Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Snelle Colorimetrische Testen om kwalitatief onderscheid RNA en DNA in Biomoleculaire Monsters

doi: 10.3791/50225 Published: February 4, 2013

Summary

Een reeks colorimetrische testen beschreven voor het snel onderscheiden eiwitten, RNA, DNA, en opnieuw in ducing suikers mogelijk heterogene biomoleculaire monsters.

Abstract

Biochemische experimenten vereist doorgaans nauwkeurige kennis in een vroeg stadium van het nucleïnezuur, eiwit en andere biomoleculaire componenten mogelijk heterogene monsters. Nucleïnezuren kan worden gedetecteerd via verscheidene erkende benaderingen, waaronder analysemethoden die spectrofotometrische (bijvoorbeeld A 260), fluorometrische (bijvoorbeeld binding van fluorescerende kleurstoffen) of colorimetrische (nucleoside-specifieke chromogene chemische reacties). Een Hoewel het niet gemakkelijk onderscheiden RNA uit DNA, de A 260 / A 280 verhouding wordt meestal gebruikt, omdat het een eenvoudige en snelle 2 evaluatie van de relatieve gehalte aan nucleïnezuur dat voornamelijk absorbeert nabij 260 nm en eiwitten, die absorbeert vooral nabij 280 nm. Ratio <0,8 worden als indicatie 'pure' eiwit specimens, terwijl zuivere nucleïnezuur (NA) wordt gekenmerkt door verhoudingen> 1,5 3.

However zijn er nog gevallen waarin het eiwit / NA inhoud kan niet zo duidelijk of betrouwbaar afgeleid van eenvoudige UV-VIS spectrofotometrische metingen. Bijvoorbeeld (i) monsters kunnen een of meer eiwitten die relatief vrij van de aromatische aminozuren die verantwoordelijk zijn voor absorptie bij ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe), zoals het geval is met enkele kleine RNA-bindende eiwitten en (ii) monsters vertonen tussenproduct A 260 / A 280 verhoudingen (~ 0.8 <~ 1.5), waarbij het ​​eiwit / NA inhoud veel minder duidelijk en zelfs tijdens een hoge affiniteit associatie tussen het eiwit en NA componenten. Voor dergelijke situaties beschrijven we hierin een reeks colorimetrische testen snel onderscheiden RNA, DNA en reducerende suikers in een potentieel mengmonster van biomoleculen. De methoden steunen op het verschil in gevoeligheid van pentosen en andere koolhydraten Benedictus, Bial's (orcinol), en Dische's (difenylamine) reagentia, de gestroomlijnde protocollen kan comafgerond in enkele minuten, zonder extra stappen van het moeten de componenten isoleren. De assays kunnen worden uitgevoerd in parallel te maken tussen RNA en DNA, en de aanwezigheid van vrije reducerende suikers zoals glucose, fructose, en ribose (figuur 1).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Veel van celbiologie gebeurt via moleculaire interacties van DNA en RNA. 4 Deze natuurlijk voorkomende nucleïnezuren (NA) met elkaar, 5 eiwitten, 6 en met een groot aantal kleine molecule verbindingen en liganden in vivo (bijvoorbeeld tweewaardige kationen 7). De interacties kan van korte of lange duur (kinetisch), kan variëren van hoog tot matig tot lage affiniteit (thermodynamische sterkte), en kan aanzienlijke variatie vertonen ook in chemische eigenschappen en specificiteit - sommige verenigingen zijn vrij specifiek (bv DNA · · · transcriptiefactoren, RNA · · · splicing factoren), terwijl andere interacties zijn noodzakelijkerwijs veel meer generiek (bv DNA · · · bacteriële histon-achtige HU eiwitten 8). Niet-specifieke interacties met NAS kan praktische gevolgen hebben voor in-vitro-experimenten met mengsels van biomolecules, aangezien het mogelijk en zelfs waarschijnlijk dat sommige NAs zal associëren met biomoleculen plaats, althans onder een deel van de experimentele omstandigheden gebruikt (ionsterkte, pH, enz.).

