Summary
Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.
Abstract
Time-lapse imaging kunnen worden gebruikt om het gedrag van gekweekte primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen uit verschillende genetisch gemanipuleerde muizen modellen van borstkanker te vergelijken. Zo kan tijd tussen celdelingen (cel levensduur), apoptotische aantal cellen, evolutie van morfologische veranderingen, en het mechanisme van kolonievorming worden gekwantificeerd en vergeleken cellen die specifieke genetische lesies. Primaire borstklier epitheliale celculturen worden gegenereerd uit melkklieren, zonder voelbare tumor. Klieren zijn zorgvuldig gereseceerd met duidelijke scheiding van aangrenzende spieren, worden lymfeklieren verwijderd, en single-cell suspensies van verrijkte borstklier epitheliale cellen worden gegenereerd door hakken borstweefsel gevolgd door enzymatische dissociatie en filtratie. Eencellige suspensies worden uitgeplaat en direct onder een microscoop in een incubator kamer voor levende cellen imaging. Zestien 650 um x 700 urn velden in een 4x4-configuratie van elk well van een 6-well plaat belicht worden elke 15 minuten gedurende 5 dagen. Time-lapse beelden worden onderzocht rechtstreeks cellulaire gedrag dat mechanisme en de frequentie van kolonievorming cellen kunnen bestaan binnen de eerste 24 uur van het uitplaten van de cellen (aggregatie versus celproliferatie), incidentie van apoptose en fasering van morfologische veranderingen te meten. Single-cell tracking wordt gebruikt om lot van de cel kaarten voor het meten van individuele cel levens en het onderzoek van de celdeling patronen te genereren. Kwantitatieve gegevens worden statistisch geanalyseerd voor de evaluatie significante verschillen in gedrag gecorreleerd met specifieke genetische lesies.
Introduction
Genetisch gemanipuleerde muismodellen zijn instrumenten te bestuderen en te begrijpen hoe verschillende genetische afwijkingen bijdragen aan het risico op het ontwikkelen van borstkanker. Bijvoorbeeld genetisch gemanipuleerde muizen aangetoond dat de combinatie van drie factoren: verlies van de volledige lengte borstkanker 1, early onset (BRCA1) gen in mammaire epitheelcellen, p53 tumor (TP53) germinale haploinsufficiëntie en mammaire epitheliale cel gerichte upgereguleerd oestrogeen receptor alpha (ERa) expressie resulteert in de ontwikkeling van borstkanker in 100% van BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse borsttumorvirus (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse tetracycline transactivator (rtTA muizen met 12 maanden in vergelijking met de lagere percentages gerapporteerd in BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - muizen zonder ERa over-expressie (~ 50 - 60%) en BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre muizen zonder TP53 haploinsufficiëntie (<5%) 1.
Dynamic time-lapse beeldvorming van het gedrag van preneoplastische primaire mammaire epitheelcellen toont verschillen in celgedrag die minder gemakkelijk gewaardeerd statische weefselcoupes. Veranderingen in proliferatie en differentiatie worden waargenomen in primaire borstklieren cellen van menselijke BRCA1 mutatie dragers. 2 Oprichting van single-cell suspensies van primaire borstklier epitheliale cellen van normale en genetisch gemanipuleerde muizen worden gegenereerd door middel van enzymatische dissociatie van operatief verwijderde borstklierweefsel. 3 Time-lapse beelden worden bekeken op mechanisme en de timing van cel kolonie uiterlijk en de incidentie van morfologische veranderingen in cellen met inbegrip van epitheliale-mesenchymale transitie (EMT) en apoptose te beoordelen. Genereren van lot van de cel kaarten, zijn kwantificering van de lengte van de tijd tussen celdelingen (cel levens), en de bepaling van de modellen van de celdeling vergemakkelijkt door het gebruik van single-cell tracking. TimmTracking Tool 's (TTT) is publiekelijk beschikbare software wordt gebruikt om single-lot van de cel kaarten te genereren. Het nut in ophelderen mechanismen van cel lot is vastgesteld 4,5 onderzoeken normale hematopoietische stamcellen ontwikkeling 6-9 en het genereren van neuronen 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Algemene Regeling
- Genereren primaire kweken van preneoplastische mammaire epitheelcellen melkklieren van genetisch gemanipuleerde en controle wild-type muizen.
- Het mogelijk 'live-cell beelden elke 15 min met behulp van Volocity beeld acquisitie software (versie 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) voor maximaal 5 dagen.
