Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Summary

Time-lapse imaging viene utilizzato per valutare il comportamento di primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da modelli murini geneticamente modificati di rischio di cancro al seno per determinare se ci sono correlazioni tra i parametri specifici di comportamento e distinte lesioni genetiche.

Abstract

Time-lapse imaging può essere usato per confrontare il comportamento di colture primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da diversi modelli murini geneticamente di cancro al seno. Ad esempio, il tempo tra le divisioni cellulari (vite cellulari), i numeri di cellulare per apoptosi, l'evoluzione dei cambiamenti morfologici, e il meccanismo di formazione di colonie possono essere quantificati e confrontati in cellule che trasportano specifiche lesioni genetiche. Colture primarie di cellule epiteliali mammarie sono generati da ghiandole mammarie, senza tumore palpabile. Ghiandole sono accuratamente asportato con una chiara separazione dal muscolo adiacente, linfonodi vengono rimossi, e sospensioni monocellulari arricchite di cellule epiteliali mammarie sono generati sminuzzando tessuto mammario seguita da dissociazione enzimatica e filtrazione. Monocellulari sospensioni vengono piastrate e posti direttamente sotto un microscopio all'interno di una camera incubatore per live-cell imaging. Sedici 650 micron x 700 micron campi in una configurazione 4x4 per ogni well di una piastra da 6 pozzetti vengono esposte ogni 15 min per 5 giorni. Time-lapse immagini vengono esaminati direttamente a misurare i comportamenti cellulari che possono includere meccanismi e la frequenza della formazione delle cellule colonia entro le prime 24 ore di placcatura cellule (aggregazione contro proliferazione cellulare), l'incidenza di apoptosi, e la graduale eliminazione di cambiamenti morfologici. Singola cella di monitoraggio viene utilizzato per generare mappe di cellule destino per la misurazione della durata delle singole celle e le indagini dei modelli di divisione cellulare. I dati quantitativi sono analizzati statisticamente per valutare le differenze significative nel comportamento correlati con specifiche lesioni genetiche.

Introduction

Modelli di topi geneticamente ingegnerizzati sono strumenti per studiare e capire come diverse lesioni genetiche contribuiscono al rischio di sviluppare il cancro al seno. Ad esempio, i topi geneticamente modificati hanno dimostrato che la combinazione di tre fattori: perdita del full-length del cancro al seno 1, ad esordio precoce (BRCA1) gene in cellule epiteliali mammarie, proteina p53 tumore (TP53) della linea germinale haploinsufficiency, e delle ghiandole mammarie epiteliali cellula bersaglio up-regolata estrogeni recettore alfa (ERa) risultati di espressione nello sviluppo del cancro mammario nel 100% dei Brca1 ^{floxed (f) Virus del tumore 11/f11/Mouse mammaria (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse transattivatore della tetraciclina (rtTA} topi di 12 mesi di età rispetto alle percentuali più basse riportate in Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + /} - topi senza ERa over-espressione (~ 50 - 60%) e BRCA1 topi ^{f11/f11/MMTV-Cre} senza TP53 haploinsufcienza (<5%). ¹

Dinamica time-lapse imaging del comportamento di preneoplastiche primarie cellule epiteliali mammarie rivela differenze nel comportamento cellulare che sono meno facilmente apprezzati in sezioni di tessuto statiche. Alterazioni nella proliferazione e la differenziazione sono stati osservati in cellule primarie mammarie dai vettori umani mutazione BRCA1. ² Creazione di monocellulari sospensioni primarie di cellule epiteliali mammarie normali e di topi geneticamente ingegnerizzati sono generati attraverso la dissociazione enzimatica del tessuto ghiandolare mammario asportato. ³ Time-lapse le immagini vengono visualizzate per valutare meccanismi ed i tempi di comparsa delle cellule delle colonie e l'incidenza di cambiamenti morfologici nelle cellule tra cui transizione epitelio-mesenchimale (EMT) e l'apoptosi. Generazione di mappe destino cellulare, la quantificazione del periodo di tempo tra divisioni cellulari (cellule vite), e la determinazione di modelli di divisione cellulare è facilitata dall'utilizzo di singola cellula inseguimento. TimmTracking Tool 's (TTT) è un software disponibile pubblicamente usato per generare monocellulari mappe destino. La sua utilità nel chiarire i meccanismi di destino cellulare è stata stabilita ^4,5 esaminando normale sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche ^6-9 e la generazione di neuroni. ¹⁰