Beschouw bijvoorbeeld de productie van een eiwit van interesse (POI) via heterologe over-expressie van het recombinant eiwit in Escherichia coli celcultuur; dergelijke procedure wordt routinematig uitgevoerd in vrijwel elke structurele biologie lab 9 In voorbereiding op verdere experimenten dergelijke. als biochemische / biofysische karakterisering, kristallisatie, enz. eerste pogingen algemeen gericht op het verkrijgen van een voldoende hoeveelheid van de POI in zo zuiver mogelijke vorm, idealiter als een chemisch homogene en biofysisch monodisperse specimen. Na onderbreking van de gastheercellen, de vroege stadia van een typische zuivering workflow doel de POI isoleren van E. coli eiwitten, nucleïnezuren, celwand puinen andere onderdelen van het cellulaire lysaat. Echter, gastheer NA kan samenwerken zuiveren met de POI voor verschillende fysisch-chemische redenen - een zeer basic POI kan niet-specifiek pull-down gastheer DNA / RNA, de POI kan een generieke NA-bindende activiteit (bijvoorbeeld de eerder genoemde HU); de POI kan een vrij specifieke NA-bindingseiwit maar vertonen kruisreactiviteit met gastheer RNA of DNA zijn; ontvangende NA kan interageren met een chromatografiematrix en daardoor eenvoudig co-elueren met de POI, enzovoort. Willekeurige, hoge affiniteit binden van gastheer NA naar een POI kan vormen een vervelend probleem, omdat de NA onzuiverheden zal waarschijnlijk interfereren met downstream-experimenten (bijv. fluorescentie anisotropie testen van POI • RNA binding 10). U kunt ook onverwachte POI · · · NA verenigingen kunnen ook toevallig worden bekeken, als dergelijke interacties verlichten de POI's nucleïnezuur-bindend vermogen. Hoe dan ook, of NA zijn belangrijke componenten of verontreinigingen, moet men eerst kwantificeren enidentificeren type (DNA, RNA) van co-zuivering NAs in voorbereiding downstream experimenten.

Aantal analysemethoden aanwezig voor het detecteren en kwantificeren NAs in een monster. De meeste beschikbare methoden fundamenteel of spectrofotometrische (bijvoorbeeld A 260 absorptiewaarden en A 260 / A 280 verhoudingen), fluorometrische (bijvoorbeeld binding van thiazool oranje of andere fluorescerende kleurstoffen NA) of colorimetrische (gevoeligheid van nucleosiden om chemische reacties dit rendement chromoforen absorberen in het UV-VIS gebied van het elektromagnetische spectrum), zoals onlangs beschreven door De Mey et al. 1. echter de cruciale stap van het identificeren van het type polynucleotide RNA of DNA valt buiten het bestek van veel van deze kwantificering benaderingen. Hier geven we een reeks colorimetrische testen snel de soorten NA componenten identificeren in een eiwit monster.

De protocollen die hier beschreven ceen efficiënt worden uitgevoerd zonder extra stappen van het isoleren mogelijke NA onzuiverheden en afhankelijk assay Benedict voor reducerende suikers 11 de orcinol assay voor pentoses 12,13, 14,15 en difenylamine reacties van 2'-deoxypentoses (figuren 1 en 2) . De Benedict's test (figuur 2a) gebruikt het vermogen van de lineaire, open keten (aldehyde) vorm van een aldose suiker Cu 2 verlagen +, met gelijktijdige oxidatie van carbonyl de suiker om een carboxylaat groep en productie van Cu 2 O als onoplosbare rood neerslag. Deze reactie positief testen vrije reducerende suikers zoals aldoses en ketoses (die converteren naar de overeenkomstige aldosen via enediol tussenproducten), maar niet met pentose suikers die zijn opgesloten in cyclische vorm als deel van het covalente ruggengraat van een DNA of RNA polynucleotide. Door de minimalistische vereiste van een vrije hemiacetal functionaliteit andere compounds die kunnen positief testen bij deze assay - en dus als potentieel interfererende - onder α-hydroxy-ketonen en korte oligosaccharides (bijvoorbeeld de disaccharide maltose). Zowel de Bial de orcinol (Figuur 2b) en Dische de difenylamine (figuur 2c) reacties zijn gebaseerd op initiële vernietiging van de polynucleotide backbone, via depurinering van de nucleoside en verder zuur of base gekatalyseerde hydrolyse van de ouder nucleotiden aan furan-2 oplevert -carbaldehyde (furfural) derivaten, die derivaten vervolgens reageren met ofwel een polyhydroxy fenol zoals orcinol (Bial's) of difenylamine (Dische's) reagentia gekleurde condensatieproducten van veelal onbekende chemische structuur. De DNA versus RNA specificiteit van de assay Dische komt voort uit het feit dat de pentose suiker moet 2'-zuurstofarme om gevoelig voor oxidatie zijn om ω-hydroxylevulinyl aldehyde, die verder reageert met difenylamineonder zure omstandigheden om een heldere blauwe condensaat (2c figuur) op te leveren. Met de gestroomlijnde protocollen beschreven, hebben we gevonden dat deze suiker-specifieke colorimetrische reacties kunnen maken tussen RNA en DNA, en ook de aanwezigheid van vrije reducerende suikers zoals glucose, fructose, ribose of in een biomoleculaire monster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Benedictus Test voor reducerende suikers