- Direct bekijken time-lapse beelden naar de timing en het mechanisme van epitheliale cellen kolonievorming, incidentie van apoptose, en fasering van morfologische veranderingen te beoordelen.
- Converteer gegenereerd Volocity. TIFF stacks aan. JPG-bestanden met behulp van Metamorph Microscopie Automation & Image Analysis Software (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) en naam van digitale beeldbestanden (DE Rename 2.1.6, http://www.softpedia.com/get / Systeem / Bestand-management / DE-Rename.shtml ) om de compatibiliteit met het Volgen van Tool Timm's (TTT mogelijk te maken,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html "target =" _blank "> http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html).
- Met behulp van TTT, genereren lot van de cel kaarten voor het bepalen van de tijd tussen celdelingen (cel levensduur) en de patronen van de celdeling (symmetrische versus asymmetrische).
- Analyseren kwantitatieve gegevens van stappen 3 en 5 om te bepalen of er statistisch significante verschillen tussen verschillende genetisch gemanipuleerde muis modellen en / of wild-type controles.
2. Generatie van primaire borstkanker epitheelcellen Cultures
- Bereid Compleet Media voor het isoleren van een borstklier epitheliale cellen na een variatie van instructies van de fabrikant (EpiCult-B Muis Medium Kit, Stemcell Technologies, Vancouver, BC). Combineer 450 ml Epi-Cult-B medium, 50 ml Epi-Cult B proliferatie supplement, 5% foetaal runderserum (FBS), 50 ug / ml penicilline / streptomycine (PenStrep) en 10 ng / ml epidermale groeifactor (EGF).
- Dissociatie Media bereiden door het combineren van een deel van een 10x Collagenase / Hyaluronidase mengsel met 9 onderdelen Complete Media van 2,1.
- Euthanaseren muis en onmiddellijk naar necropsie verricht. Plaats de muis op zijn rug op een piepschuim autopsie platform en zet alle vier de ledematen, zodat ventrale huid strak staat. Verzadig ventrale huid en haar, met inbegrip van die bovenop de ledematen, met 70% ethanol. Bloot # 2/3 (thorax) en # 4/5 (lies) melkklieren door een incisie door de huid (niet in de peritoneum) die in een Y-incisie verlengd door de mediale huid van elke voorste ledemaat en een omgekeerde Y incisie door de mediale huid van elke achterste ledematen.
- Met behulp van stompe dissectie, de huid te scheiden van underlyingperitoneum, terug te trekken aan beide zijden van de huid totdat het strak en bevestig het aan de piepschuim necropsy platform met behulp van pinnen. Vanaf de buitenzijde, stompe dissectie met verstandig gebruik van Dissectie schaar om de intacte lies en / of thoracale borstklieren van onderliggende bindweefsel en spieren te isoleren. Plaats niet meer dan twee melkklieren in een 10 cm steriele petrischaal en naar weefselkweek kap.
- In weefselkweek kap, onderzoeken klieren voor borstklieren lymfeklieren die zijn geïdentificeerd als kleine, welomschreven nodules met een geelachtige kleur. Verwijder lymfeklieren uit de omliggende klier met behulp van steriel scalpel en pincet. Mince borstweefsel in ~ 1 mm 3 blokjes met twee steriele scalpels, een in elke hand.
- Place gehakt borstweefsel in 5 ml Dissociation Media, mix voorzichtig en neer te pipetteren 2-3 keer met een 10 ml pipet, en incubeer overnacht (tot ongeveer 16 hr) in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 in een 50 ml conische buis met los deksel.
- De volgende ochtend bereiden een koud mengsel van Balanced Salt Solution 1 deel Hanks '(HBSS) die 2% FBS en 4 delen gebufferde ammoniumchlorideoplossing op rood bl viaood cellyse (HFAmCl) als koude HBSS aangevuld met 2% FBS (HF). Voorverwarmen trypsine-EDTA (0,25%), 5 mg / ml in Dispase Balanced Salt Solution Hank's Modified, 1 mg / ml DNase I, en Complete Media.
- Verwijder de conische centrifugebuis met het borstweefsel uit de incubator en zachtjes pulseren vortex 2-3 sec tweemaal. Centrifugeer het buisje bij 450 xg gedurende 5 minuten (kamertemperatuur of 4 ° C), en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in een minimum van 10 ml en centrifugeer HFAmCl bij 450 xg gedurende 5 minuten (kamertemperatuur of 4 ° C) en verwijder het supernatant.