Protocol

1. Schema generale

1. Generazione di colture primarie di cellule epiteliali mammarie preneoplastiche da ghiandole mammarie di ingegneria genetica e controllo topi wild-type.
2. Cattura immagini dal vivo di cellule ogni 15 min con un'immagine software Volocity di acquisizione (versione 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) per un massimo di 5 giorni.
3. Vista time-lapse immagini direttamente per valutare i tempi e meccanismo di formazione delle cellule epiteliali colonie, l'incidenza di apoptosi, e la graduale di cambiamenti morfologici.
4. Convertire Volocity generato. Pile TIFF a. File JPG utilizzando Automation Microscopia MetaMorph & Analysis Software immagini (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) e rinominare i file di immagini digitali (la ridenominazione 2.1.6, http://www.softpedia.com/get / Sistema / Gestione di file / THE-Rename.shtml ) per garantire la compatibilità con il software di monitoraggio strumento Timm (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "target =" _blank "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html).
5. Utilizzando TTT, generare mappe cellulari destino per la determinazione del tempo che intercorre tra divisioni cellulari (vite cellulari) e dei modelli di divisione cellulare (simmetrica rispetto asimmetrica).
6. Analizzare i dati quantitativi di passaggi 3 e 5 di cui sopra per determinare se ci sono differenze statisticamente significative tra i diversi modelli di topi geneticamente modificati e / o di tipo selvatico controlli.

2. Generazione di colture primarie di cellule epiteliali mammarie

1. Preparare supporti completi per l'isolamento di singole cellule epiteliali mammarie a seguito di una variazione di istruzioni del produttore (EpiCult-B mouse Media Kit, Stemcell Technologies, Vancouver, BC). Combinare 450 ml Epi-Cult-B media, 50 ml Epi-Cult B integratore proliferazione, 5% siero fetale bovino (FBS), 50 ug / ml di penicillina / streptomicina (PenStrep) e 10 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF).
2. Preparare dissociazione supporti combinando 1 parte di un 10x Collagenasi / Ialuronidasi miscela con 9 parti multimediali complete da 2.1.
3. Eutanasia mouse e procedere immediatamente a necroscopia. Posizionare il mouse sul dorso su una piattaforma necroscopia polistirolo e fissare tutti e quattro gli arti così la pelle ventrale è tesa. Saturare pelle ventrale e capelli, compresa quella sovrastante gli arti, con il 70% di etanolo. Esporre # 2/3 (toracica) e # 4/5 (inguinale) ghiandole mammarie facendo una incisione mediana attraverso la pelle (non inserire il peritoneo), che si estende in un Y-incisione attraverso la pelle mediale di ciascun arto anteriore e rovesciata incisione a Y attraverso la cute mediale di ogni arto posteriore.
4. Utilizzando smussa, separare la pelle dal underlyingperitoneum, tirare indietro su entrambi i lati della pelle fino a quando non è teso, e fissarlo alla piattaforma necroscopia polistirolo con perni. Partendo dal lato esterno, utilizzare smussa con uso giudizioso di Disseforbici ction per isolare il inguinale intatto e / o toracici ghiandole mammarie dal sottostante tessuto connettivo e muscolare. Inserire non più di due ghiandole mammarie in un 10 cm piastra di Petri sterile e passare alla cappa di coltura tissutale.
5. Nella cappa di coltura, per esaminare le ghiandole linfonodi mammari che sono identificati come piccole, ben circoscritti noduli con un colore giallastro. Rimuovere linfonodi dalla ghiandola circostante con bisturi sterile e pinzette. Tritare tessuto mammario in ~ 1 mm ³ cubi con due bisturi sterili, uno in ogni mano.
6. Posto tritata tessuto mammario in 5 ml di dissociazione Media, mescolare delicatamente pipettando su e giù 2-3 volte usando una pipetta 10 ml, ed incubare una notte (fino a ~ 16 ore) in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO ₂ in un provetta da 50 ml con tappo allentato.
7. La mattina dopo, preparare una miscela fredda di soluzione salina bilanciata di Hanks 1 parte '(HBSS) contenente 2% di FBS e 4 parti tamponata di cloruro di ammonio soluzione per promuovere rosso bllisi cellulare ood (HFAmCl) nonché HBSS freddo addizionato con 2% FBS (HF). Pre-riscaldare Tripsina-EDTA (0,25%), 5 mg / ml in dispasi soluzione salina bilanciata di Hank Modified, 1 mg / ml DNasi I, e mezzi completi.
8. Rimuovere il tubo conico da centrifuga con il tessuto mammario dal termostato e delicatamente impulsi vortice 2-3 sec due volte. Centrifugare la provetta a 450 g per 5 min (temperatura ambiente oa 4 ° C), ed eliminare il surnatante.
9. Risospendere il pellet in un minimo di 10 HFAmCl ml e centrifugare a 450 g per 5 min (temperatura ambiente oa 4 ° C) ed eliminare il surnatante.
10. Aggiungere 3 ml di Tripsina-EDTA al pellet e mescolare prima con una pipetta da 5 ml e poi con una micropipetta P1000 fino filamentoso (1-3 min). Aggiungere 10 ml di HF, centrifugare a 450 g per 5 min (temperatura ambiente oa 4 ° C) ed eliminare il surnatante.
11. Aggiungere 2 ml di 5 mg / ml dispasi e 200 microlitri di 1 mg / ml DNasi I pellet e mescolare con una micropipetta P1000 per 1 min. Campione deve essere cloudy ma non filante. Se filante, aggiungere 100 ml di DNasi I e mescolare ancora.
12. Aggiungere 10 ml fredda HF, filtrare con un colino cella 40 um e centrifugare a 450 g per 5 min (temperatura ambiente oa 4 ° C) ed eliminare il surnatante.
13. Risospendere il pellet finale in Media completi. Quantificare il numero totale di cellule (utilizzando un emocitometro o Coulter Counter). Due ghiandole mammarie ottenere approssimativamente 1 x 10 ⁶ a 1 x 10 ⁷ cellule. Piastra cellule primarie epiteliali in un fondo piatto piastra da 6 pozzetti ad una densità di 1,5 x 10 ⁵ cellule per pozzetto.

