的な記録を提供する。個々の細胞の挙動を追跡するために、TTTの使用は、複数のパラメータの明確な分析を可能にして、観察の下で特定のセルをローカライズするために蛍光標識を使用する必要はありません。技術は乳腺の静的組織切片で測定が困難である乳腺上皮細胞の挙動の違いを明らかにする。細胞の寿命測定は、有糸分裂のイベント間の時間数を定量化する。この測定は、時間で細胞周期の長さを示す細胞分裂の間に実際の時間数を特定して、そこにデータを提供しています。研究者が方法を決定するために、このデータを使用することができます特定の遺伝子改変または培養条件の影響の細胞周期の長さ。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiCult-B Basal Medium Mouse	StemCell Technologies	05610
EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse	StemCell Technologies	05612
recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF)	StemCell Technologies	02633
Collagenase/Hyaluronidase	StemCell Technologies	07912
Disposable Scapels	Feather	2975#10
Hanks' Balanced Salt Solution	StemCell Technologies	37150
Ammonium Chloride	StemCell Technologies	07800
Tryspin-EDTA	StemCell Technologies	07901
Dispase	StemCell Technologies	07913
DNase I	StemCell Technologies	07900
40 μm cell strainer	StemCell Technologies	27305
FBS	StemCell Technologies	06100
PenStrep	Gibco	15140