- Voeg 3 ml trypsine-EDTA op de pellet en meng eerst met een 5 ml pipet en vervolgens met een P1000 micropipettor tot vezelig (1-3 min). Voeg 10 ml HF, centrifuge bij 450 x g gedurende 5 minuten (kamertemperatuur of 4 ° C) en verwijder het supernatant.
- Voeg 2 ml van 5 mg / ml Dispase en 200 ul 1 mg / ml DNase I van de pellet en meng met een P1000 micropipettor 1 minuut. Monster moet worden cloUdy maar niet draderig. Als vezelig, voeg 100 ul van DNase I en meng opnieuw.
- Voeg 10 ml koud HF, spanning door een 40 pm celzeef en centrifugeer bij 450 xg gedurende 5 minuten (kamertemperatuur of 4 ° C) en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de laatste pellet in Complete Media. Kwantificeren het totale aantal cellen (met een hemocytometer of Coulter Counter). Twee borstklieren opbrengst ongeveer 1 x 10 6 tot 1 x 10 7 cellen. Plaat primaire epitheliale cellen in een platbodem-6-well plaat met een dichtheid van 1,5 x 10 5 cellen per well.
3. Live-cell imaging
- Onmiddellijk na het uitplaten van de cellen stevig plaats de 6-well plaat op een microscooptafel in een 5% CO2 / verzadigde humidity/37 ° C temperatuur incubatiekamer. Pas de condensor voor Kohler verlichting en het centrum van de fasen. Voor de hier gepresenteerde experimenten, een omgekeerde Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Spinning Disc Confocalemicroscoopsysteem in groothoek fasecontrast mode met een 10x objectief gebruikt.
- Open beeldacquisitie software, maken en een naam van een bibliotheek voor de time-lapse beelden, en op te slaan op een locatie met voldoende ruimte voor grote bestanden. De experimenten die hier gebruikt Volocity beeld acquisitie software (versie 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA).
- Laat de plaat in de microscoop incubator equilibreren minimaal 15 minuten. Laat de lenzen aan stage-lens interferentie te voorkomen. Onder de "Stage" rubriek, selecteert u "Calibrate Stage." Opnieuw op te pakken het brandvlak, set Z = nul onder de x, y, z tab en merk beeldvorming punten door te kiezen voor "Add punt" onder de "Stage" rubriek. Plaats punten in het midden van elk putje van de 6-well plaat voor beeldvorming als fasecontrast beeldvorming kan worden vervormd nabij de omtrek van kunststof putjes. Regelen punten in een vierkant in 4 x 4 gebied (650 um x 700 urn velden), elk met een kleine overlap (ongeveer 5%). Sla de geselecteerde punten onder "Stage. "
- Onder "Stage" selecteer "Make aandacht kaart" en volg de instructies om de focus van elk punt. Stel beeldacquisitie timing om 4 foto's per uur (elke 15 min) vast te leggen. Dit kan worden aangepast aan de eisen van de specifieke experiment. Sla de focus kaart onder "Stage".
- Klik met de rechtermuisknop op de rechterkant werkbalk "Image Acquisition" en sla de beeldvorming instellingen. Druk op de opnameknop om de beeldvorming te beginnen. Na 1 uur, controleer dan de focus van de foto's om te zien of aanpassing nodig is.
- Monitor en blijven live beeldvorming gedurende 5 dagen, eindigt wanneer cellen confluent.
4. Direct Bekijken van Time-lapse beelden naar Timing en Mechanisme van Initial epitheelcellen Colony Vorming, incidentie van apoptose, en fasering van morfologische veranderingen beoordelen
- Directe weergave van time-lapse beelden kunnen uitvoeren met behulp van een compatibele video viewing software (bijv. http:/ / Www.real.com/ realplayer of andere freeware of in de handel verkrijgbare software). Afbeeldingen kunnen worden bekeken in. TIFF-indeling in deze stap of na conversie naar. JPG-bestanden (zie stap 5).
- Om het mechanisme van de initiële kolonievorming te bepalen, te beginnen met een single-image stack gelijk aan een beeldvorming site op de plaat. In de eerste frames zullen cellen te zweven. Volg seriële beelden te bepalen wanneer de eerste epitheelcel hecht aan de plaat. Bij deze stap kan epitheelcellen worden geïdentificeerd en onderscheiden van fibroblasten door de meer kubische morfologie. Volg deze enkele epitheelcellen via seriële beelden en volg zijn lot gedurende de volgende 24 uur. Neem als het wordt omringd door extra epitheelcellen of ondergaat celdeling of apoptose. Als omgeven door epitheelcellen, kan het mechanisme van kolonievorming direct worden bepaald door het bekijken als de omringende cellen afkomstig zijn van drijvende cellen die vervolgens aggregeren met de eerste hechtende cellen (s) ofvan verdeling van de eerste hechtende cel. Noteer het aantal kolonies gevormd door celaggregatie versus celdeling tijdens de eerste 24 uur.