  1. Bereid een hoeveelheid reagens Benedict's - 940 mM watervrij natriumcarbonaat, 588 mM natriumcitraat dihydraat, 68 mM koper (II) sulfaat pentahydraat. Dit reagens kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur (RT) gedurende ten minste zes maanden geen merkbare reactiviteit.
  2. De bovenstaande reagens is 6x. Zo 600 pi reacties, 100 pi reagens Benedict om een schone 1,5 ml microcentrifugebuis (bijvoorbeeld Eppendorf merk) per monster worden getest.
  3. Voeg tussen de 10 pl tot 500 pl monster deze buis de optimale volume kan worden bepaald gebaseerd op de intensiteit van kleurvorming in een eerste proef run. Indien voldoende monster beschikbaar is, begint deze proeven op de maximaal mogelijke monstervolume (dwz vijfzesde van het totale reactievolume 500 pl monster in dit geval) en verdun vervolgens in volgende assays.
  4. Voeg ddH 2 O aan de tuzijn voor de definitieve volume tot 600 pi, de oplossing te mengen door vortexen of pipetteren.
  5. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten in een kokend waterbad.
  6. Verwijder de verwarmde monster uit het bad en laat hem bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten afkoelen.
  7. Centrifugeer het monster buis> 9300 xg (~ 10.000 rpm in een FA45-24-11 Eppendorf vaste hoek rotor) gedurende 5 minuten om sediment elk deeltjesvormig materiaal, deze stap is belangrijker voor kwantitatief, geen kwalitatief studies.
  8. Aliquot het supernatans van deze buis in een schone cuvet.
  9. Blanco de UV-VIS spectrofotometer met water.
  10. Meet de absorptie van deze monster bij 475 nm.

2. Orcinol assay voor microbiële pentosesuikers

  1. Bereid een geschikte hoeveelheid reagens verse Bial's - 24,2 mM orcinol monohydraat (zie figuur 2b de structuur van deze verbinding), 6 M HCl, 0,025% w / v ferrichloride-hexahydraat. Opmerking:Voor langdurige opslag kan de Bial reagens worden bereid als twee afzonderlijke voorraadoplossingen: (i) Reagent A [0,05% w / v FeCl3 • 6H 2 O in geconcentreerd HCl] en (ii) Reagent B [422 mM orcinol monohydraat bereid in 95 % ethanol]. Een reagens kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende zes maanden Reagent B kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een maand, bedekt met folie om blootstelling aan licht te beperken. Deze voorraadoplossingen worden gemengd in een 15 (A): 1 (B) v / v-verhouding voor gebruik.
  2. De bovenstaande reagens is 2x. Zo 1,0 ml reacties, voeg 500 pi reagens Bial om een ​​schone 1,5 ml microcentrifugebuisje, per monster worden getest.
  3. Voeg tussen de 10 pl tot 500 pl monster deze buis. Volgens nota 1,3 (hierboven), indien voldoende monster beschikbaar is, begint het proces reacties met de maximaal mogelijke monstervolume (dwz, de helft van de totale reactievolume 500 pl monster in dit geval) en verdun vanaf daar.
  4. Voeg ddH 2 O om de buis te brengen de fspronkelijke volume tot 1,0 ml; Meng door vortexen of pipetteren.
  5. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten in een kokend waterbad.
  6. Verwijder de verwarmde monster uit het bad en laat hem bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten afkoelen.
  7. Centrifugeer het monster buis> 9300 xg (~ 10.000 rpm in een FA45-24-11 Eppendorf vaste hoek rotor) gedurende 5 minuten om sediment elk deeltjesvormig materiaal, deze stap is belangrijker voor kwantitatief, geen kwalitatief studies.
  8. Aliquot het supernatant van deze buis een schone cuvet voor visuele inspectie.
  9. Voor semi-kwantitatieve analyse, de blanco UV-VIS spectrofotometer met water en meet de absorptie van de cuvette monster bij 660 nm.