3. Live-cell imaging

1. Subito dopo placcatura cellule, posizionare il piastra da 6 pozzetti sicuro su un palco microscopio di un 5% di CO ₂ / saturo humidity/37 ° C Temperatura della camera di incubazione. Regolare il condensatore per l'illuminazione Kohler e il centro degli anelli di fase. Per gli esperimenti qui presentati, una rovesciata Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Spinning Disc Confocalsistema di microscopia in contrasto di fase widefield modalità con una lente obiettivo 10x è stato utilizzato.
2. Aprire il software di acquisizione delle immagini, creare e denominare una biblioteca per i time-lapse immagini, e salvare in una posizione con spazio sufficiente per i file di grandi dimensioni. Gli esperimenti qui presentati utilizzato un'immagine software Volocity di acquisizione (versione 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA).
3. Consentire alla piastra di equilibrare nel microscopio incubatore per almeno 15 min. Abbassare le lenti per evitare la fase-obiettivo interferenze. Sotto il titolo "Stage", selezionare "Calibrare Stage". Riacquisire il piano focale, insieme Z = zero ai punti di imaging x, y, z scheda e segnare selezionando "Aggiungi punto" nella sezione "Stage" voce. Inserire punti al centro di ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti per l'imaging come l'imaging a contrasto di fase possono essere distorte vicino alla periferia di pozzi di plastica. Disporre i punti in una piazza in 4 x 4 campi (650 micron x 700 micron campi), ciascuno con una sovrapposizione di piccole dimensioni (circa il 5%). Salvare i punti selezionati in "Stage. "
4. In "Stage" selezionare "Crea mappa focus" e seguire le istruzioni per impostare la messa a fuoco di ogni punto. Impostare tempi di acquisizione dell'immagine e catturarne 4 immagini all'ora (ogni 15 min). Questo può essere regolato a seconda delle esigenze del test specifico. Salvare la mappa di messa a fuoco in "Stage".
5. Fare clic destro sulla destra "Acquisizione di immagini di" strumento bar a bordo e salvare le impostazioni di imaging. Premere il pulsante di registrazione per iniziare l'imaging. Dopo 1 ora, controllare la messa a fuoco delle immagini per vedere se è necessaria una regolazione.
6. Monitorare e continuare l'imaging dal vivo per 5 giorni, che termina quando le cellule diventano confluenti.