- Het aantal eerste hechtende cellen die apoptose ondergaan gedurende een bepaalde periode te bepalen, volgt seriële beelden van het voorkomen van klassieke eigenschappen van apoptose ontwikkelen in een cel die is adherent ( http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html ), en het aantal apoptotische cellen die tijdens de gehele duur van de imaging of binnen bepaalde tijd frames opgenomen.
- Tijd, epitheliale cellen in kweek wijzigt hun morfologie van een eerste kubische vorm naar een meer langwerpige uiterlijk overeen met EMT. Volg seriële beelden naar de dag / uur te bepalen na plating wanneer dit gebeurt.
5. Image File Wijziging
- Wijzig de naam van het beeld mappen en bestanden op basis van de eisen voor Tracking Tool Timm's Gebruik een freeware programma als DE Rename 2.1.6 ( http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml ) om bestanden te hernoemen in groepen. Maak een map met daarin alle mappen en bestanden van het experiment en de naam van de map (bv.
- Maak een submap voor elk punt / positie waar de cultuur werd in beeld gebracht. Noem de submappen: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. De positie nummer moet 3 cijfers. Voorbeeld: 072511RN_p001. Plaats alle beeldbestanden van die individuele positie in de submap.
- Voeg de tijdpunt (met 5 cijfers) en het kanaalnummer (want er is maar een helder veld kanaal, gebruik dan "0") aan het eind van elke bestandsnaam in dit formaat:
EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg - Genereer een logbestand voor elke positie door eerst het downloaden van de gratis programma TTTlogfileconverter van de TTT website. Start het TTTlogfileconverter programma en selecteer het experiment map. Ingang een beeld interval (in seconden). Voor een foto genomen om de 15 minuten, voer 900 sec. Druk vervolgens op de groene geheime logbestanden te drukken.
6. Generatie van Cell Fate Kaarten van Single cellen met behulp van TTT
- Create een map met de naam TTTexport en een submap met de naam TTTfiles waar alle cell tracking gegevens worden opgeslagen volgens TTT software-instructies
- Start het TTT-programma, selecteer de gebruiker initialen, en klik op "Doorgaan."
- Druk op de "Set NAS," selecteer de gebruiker die aangemaakt "TTTexport" map en klik op OK. In de browser, selecteert u een experiment map, selecteert u een positie map en druk vervolgens op "Load positie" knop te drukken.
- Stel oculaire factor "10X". Laad het aantal benodigde beelden (het laden van alle afbeeldingen wordt aanbevolen voor de eerste keer).
- In cel editor venster, selecteer "Nieuw kolonie" onder het menu Bestand. In het venster Film, drukt u op de "Track cel" of F2 om te beginnen met het bijhouden van een cel.
- Identificeren van een cel in de Movie venster en gebruik de muis om de cursor te plaatsen op de cel. Een cirkel met het nummer van de cel dient na F2 is geklikt. Gebruik de "0" toets op het numerieke toetsenblok van het toetsenbord om de plaatsing van de cel en van tevoren te volgen naar de volgende afbeelding. De cursor naar de plaats van elke cel volgen door elk frame. Om een track te wissen en terug te keren naar het vorige beeld drukt u op "Del" op het numerieke toetsenblok. Om vooruit te gaan zonder frames bijhouden van de cel pers "3", en om terug te gaan zonder het bijhouden van druk op "1" op het numerieke toetsenblok.
- Ter gelegenheid van een celdeling de "Division" knop te klikken in het venster Film. Om celdood markeren klikt u op de "Cell death" knop in het venster Film. Zodra een afdeling heeft plaatsgevonden, kan de dochtercellen worden bijgehouden in dezelfde cel lot kaart door met de rechtermuisknop te klikken op de cirkel het symbool van de aangewezen dochter cel in de Cell editor venster om te beginnen het volgen automatisch.
- Druk op F10 om de boom te redden. Elke boom zal opslaan in de daarvoor bestemde uitgang vouwer (TTTExport). Om een nieuw lot van de cel kaart starten, selecteert u "Nieuwe kolonie" onder het "Bestand" en vervolgens "Open" menu in de Cell editor venster.