3. Dische's Difenylamine Assay voor 2'-deoxypentose Sugars

  1. Bereid een hoeveelheid Dische's difenylamine reagens - 60 mM difenylamine, 11 M ijsazijn, 179 mM zwavelzuur, 62% v / v ethanol. Dit reagens kan voorafvergeleken vooraf opgeslagen bij kamertemperatuur in een donkere container, of bedekt met folie, om blootstelling aan licht te beperken. Vanwege de lichtgevoeligheid reagens niet onbeperkt worden opgeslagen, maar in de praktijk kan worden bereid elke twee tot drie maanden geen duidelijk verschil in reactiviteit.
  2. De bovenstaande reagens is 2x. Zo 1,0 ml reacties, voeg 500 pi reagens Dische om een ​​schone 1,5 ml microcentrifugebuisje, per monster worden getest.
  3. Voeg tussen de 10 pl tot 500 pl monster deze buis. Volgens nota 1,3 (hierboven), indien voldoende monster beschikbaar is, begint het proces reacties met de maximaal mogelijke monstervolume (dwz, de helft van de totale reactievolume 500 pl monster in dit geval) en verdun vanaf daar.
  4. Voeg ddH 2 O de buis om het eindvolume tot 1,0 ml te brengen; Meng door vortexen of pipetteren.
  5. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten in een kokend waterbad.
  6. Verwijder de verwarmde monster uit het bad en allow aan afkoelen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
  7. Centrifugeer het monster buis> 9300 xg (~ 10.000 rpm in een FA45-24-11 Eppendorf vaste hoek rotor) gedurende 5 minuten om sediment elk deeltjesvormig materiaal, deze stap is belangrijker voor kwantitatief, geen kwalitatief studies.
  8. Aliquot het supernatant van deze buis een schone cuvet voor visuele inspectie.
  9. Voor semi-kwantitatieve analyse, de blanco UV-VIS spectrofotometer met water en meet de absorptie van de cuvette monster bij 600 nm.

4. Verdere Gebruik Notes

  1. De volgende klassen van moleculen zijn geschikt referentieverbindingen voor positieve en negatieve controle reacties voor elke assay:
    • Benedict's - Positieve = gratis ribose, fructose, glucose, Negatieve = RNA, DNA, ATP, etc. (Elke saccharide ontbreekt een gratis reducerende suiker functionaliteit)
    • Bial's - Positieve = RNA (bijvoorbeeld bakkersgist extract), ribose, ATP, UMP; Negatieve = runderen serum albumine (BSA) of andere eiwitten
    • Dische's - Positieve = DNA (bv. kalf thymus); Negatieve = RNA, ATP, etc. (Niet-2'-nucleotide deoxygenated)
  2. Deze testen zijn gevonden redelijk veerkrachtig verbindingen vaak gebruikt bij eiwitzuivering, bijvoorbeeld, vaak zouten zoals NaCl, (NH4) 2 SO4 en K 2 SO 4 niet verstoren, en de reacties treden gewoonlijk ongevoelig de inhoud van het verdunningsmiddel. Detergenten of chaotropische middelen, zoals ureum kunnen de reactiviteit van de assays als de pH zeer basisch, neutraal tot zure pH is in het algemeen optimaal voor Bial en Dische de assays door de onderliggende reactiechemie (zie de tekst en de protonen in figuur 2b, c). Potentieel suboptimale reactie-omstandigheden, verdachte interfererende, enz. moeten worden getest op een case-by-case basis, met behulp van positieve en negatieve controle-experimenten wet referentieverbindingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Resultaten worden getoond in figuur 3 voor toepassing van deze colorimetrische testen bekende referentieverbindingen. Representatieve kwalitatieve gegevens weergegeven voor de Benedict's (a), orcinol (b) Bial, en Dische de difenylamine (c) assays en standaard curves voor deze drie assays worden getoond in Figuur 4. In panelen 3 (ac), de linker panelen tonen positieve / negatieve controle experimenten met geschikte reactieve / reactief analyten; deze visuele resultaten worden getoond in situ, in de cuvettes zoals beschreven in Protocols 1-3 (hierboven). De juiste sub-panelen tonen een titratie serie voor elke betrokken analyt. In assay de Benedict's (a), de positieve controle is ribose (0,42 mg / ml), terwijl negatieve controles water, een generieke eiwit (0,75 mg / ml BSA), en twee niet-reducerende suikers (DNA bij 0,75 mg / ml en RNA op 12.5 mg / ml). In de orcinol assay (b), de positieve controles ribose (0,15 mg / ml), RNA (7,5 mg / ml) en DNA (0,45 mg / ml), terwijl water en BSEen eiwit (0,45 mg / ml) zijn negatieve controles. In het difenylamine assay (c), wordt kalfsthymus DNA (0,45 mg / ml) weergegeven als een positieve controle en water, gistextract RNA (7,5 mg / ml), ribose (0,15 mg / ml) en BSA (0,45 mg / ml) als negatieve controles. Tenslotte panel (d) illustreert de robuustheid van de assays door met de Dische reactie met monsters van verschillende heterogeneity: twee concentraties van DNA worden als een positieve controle in de linker twee monsters (cuvettes 1-2), DNA + RNA mengsels ( in verschillende verhoudingen) worden in de volgende drie monsters (3-5), en de laatste drie monsters vertonen DNA in de afwezigheid (monster 6) of aanwezigheid (monsters 7-8) van het nucleïnezuur-eiwit "Hfq. 16 Merk op dat het positieve resultaat van de assay Dische wordt bewaard voor DNA-bevattende monsters zelfs in de aanwezigheid van verontreinigende 'RNA of eiwit.