4. Visualizzazione diretta di time-lapse immagini per valutare i tempi e Meccanismo di Formazione Iniziale epiteliale Colony cellulare, Incidenza di apoptosi, e fase di cambiamenti morfologici

1. Visione diretta del time-lapse immagini possono essere effettuare compatibile con qualsiasi software di visualizzazione video (ad esempio http:/ / Www.real.com/ realplayer o altri software freeware o disponibile in commercio). Le immagini possono essere visualizzate in formato. TIFF in questo passaggio o dopo la conversione in file JPG. (Vedere il punto 5).
2. Per determinare meccanismo di formazione della colonia iniziale, inizia con una immagine singola pila rappresenta un sito di imaging sulla piastra. In frames iniziali, le cellule saranno galleggiante. Seguire immagini seriali per determinare quando la prima cellula epiteliale aderisce alla piastra. In questa fase, le cellule epiteliali possono essere identificati e differenziati da fibroblasti di loro morfologia più cuboidale. Segui questa singola cellula epiteliale attraverso immagini seriali e seguire il suo destino nei successivi 24 ore. Registrare se diventa circondata da altre cellule epiteliali o subisce divisione cellulare o apoptosi. Se circondata da cellule epiteliali, il meccanismo di formazione di colonie può essere determinata direttamente visualizzando se le cellule circostanti sono derivati ​​da cellule galleggianti che poi aggregato con la cellula iniziale aderente (s) odalla divisione della cellula iniziale aderente. Registrare il numero di colonie formate da aggregazione cellulare rispetto divisione cellulare durante le prime 24 ore.
3. Per determinare il numero di cellule aderenti inizialmente che subiscono apoptosi in un periodo di tempo specifico, seguite immagini seriali per la comparsa di caratteristiche classiche di sviluppo apoptosi in una cellula che è stata aderente ( http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ), e il numero di cellule apoptotiche identificati durante l'intera durata del imaging o in tempi specifici registrata.
4. Nel corso del tempo, le cellule epiteliali in coltura alterare la loro morfologia da una forma iniziale cuboidali ad un aspetto più allungato coerente con EMT. Segui le immagini seriali per determinare il giorno / ora dopo placcatura quando ciò si verifica.

5. Image File Modifica

1. Rinominare le cartelle di immagini e file in base ai requisiti per il software Tracking Tool Timm Utilizzare un programma freeware come il 2.1.6 Rinomina ( http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml ) per rinominare i file in gruppi. Creare una cartella contenente tutte le cartelle ei file della sperimentazione e il nome della cartella (ad esempio,
2. Creare una sottocartella per ogni punto / posizione in cui è stato ripreso la cultura. Denominare le sottocartelle: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Il numero di posizione dovrebbe avere 3 cifre. Esempio: 072511RN_p001. Mettere tutti i file di immagine di tale posizione individuale nella sottocartella.
3. Aggiungere il timepoint (utilizzando 5 cifre) e numero di canale (poiché vi è un solo canale in campo chiaro, utilizzare "0") alla fine di ogni nome di file in questo formato:
   EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg
4. Generare un file di log per ogni posizione per prima cosa scaricare il programma gratuito TTTlogfileconverter dal sito TTT. Avviare il programma TTTlogfileconverter e selezionare la cartella esperimento. Un intervallo di ingresso dell'immagine (in secondi). Per una foto scattata ogni 15 minuti, immettere 900 sec. Quindi, premere il pulsante verde segreto dei file di log.

6. Generazione di Mappe Cellulari destino delle cellule singole Utilizzo TTT

1. CReate una cartella chiamata TTTexport e una sottocartella denominata TTTfiles in cui tutti i dati delle celle di tracciamento saranno conservati secondo le istruzioni del software TTT
2. Avviare il programma di TTT, selezionare iniziali dell'utente e fare clic su "Continua".
3. Premere il tasto "Set NAS", selezionare l'utente creato cartella "TTTexport", e fare clic su Ok. Nel browser, selezionare una cartella di esperimento, selezionare una cartella di posizione, quindi premere "posizione Carica" ​​pulsante.
4. Impostare il fattore oculare di "10x". Caricare il numero di immagini richieste (carico tutte le immagini è raccomandato per la prima volta).
5. Nella finestra della cella editor, selezionare "Nuova colonia" nel menu File. Nella finestra del filmato, premere il tasto "cella Track" o F2 per iniziare a tracciare una cella.
6. Identificare una cella del MOvie finestra e uso del mouse per posizionare il cursore sulla cella. Un cerchio con il numero della cella dovrebbe apparire dopo F2 è stato fatto clic. Utilizzare il tasto "0" sul tastierino numerico della tastiera per monitorare il posizionamento della cella e passare alla foto successiva. Spostare il cursore per rispettare la posizione di ogni cella in ogni fotogramma. Per cancellare una traccia e tornare alla precedente immagine premere il tasto "Canc" del tastierino numerico. Per spostare i fotogrammi in avanti senza il tracciamento della stampa cella "3", e per tornare indietro senza di monitoraggio premere il tasto "1" del tastierino numerico.
7. Per contrassegnare una divisione cellulare fare clic sul pulsante "divisione" nella finestra del filmato. Per celebrare la morte cellulare fare clic su "morte cellulare" nella finestra del filmato. Una volta che si è verificata una divisione, le cellule figlie possono essere monitorati nella stessa mappa destino della cellula facendo clic destro sul simbolo del cerchio della cellula figlia designato nella finestra dell'editor cella per iniziare a monitorare automaticamente in modalità.
8. Premere F10 per salvare l'albero. Ogni albero salverà nella piega di uscita designatoer (TTTExport). Per avviare una nuova mappa destino cellulare, selezionare "Nuova colonia" sotto "File" e poi dal menu "Apri" nella finestra dell'editor cella.
9. Riportino in una tabella i dati di durata delle celle dopo aver raccolto da "Cell dati" scheda nella finestra dell'editor cella.