- Maak een tabel cel levensduur van gegevens na het verzamelen van "Cell gegevens" tab in het Cell editor venster.
7. Statistische analyses
- Gebruik een Student's t-test (indien vergelijken van twee genotypes) of ANOVA (indien vergeleken> twee genotypen) om te bepalen of verschillen in parametrische data zoals het aantal initiële cel kolonies cel levens of uren tot het verschijnen van EMT verschillende genotypen zijn statistisch significant. Apoptotische frequentie kan worden vergeleken als het nummer / aantal cellen geplateerd met Student's t-test of ANOVA of Mann-Whitney of Kruskal-Wallis bij afgeleid als een percentage hechtende cellen.
- Vermogensmeting proeven met gegevens van analyses van initiële experimenten te bepalen hoeveel experimentele duplo uitgevoerd en moeten lot van de cel kaarten gegenereerd voor elke herhaling adequate statistical stroom met behulp van beschikbare freeware (bijv. http://statpages.org/ ). In de hier gepresenteerde experimenten, celculturen afgeleid van drie muizen per genotype voldoende waren om te bepalen of er statistisch significante verschillen in cel kolonievorming en cel levensduur bij specifieke genetische wijzigingen werden aangebracht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Epitheliale en fibroblast cellen kunnen worden onderscheiden door celmorfologie. Epitheelcellen een kubische vorm (Figuur 1A-B) en vorm celkolonies (Figuur 1A). Fibroblasten, een type stromale cellen, een langwerpige morfologie (figuur 1C).
Cellen werden afgerond en drijven bij het begin van imaging (figuur 2A-D). Na bevestiging aan de plaat werden ze plat en toonde een kubische-type weergave (figuur 2E, H). Door 4 dagen kweek de meeste epitheelcellen in een langwerpig EMT-achtige morfologie (figuur 2I-L). Deze verandering is opgetreden met dezelfde chronologie in alle onderzochte genotypen. Sommige digitale beelden waren wazig omdat Kohler verlichting en fase-ring-uitlijning niet goed is ingesteld (figuur 2D, H, L).
De drijvende cellen zich ontwikkeld tot gedefinieerd afzonderlijke epitheelcellen Colonies van 24 uur na het uitplaten (Figuur 3A, B). Serial beeld analyse toonde aan dat deze kolonies werden gegenereerd door cel aggregatie plaats van de celdeling. Terwijl verstoring van BRCA1 zelf niet verandert het aantal gevormde kolonies, toevoeging van TP53 haploinsufficiëntie significante vermindering van het aantal gevormde kolonies en toevoeging van ERa overexpressie significant het aantal kolonies gevormd (figuur 3C).
Het is cruciaal om de verkregen digitale beelden te en vaak scherp kaart tijdens de eerste 24 uur als cellen hechten aan de plaat en minstens tweemaal per dag te zorgen voor de cellen blijven in focus en culturen niet worden verontreinigd. Nauwkeurigheid van analyses wordt aangetast indien belichte cellen niet in focus (figuur 4).
In de representatieve experiment hier gepresenteerde een kritische vraag was te bepalen of veranderingen in expressieniveaus van genen waarvan bekend is dat borstkanker risico (BRCA1, TP53, en oestrogeen receptor 1 (ESR1) 1) invloed hebben veranderd het aantal uren tussen celdelingen (cel levensduur) of de patronen van de divisie (symmetrische versus asymmetrische) beïnvloed in niet-kanker primaire borstklier epitheliale cellen. Om dit te bereiken, werden de individuele lot van de cel kaarten (bomen) gegenereerd met behulp van TTT. Representatieve lot van de cel kaarten voor elk van de vier geteste genotypes worden geïllustreerd (Figuur 5A-D). De vier geteste genotypes van cellen wild-type (zonder genetische manipulatie) (figuur 5A), verlies van volledige lengte BRCA1 (BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre) (figuur 5B), verlies van volledige lengte BRCA1 in combinatie met TP53 haploinsufficiëntie (BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -) (Figuur 5C), en verlies van volledige lengte BRCA1 in combinatie met TP53 haploinsufficirantie en winst van ESR1 (BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER) (Figuur 5D). Generatie mobiele lot maps werd gestopt wanneer cellen werden confluent (~ 3-4 generaties) sinds ondubbelzinnige opsporing van enkelvoudige cellen niet meer