Kwantitatieve Analyse: De verdunning varieert in de figuur 3 (ac) panelen variëren omdat elkereactie een duidelijke visuele detectielimiet, afhankelijk van het type suiker wordt getest. Spectrofotometrische plaats van visuele detectie kan worden gebruikt om de meetbereiken, bijvoorbeeld zoals getoond in Figuur 4 voor de (a) Benedict, (b) Bial, en (c) Dische de assays verbeteren. Hoewel de protocollen hier bedoeld als eerste kwalitatieve bepalingen, de Beer-Lambert relatie tussen absorptie en concentratie kunnen ten minste semi-kwantitatieve schatting van de suiker of nucleïnezuur-gehalte. Als voorbeeld van een standaardcurve voor de kalibratie van test het Benedict's wordt een lineaire regressie fit van absorptie (475 nm) tegen riboseconcentratie getoond in Figuur 4 (a); foutstaven geven de standaarddeviatie van n = 3 replicaten en gekwadrateerde correlatiecoëfficiënt wordt. De afwijking van de lineariteit bij zeer lage concentraties ribose (bijv. de 0,28 mM datum) weerspiegelt de beperkte sensitiviteit van deze test. Hoewel de alszegt zijn primair bedoeld voor kwalitatieve studies, zijn de volgende richtlijnen voorgesteld voor semi-kwantitatieve analyse:

  • Voor Benedictus assay (figuur 4a): De reactie uitlezing (A 475nm) bleek lineair ten minste in het bereik 0,04 → 0,5 mg / ml analyt, zoals in drievoud uitgevoerd.
  • Voor assay de Bial's (Figuur 4b): De absorptiegegevens (A 660nm) was lineair ten minste het gebied van 0 → 0,5 mg / ml analyt (bakkersgist RNA), na de test uitgevoerd in drievoud (R 2 = 0,99 lineaire regressie coefficient). Hoewel de monsters werden gedurende verduidelijking voor absorptiemetingen werd geen precipitant gevonden bij deze lage concentraties van analyt en daarom centrifugatiestap niet strikt noodzakelijk. De assay afwijkt van lineariteit bij analytconcentraties buiten dit bereik.
  • Voor assay Dische's (Figuur 4c): De A 600nm 2 = 0,99). De grafiek van absorptie versus [analyt] begon plateau op 0,90 mg / ml DNA, om de grens van de lineaire respons regio.
  • Praktische overwegingen voor kwantitatieve of semi-kwantitatieve analyse: om neergeslagen materiaal dat anders zouden interfereren met absorptiemetingen verwijderen drie tests moeten centrifugatie bij maximale snelheid (25.000 xg, of wat limiet weerstaan ​​door de microfugebuizen worden) voor redelijke tijdsperioden (bijv. 20 min), dit is vooral belangrijk bij hogere analytconcentraties. Na centrifugeren kan verduidelijkt monsters worden overgebracht naar een cuvette of microplaat (bijvoorbeeld 96-well microtiterplaten) voor comfortabel absorptiemetingen.