7. Analisi statistiche

1. Utilizzare Student t-test (se confrontare due genotipi) o ANOVA (se confrontando> due genotipi) per determinare se le differenze nei dati parametrici come il numero di colonie di cellule iniziali, la durata delle cellule o ore fino alla comparsa di EMT tra diversi genotipi sono statisticamente significativa. Frequenza apoptotica può essere paragonato come il numero / numero totale di cellule placcati con Student t-test o ANOVA o con Mann-Whitney o Kruskal-Wallis quando derivato come percentuale di cellule aderenti.
2. Eseguire i test di potenza usando i dati da una analisi dei primi esperimenti per determinare il numero di repliche sperimentali devono svolgere e mappe destino cellulare generato da ciascun campione replicato per s adeguatopotenza tatistical utilizzando freeware disponibile (ad esempio http://statpages.org/ ). Negli esperimenti qui presentati, colture di cellule derivate da tre topi per genotipo sono stati sufficienti a determinare se ci fossero differenze statisticamente significative nella formazione delle cellule delle colonie e la durata delle celle quando specifiche modificazioni genetiche sono state fatte.

Representative Results

Cellule epiteliali e fibroblasti può essere distinto da morfologia cellulare. Cellule epiteliali hanno una forma cubica (Figura 1A-B) e formano colonie di cellule (Figura 1A). Fibroblasti, un tipo di cellule stromali, hanno una morfologia allungata (Figura 1C).

Le cellule sono state arrotondate e galleggianti all'insorgenza di imaging (Figura 2A-D). Dopo fissaggio alla piastra piatta e sono diventati dimostrato un aspetto di tipo cubico (Figura 2E, H). Da 4 giorni di coltura la maggioranza delle cellule epiteliali allungata in un EMT-morfologia simile (Figura 2I-L). Questo cambiamento si è verificato con la cronologia stessa in tutti i genotipi studiati. Alcune immagini digitali erano sfocate perché l'illuminazione Kohler e anello di allineamento di fase non è stato impostato correttamente (Figura 2D, H, L).

Le cellule galleggianti sviluppate in cui coloni individuale delle cellule epitelialies da 24 ore dopo la placcatura (Figura 3A, B). Analisi delle immagini di serie ha rivelato che queste colonie sono state generate da aggregazione delle cellule piuttosto che la divisione cellulare. Mentre interruzione di Brca1 per sé non ha modificato il numero di colonie formate, aggiunta di TP53 haploinsufficiency ridotto significativamente il numero di colonie formate e aggiunta di ERa-espressione significativamente aumentato il numero di colonie formate (Figura 3C).

È fondamentale monitorare le immagini digitali acquisite e regolare la messa a fuoco mappa frequentemente durante le prime 24 ore come cellule collegare alla piastra e poi almeno due volte al giorno per garantire le cellule rimangono a fuoco e culture non sono contaminati. La precisione delle analisi è compromessa se ​​le cellule sotto forma di immagini non sono a fuoco (Figura 4).