mogelijk daarna. Generatie 0 (tijd tot de eerste celdeling) werd niet opgenomen in de analyses van de cel levens, omdat de duur van de generatie 0 was langer en meer variabel dan de volgende generaties. Generaties 1, 2, 3 en 4 werden gegroepeerd voor de analyses omdat er geen significante verschillen in gemiddelde cel levens of standaardfout van het gemiddelde (SEM) tussen deze generaties. Vergelijkingen van gemiddelde cel levens tussen de verschillende genotypen (Figuur 5E) bleek dat verlies van volledige lengte BRCA1 verminderde het aantal uren tussen celdelingen van 21,3 ± 1,6 hr (wild-type) tot 16,5 ± 1,0 uur (BRCA1 f11/f11 / MMTV-Cre). Geentably, hoewel verlies van een allel TP53 naast verlies van volledige lengte BRCA1 is geassocieerd met een significante verhoging van borstkanker ontwikkeling1, gemiddelde cel levensduur onveranderd was (16,3 ± 1,2 uur) vergeleken met muizen die alleen BRCA1. Interessant van ESR1 te krijgen in BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER muizen hersteld cel levensduur lengtes tot bijna wild-type niveaus (19,3 ± 2,1 uur), zij het deze muizen hebben de hoogste incidentie van borstkanker ontwikkeling van alle modellen bestudeerd here.1 Deze bevindingen gaven aan dat verlies van volledige lengte BRCA1 niet altijd geassocieerd met een verkorte levensduur cel, maar deze is gemodificeerd door over-expressie ERa. Mogelijke volgende stap experimenten gebruik te maken van deze technologie kan de dosis-respons experimenten met behulp van verschillende oestrogenen, andere groeifactoren, of kandidaat therapeutica om hun impact op cel levensduur te meten in de verschillende genetische backgrounds. In tegenstelling tot het effect op cel levensduur duur geen van de onderzochte genetische veranderingen veranderd celdeling patronen.
Figuur 1. Verschijning van een epitheelcel kolonie (A), epitheelcel (B) en fibroblast (C) van time-lapse imaging. Epitheelcellen lijken kubische terwijl fibroblasten lijken langwerpige. Grootte bars = 50 pm.
Figuur 2. Representatieve serial time-lapse beelden van tijdstip 0, 2 en 4 dagen worden wijzigingen in celmorfologie tijd en verschillen in uiterlijk met en zonder Kohler verlichting. Op tijdstip 0 het geplateerde cellen zweven (pijlpunten AD), door twee dagen in cultuur zijn ze aanhanger en kan een kubische-type morfologie (dikke pijlen E, H) vertonen en door vier dagen in cultuur ze langwerpig en demonstreren van een EMT-achtige morfologie (dunne pijlen IL). Kohler verlichting aanwezig in panels AC, EG en IK. Panelen D, H en L illustreren beelden zonder Kohler verlichting. Getoonde afbeeldingen zijn van hetzelfde beeldpunt tijd. Grootte bars = 200 micrometer. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Aantal epitheelcellen kolonies op 1 dag gevarieerd door genotype. (A) Afgerond drijvende cellen begin time-lapse imaging. (B) Twee representatieve epitheelcellen kolonies (pijlen). (C) Nummers van epitheell celkolonies / frame gevormd 24 uur afgewisseld door genotype. Bar grafieken illustreren het gemiddelde en de standaardafwijking van het gemiddelde. * P <0,05, ANOVA. Size bars = 200 um. Cellen geïsoleerd uit melkklieren zonder palpabele tumor van 10 - tot 12-maanden oude BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre (n = 4), BRCA1 f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / - (n = 3), BRCA1 f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA (n = 3) en wild-type (n = 3) muizen werden afgebeeld voor de studies. Vijf onafhankelijke experimenten beeldvorming uit verschillende combinaties van wild-type en genetisch gemanipuleerde muizen werden uitgevoerd. Media die fenol rood. Geen oestrogeen werd toegevoegd. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Out-of-focus beelden kunnen niet nauwkeurigly geanalyseerd. Voordat beeldvorming van de plaat, de plaat moet in de beeldvorming incubator zitten gedurende 15 minuten in evenwicht. Tijdens de eerste dag van de beeldvorming, moet de focus worden gecontroleerd en afgesteld om de paar uur. Daarna moet tweemaal daags worden gecontroleerd maar over het algemeen stabieler blijft. Pijl geeft een out-of-focus epitheelcellen kolonie.