Nell'esperimento rappresentante qui presentata, una domanda fondamentale è stato quello di determinare se i cambiamenti a livello di espressiones di geni noti per influenzare il rischio del cancro della mammella (BRCA1, TP53, e recettore per gli estrogeni 1 (ESR1) ¹⁾ ha modificato il numero di ore tra le divisioni cellulari (durata di vita delle cellule) o influenzato i modelli di divisione (simmetrica rispetto asimmetrica) in non-cancerose primarie cellule epiteliali mammarie. A tale scopo, le singole mappe destino cellulare (alberi) sono stati generati utilizzando TTT. Esempi di mappe rappresentativi destino cellulare per ciascuno dei quattro genotipi testati sono illustrati (Figura 5A-D). I quattro genotipi delle cellule testati erano wild-type (nessuna manipolazione genetica) (Figura 5A), perdita di lunghezza intera Brca1 (Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre)} (Figura 5B), perdita di intera lunghezza Brca1 in combinazione con TP53 haploinsufficiency (Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -)} (Figura 5C), e la perdita di full-length Brca1 in combinazione con TP53 haploinsufficirenza e di guadagno di ESR1 (Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER)} (Figura 5D). Generazione di mappe destino cellulare è stato interrotto quando le cellule si confluenti (~ 3-4 generazioni), in quanto il monitoraggio inequivocabile di singole cellule non era più possibile dopo tale. Generazione 0 (tempo di prima divisione cellulare) non è stato incluso nelle analisi di vite cellulare, perché la durata del generazione 0 è stata più lunga e più variabile rispetto alle generazioni successive. Generazioni 1, 2, 3 e 4 sono stati raggruppati per le analisi finali, perché non vi erano differenze significative nella durata media di cellule o di errore standard della media (SEM) tra queste generazioni. I confronti di vite cellulari medi tra i diversi genotipi (Figura 5E) ha rivelato che la perdita di un intera lunghezza Brca1 ridotto il numero di ore tra divisioni cellulari dal 21,3 ± 1,6 ore (wild-type) a 16,5 ± 1,0 ore (Brca1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre).} Nodamente, anche se la perdita di un allele TP53 oltre alla perdita di intera lunghezza BRCA1 è associato ad un aumento significativo Sviluppo1 cancro mammario, significa durata cella era invariata (16,3 ± 1,2 hr) rispetto ai topi mancanti Brca1 solo. È interessante notare che guadagno di ESR1 in Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} topi restaurato vita cellulare la durata di vicino wild-type livelli (19.3 ± 2.1 ore), anche se questi topi hanno la più alta incidenza di sviluppo del cancro mammario di tutti i modelli studiati here.1 Questi risultati indicano che la perdita di un intera lunghezza Brca1 non era invariabilmente associato a una cella di vita ridotta, invece questo è stato modificato da un eccesso di espressa ERa. Possibili prossimo passo gli esperimenti che utilizzano questa tecnologia potrebbe essere esperimenti dose-risposta con estrogeni diverse, altri fattori di crescita, o terapeutiche candidati per misurare il loro impatto sulla vita delle cellule nel backgro genetico diversoONDI. In contrasto con l'impatto sulla durata cella durata, nessuna delle alterazioni genetiche studiato qui alterati pattern divisione cellulare.

Figura 1. Aspetto di una colonia di cellule epiteliali (A), delle cellule epiteliali (B), e fibroblasti (C) di time-lapse imaging. Cellule epiteliali appaiono più cubico mentre fibroblasti appare più allungata. Bar size = 50 micron.

Figura 2. Rappresentative di serie time-lapse immagini dal tempo 0, 2 e 4 giorni dimostrare cambiamenti nella morfologia cellulare nel tempo e differenze di aspetto con e senza Kohler illuminazione. Al tempo 0 le cellule placcati sono galleggianti (AD frecce), da due giorni in coltura stanno aderente e può presentare una morfologia di tipo cubico (frecce spesse E, H) e da quattro giorni in coltura sono allungati e dimostrano una EMT-morfologia simile (sottile IL frecce). Kohler illuminazione è presente in pannelli AC, EG, e IK. Pannelli D, H e L illustrare le immagini senza illuminazione Kohler. Le immagini mostrate sono, dal punto di imaging stesso nel corso del tempo. Bar Dimensione = 200 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. Numero di colonie di cellule epiteliali a 1 giorno variata genotipo. (A) arrotondato cellule galleggianti all'inizio del time-lapse imaging. (B) Due colonie di cellule epiteliali di rappresentanza (frecce). (C) Numero di epitelicolonie cellulari l / telaio formato a 24 ore variata genotipo. Grafici a barre illustrare l'errore medio e standard della media. * P <0.05, ANOVA. Bar Dimensione = 200 micron. Le cellule isolate da ghiandole mammarie, senza tumore palpabile da 10 - a 12-month-old Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), Brca1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / -} (n = 3), Brca1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3), e wild-type (n = 3) topi sono stati ripresi per gli studi. Cinque esperimenti di imaging indipendenti composti da diverse combinazioni di topi wild-type e geneticamente modificati sono stati eseguiti. Media contenuta rosso fenolo. No estrogeni è stato aggiunto. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4. Out-of-focus immagini non possono essere precisimente analizzato. Prima di imaging la piastra, la piastra deve sedersi in incubatore di imaging per 15 minuti per equilibrare. Durante il primo giorno di imaging, l'attenzione dovrebbe essere controllato e regolato ogni poche ore. Dopo di che deve essere controllato due volte al giorno, ma rimane generalmente più stabile. La freccia indica un out-of-focus colonia di cellule epiteliali.