. Figuur 5 Cell lot maps gegenereerd uit eencellige volgen met behulp TTT voor (A) wild-type, (B) BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre, (C) BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -, en (D) BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / -/MMTV-rtTA/tet-op-ER muizen. Cellen die niet kunnen worden gevolgd door verlies van frame of een confluente cellaag worden met een vraagteken. Als er geen vraagtekenaangegeven, tracking werd bewust beëindigd als gevolg van cel samenloop en het onvermogen om ondubbelzinnig te volgen eencellige lot. (E) gemiddelde cel levens afgewisseld door genotype. Bar grafieken illustreren het gemiddelde en de standaardafwijking van het gemiddelde cel levensduur (tijd tussen celdelingen) over generaties 1-4 voor elk genotype. Gemiddelde cel levensduur aanzienlijk korter mammaire epitheelcellen afkomstig van BRCA1 en f11/f11/MMTV-Cre BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - in vergelijking met wild-type muizen. * P <0,05, ANOVA. Cellen geïsoleerd uit melkklieren zonder palpabele tumor van 10 - tot 12-maanden oude BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre (n = 4), BRCA1 f11/f11 / MMTV-Cre / p53 + / - (n = 3), BRCA1 f11/f11/p53 + / -/MMTV-Cre/Tet-op/-ER/MMTV-rtTA (n = 3) en wild-type (n = 3) muizen werden afgebeeld voor de studies. Vijf onafhankelijke experimenten beeldvorming uit verschillende combinaties van wild-type en genetisch engineered muizen werden uitgevoerd. Media die fenol rood. Geen oestrogeen werd toegevoegd. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen
Het is belangrijk dat melkklieren worden geoogst uit muizen van dezelfde leeftijd te controleren voor leeftijdsgerelateerde variabiliteit in mammaire epitheelcellen gedrag. Bij uitplaten van de cellen, moet hetzelfde aantal cellen worden uitgeplaat in elk putje voor elk experiment. Cellen moeten relatief dun als plateren zodat culturen worden niet confluent te snel waardoor het mogelijk meerdere individuele cellen volgen door seriële beelden. Het is essentieel dat de plaat in de incubator geëquilibreerd voordat imaging omdat de focus verandert nadat de plaat geëquilibreerd. Zodra beeldvorming is begonnen, moet de focus regelmatig worden gecontroleerd en aangepast zoveel als nodig, met name binnen de eerste 24 uur. Het is belangrijk om de temperatuur van de incubator gereguleerde en voorverwarmd. Het aantal mensen in en uit de kamer te gaan zoveel mogelijk worden beperkt. Wij raden het beoefenen van alle aspecten van Setting het experiment op voorhand dat de reproduceerbaarheid en de kwaliteitscontrole te garanderen. Zoals bij alle celkweek experimenten, steriliteit is een belangrijke kwestie en standaard steriele celkweek praktijken moeten worden gebruikt op alle tijden.
Opslaan en manipuleren van de grote beeldbestanden vereist een aanzienlijke hoeveelheid geheugen ruimte. Een gedeelde netwerkschijf of draagbare harde schijven kunnen worden gebruikt. Zodra bestanden worden geconverteerd dat het belangrijk is om ervoor te zorgen dat de beelden correct consequent genoemd en geplaatst in bijbehorende mappen. Frequent opgeslagen digitale gegevens moet worden uitgevoerd gedurende het gehele proces.
Beperkingen
Deze methode maakt gebruik van een 2-D kweeksysteem dat niet mogelijk voor analyse van verschillen in gedrag die kunnen duidelijk worden in een 3-D kweeksysteem. Lengtes van cellen levens slechts reproduceerbaar worden gemeten na de eerste celdeling waargenomen als het aantal uren eerste celdeling na initial plating van de cellen is variabel.
Eventuele wijzigingen
Afhankelijk van de eisen van het experiment, kan time-lapse beelden min of meer frequent worden genomen. Als bijvoorbeeld transient cellulaire structuren te kwantificeren, kan een 5 sec interval beter. Andere procedures primaire mammaire epitheliale celkweken genereren, kunnen worden gebruikt. Elke beeldvormende apparatuur kan worden gebruikt om de time-lapse imaging maken, zolang het aan de eisen van het experiment voldoen. Alternatieve systemen voor single-cell tracking worden gebruikt. Voor de hier beschreven procedure een standaard plastic vlakke bodem 6-well plaat was voldoende. Kunststof schalen kan gebruikt worden voor alle lange werkafstand lucht lenzen zoals 4x, 10x en 20x. Het is belangrijk om gebieden in het midden van de plastic schalen kiezen bij het uitvoeren van fase contrast beeldvorming omdat de kunststof gebogen langs de randen in de meeste gerechten en verstoort het licht.Coverslip dikte glas vormige putjes nodig zou zijn voor een normale werkafstand immersie objectieven (olie, water, glycerol, enz.), die typisch bij een grotere vergroting.
Problemen oplossen
Wanneer cellen geplateerd, dient media voldoende zijn om celgroei te handhaven gedurende 5 dagen om de noodzaak voor het manipuleren van de plaat op het podium te verlagen, maar eventueel media worden toegevoegd. Het wordt aanbevolen verdamping wordt geminimaliseerd. Het uitdampen moet worden beheerd door het plaatsen van drie tot vier gerechten van steriel gedeïoniseerd water in de couveuse en het opnieuw vullen ze als dat nodig is. Het is mogelijk om de ongebruikte vullen putjes van de plaat met 6 putjes met steriel gedeïoniseerd water.
Als de afbeeldingen niet geladen in de TTT-programma, controleer dan eerst en zorg ervoor dat de bestanden en mappen zijn geordend en correct benoemd. Controleer vervolgens of het logbestand is in de juiste map (zie stap 5.5).
Future toepassing of richting na mastering techniek
De algemene werkwijze kan worden gebruikt om het gedrag van andere celtypen waaronder humane primaire mammaire epitheelcellen en borstkankercellen analyseren. Bijvoorbeeld kan genotypische-specifiek gedrag en / of reactie kandidaat behandelingen worden geanalyseerd. Alternatief beeldvorming van fluorescentie-geactiveerde cel (FAC) gesorteerd celpopulaties kunnen worden uitgevoerd of fluorescerende labels aan specifieke celtypen te controleren.
Betekenis van deze techniek met betrekking tot bestaande methoden
Toevoeging van time-lapse imaging en analyses van cel gedrag in de tijd voor de traditionele celcultuur en etikettering technieken levert kwantitatieve gegevens uit enkele cellen na verloop van tijd in plaats van alleen hele populatie dynamica. Deze techniek laat enkele cellen continu worden waargenomen, in tegenstelling tot traditionele methoden die observatie mogelijk alleen op discrete tijdstippen. Moreover traditionele methoden vereisen de cellen verstoord worden door ze in en uit de incubator te bekijken onder een microscoop dat de benaderingswijze kan de hier beschreven cellen worden opgemerkt zonder overgedragen. Tot slot, time-lapse imaging biedt een blijvende record van de cellen onder observatie dat kan worden geretourneerd voor verdere analyse. Het gebruik van TTT individuele cel zoekgedrag maakt een eenduidige analyse van meerdere parameters en vereist niet het gebruik van een fluorescent label te lokaliseren de specifieke cellen onder observatie. De techniek onthult verschillen in mammaire epitheelcellen gedrag die moeilijk in statische weefselcoupes van borstklier. Cel levensduur metingen te kwantificeren van het aantal uren tussen mitotische gebeurtenissen. Deze meting geeft specifieke gegevens op het werkelijke aantal uren tussen celdelingen dat de lengte van de celcyclus in uren. Een onderzoeker kan deze gegevens gebruiken om te bepalen hoespecifieke genetische wijzigingen of kweekomstandigheden invloed lengte van een celcyclus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs willen Bofan Wu en christelijke Raithel bedanken voor technische bijstand en Michael Rieger voor zijn kennismaking met live-cell imaging. Ondersteund door NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Ministerie van Defensie W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) programma via de National Research Foundation van Korea gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Knaagdieren Barrier Facility Equipment) en NIH NCI 5P30CA051008 (Microscopie en Imaging en Animal Gedeelde bronnen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B Proliferation Supplements Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant human Epidermal Growth Factor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase/Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Disposable Scapels | Feather | 2975#10 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | StemCell Technologies | 37150 | |
| Ammonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 μm cell strainer | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| PenStrep | Gibco | 15140 |
References
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al. Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers. Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).
- Li, M., Wagner, K., Furth, P. A. Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. Ip, M., Asch, B. , Kluwer Academic, Plenum Press. (2000).
- Schroeder, T.
- Schroeder, T. Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells. Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).
- Eilken, H. M., Nishikawa, S. -I., Schroeder, T. Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium. Nature. 457, 896-900 (2009).
- Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level. Current opinion in hematology. , (2012).
- Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice. Science. 325, 217-218 (2009).
- Rieger, M. A., Schroeder, T. Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines. Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).