. Figura 5 Cellulari mappe destino generati da singole cellule di monitoraggio con TTT per (A) wild-type, (B) Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre,} (C) Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -,} e (D) Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER} topi. Cellule che non possono essere monitorati a causa della perdita di frame o in uno strato di cellule confluenti sono indicati da un punto interrogativo. Quando non punto interrogativoindicato, il monitoraggio è stato volutamente chiuso a causa di confluenza delle cellule e l'incapacità di seguire in modo inequivocabile singola cellula destino. (E) Media durata delle celle varia dal genotipo. I grafici a barre mostrano l'errore medio e standard dei tempi di vita media delle celle (tempo che intercorre tra divisioni cellulari), nel corso delle generazioni 1-4 per ciascun genotipo. Significa vite cellulari erano significativamente più breve nel cellule epiteliali mammarie derivate da Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} e Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -} rispetto ai topi wild-type. * P <0.05, ANOVA. Le cellule isolate da ghiandole mammarie, senza tumore palpabile da 10 - a 12-month-old Brca1 ^{f11/f11/MMTV-Cre} (n = 4), Brca1 ^{f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / -} (n = 3), Brca1 ^{f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA} (n = 3), e wild-type (n = 3) topi sono stati ripresi per gli studi. Cinque esperimenti di imaging indipendenti composti da diverse combinazioni di wild-type e geneticamente engineered topi sono stati eseguiti. Media contenuta rosso fenolo. No estrogeni è stato aggiunto. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussion

Passaggi critici

È importante garantire che ghiandole mammarie sono raccolti da topi della stessa età per controllare legate all'età variabilità mammaria comportamento delle cellule epiteliali. Quando le cellule placcatura, lo stesso numero di celle deve essere placcato in ogni pozzetto per ogni esperimento. Le cellule devono essere relativamente sparsa quando placcatura in modo che le culture non diventino confluenti troppo rapidamente rendendo possibile seguire più celle individuali attraverso immagini seriali. È essenziale che la piastra essere equilibrati in incubatrice prima di imaging perché il focus cambierà dopo la piastra è equilibrata. Una volta che ha iniziato l'imaging, l'attenzione deve essere controllata di frequente e regolare, se necessario, soprattutto entro le prime 24 ore. È importante avere la temperatura del regolamentato incubatore e pre-riscaldata. Il numero di persone che entrano ed escono dalla stanza deve essere limitata il più possibile. Si consiglia di praticare tutti gli aspetti della Setting l'esperimento in anticipo per garantire la riproducibilità e il controllo di qualità. Come per esperimenti di coltura tutti i cellulari, la sterilità è una questione importante e standard di sterili pratiche di coltura cellulare deve essere usato in ogni momento.

Salvare e manipolare i grandi file di immagini richiede una notevole quantità di spazio di memoria. Un disco di rete condivisa o dischi rigidi portatili possono essere usati. Una volta che i file vengono convertiti, è importante assicurarsi che le immagini sono costantemente il nome corretto e messo in cartelle corrispondenti. Salva frequente di dati digitali devono essere effettuate durante tutto il processo.

Limitazioni

Questo metodo utilizza un 2-D sistema di coltura che non consente l'analisi delle differenze di comportamento che potrebbe emergere in un 3-D sistema di coltura. Durate di vite cellulari possono essere riproducibile misurata dopo la prima divisione cellulare osservato come il numero di ore per divisione cellulare successivo initplaccatura ial delle cellule è variabile.

Eventuali modifiche

A seconda delle esigenze dell'esperimento, time lapse immagini possono essere presi più o meno frequentemente. Ad esempio, se transitori strutture cellulari sono da quantificare, un intervallo di 5 secondi può essere più appropriato. Altre procedure per la generazione di colture primarie di cellule epiteliali mammarie possono essere utilizzati. Qualsiasi apparecchiatura di immagine può essere utilizzato per creare il time-lapse imaging, purché sia ​​in grado di soddisfare i requisiti del dell'esperimento. Sistemi alternativi per singola cellula di monitoraggio può essere impiegato. Per la procedura qui descritta, una norma fondo piatto in plastica piastra da 6 pozzetti era adeguata. Stoviglie in plastica può essere utilizzata per tutti gli obiettivi a lungo aria distanza di lavoro come 4x, 10x, e 20x. È importante scegliere regioni vicino al centro dei piatti di plastica quando si esegue l'imaging contrasto di fase, poiché la plastica è curva in prossimità dei bordi più piatti e distorce la luce.Dei vetri di copertura pozzetti di vetro spessore fondo sarebbe necessario per le lenti normali distanze di lavoro ad immersione (olio, acqua, glicerina, ecc), che sono in genere a maggiore ingrandimento.

Risoluzione dei problemi

Quando le cellule sono placcati, media dovrebbe essere sufficiente per mantenere la crescita cellulare per 5 giorni per diminuire la necessità di manipolare la piastra sulla scena, tuttavia, se necessario, possono essere aggiunti supporti. Si raccomanda di evaporazione essere ridotto al minimo. L'essiccazione deve essere gestita mettendo 3-4 piatti di acqua deionizzata sterile all'interno dell'incubatrice e la ricarica quando necessario. È possibile riempire i pozzetti non utilizzati della piastra da 6 pozzetti con acqua sterile deionizzata.

Se le immagini non vengono caricate nel programma TTT, controllare e verificare che i file e le cartelle sono disposte e il nome corretto. Successivamente, verificare se il file di log si trova nella cartella corretta (vedi punto 5.5).

Future l'applicazione o la direzione tecnica dopo il mastering

La stessa procedura generale può essere utilizzato per analizzare il comportamento di altri tipi di cellule umane primarie comprese cellule epiteliali mammarie così come cellule di cancro al seno. Per esempio, genotipica comportamento specifico e / o risposta a trattamenti candidati possono essere analizzati. Popolazioni cellulari in alternativa, l'imaging di fluorescenza-activated cell (FAC) filtrate potrebbe essere eseguita o etichette fluorescenti aggiunto per monitorare specifici tipi cellulari.

Significato di questa tecnica rispetto a metodi esistenti

L'aggiunta di time-lapse imaging e analisi del comportamento di cellule nel tempo alla coltura cellulare tradizionale e tecniche di etichettatura fornisce dati quantitativi da singole cellule nel corso del tempo, piuttosto che solo la dinamica delle popolazioni intere. Questa tecnica permette di cellule singole da osservare continuamente, a differenza dei metodi tradizionali che permettono l'osservazione solo a punti temporali discreti. Mnoltre, i metodi tradizionali richiedono le cellule essere disturbati prendendo in e fuori dell'incubatore per visualizzare sotto un microscopio considerando che l'approccio qui descritto permette alle cellule di osservare senza essere trasferito. Infine, time-lapse imaging fornisce una registrazione durevole delle cellule sotto osservazione che possono essere restituiti a per ulteriori analisi. L'uso di TTT per monitorare il comportamento individuale cella consente un'analisi inequivocabile di parametri multipli e non richiede l'uso di un marcatore fluorescente per localizzare le cellule specifiche sotto osservazione. La tecnica rivela differenze nel comportamento delle cellule epiteliali mammarie che sono difficili da misurare in sezioni di tessuto statiche della ghiandola mammaria. Misurazioni vita Cellulari quantificare il numero di ore tra eventi mitotici. Questa misura fornisce dati specifici per il numero effettivo di ore tra divisioni cellulari che indica la lunghezza del ciclo cellulare in ore. Un ricercatore può utilizzare questi dati per determinare comespecifiche modificazioni genetiche o cultura impatto normali condizioni di ciclo cellulare.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiCult-B Basal Medium Mouse	StemCell Technologies	05610
EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse	StemCell Technologies	05612
recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF)	StemCell Technologies	02633
Collagenase/Hyaluronidase	StemCell Technologies	07912
Disposable Scapels	Feather	2975#10
Hanks' Balanced Salt Solution	StemCell Technologies	37150
Ammonium Chloride	StemCell Technologies	07800
Tryspin-EDTA	StemCell Technologies	07901
Dispase	StemCell Technologies	07913
DNase I	StemCell Technologies	07900
40 μm cell strainer	StemCell Technologies	27305
FBS	StemCell Technologies	06100
PenStrep	Gibco	15140