Figuur 1 Figuur 1. Beslisboom voor de toepassing van de bepalingen. Beginnend met een potentieel heterogeen monster van biomoleculen (bijvoorbeeld van hele cellysaten) kan de colorimetrische testen hier beschreven worden gebruikt om te bepalen of het mengsel bevat niet-reducerende suikers (Benedict's test). Zo ja, dan orcinol proef Bial onthult voorts of de populatie van niet-reducerende suikers pentose ringen (zoals DNA of RNA), versus hexoses (bijv. glucose, andere pyranosen) en eventueel nog andere aldoses bevat. Tenslotte wanneer het monster ten minste een matige fractie van DNA dan de 2'-deoxyribose ring (na aanzuren en verwarming) reageren met de Dische difenylamine reagens, waarbij een zichtbaar blauw condensatieproduct. Merk op dat dit diagram is een beslissingsboom, geen flowchart: de logica van de testresultaten blijkt serially, maar de testen kunnen worden uitgevoerd in parallel.

Figuur 2
Figuur 2. Onderliggende chemische reacties worden weergegeven voor de colorimetrische testen, met het detecteerbare product gekleurde aangegeven naast de overeenkomstige reacties. (A) Een onoplosbaar, rood neerslag van Cu 2 O het positieve resultaat van Benedict assay voor reducerende suikers. (B) Bij verhitting en verzuring zal suikers met pentose ringen ontbindt furfural, die vervolgens reageert met orcinol (Bial-reagens) in een oplosbare blauwgroene adduct verkregen. In de assay Dische, ontbreken van een hydroxyl substituent op de 2 'positie een ring-opening oxidatiereactie, het aldehyde product van welk verder reageert met difenylamine biedt [(Ph) 2 NH] een heldere blauwe product verkregen. Chemische structures blijven onbekend voor de grote, multi-ring condensatieproducten van de orcinol (b) en difenylamine (c) reacties.

Figuur 3
Figuur 3. Toepassing van de colorimetrische assays om referentiestoffen en heterogene monsters. Testresultaat weergegeven voor de Benedict's (a), Bial's (b) en Dische's (c) colorimetrische testen. In (a) → (c), de linker sub-panelen tonen positieve / negatieve controles met geschikte reactieve / reactief analyten en de rechter sub-panelen tonen een titratiereeks voor elk analyt. Ook getoond is een illustratieve paneel van Dische reacties (d) waarin de analyt varieert heterogeniteit - hetzij DNA alleen (links), DNA / RNA mengsels van verschillende verhoudingen (midden) of DNA in de aanwezigheid van een nucleïnezuur-geassocieerd eiwit ( 'Hfq). Deze panelenworden verder beschreven in het gedeelte Representatieve resultaten van de tekst.

Figuur 4
Figuur 4. Standaardcurven van proeven met referentieverbindingen. Calibration curves weergegeven voor de Benedict's (a), Bial's (b) en Dische's (c) assays, voorstellende een representatief deel van de lineaire respons gebied voor elke assay. De lineaire regressie past en bijbehorende correlatiecoëfficiënten aangegeven voor elke assay. Standard bakkersgist RNA (b) en kalfsthymus DNA (c) waren de analyten in deze titratiereeks. Klik hier om groter bedrag bekijken .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De colorimetrische testen hier gepresenteerde bieden een eenvoudige benadering snel de chemische aard van biomoleculaire mengsels, zoals worden aangetroffen bij het zuiveren van eiwitten, RNA's of complexen van gehele cellysaat in voorbereiding op verdere studies. Als structurele biologie streeft meer native-achtige samenstellingen, geleidelijk grotere uitdagingen, zoals de voorbeelden heterogeniteit, zullen worden als gevolg van de ingewikkelde en multi-component complexen. Supramoleculaire samenstellingen zijn vaak slechts marginaal stabiel, en hun succesvolle isolatie kan eisen minder strenge zuivering omstandigheden (bijvoorbeeld als gevonden voor spliceosomal snRNP complexen 17,18). Onder dergelijke omstandigheden milder authentieke en valse POI · · · NA interacties eerder bestaan ​​en daardoor interfereren in stroomafwaartse testen met een doeleiwit of nucleïnezuur. Een noodzakelijke eerste stap is het identificeren van de soorten chemische componenten in deze monsters.

ve_content "> Methoden RNA, DNA en eiwit te detecteren variëren afhankelijk van de hoeveelheid en concentratie van analyten, middelen en tijdsbeperkingen en misschien nog belangrijker, kan een voorafgaande kennis van de mogelijke chemische samenstelling van de analyten. eiwitmateriaal worden gedetecteerd door vele andere bekende methoden, waaronder die welke spectroscopische (A 280), hydrodynamische (gelelektroforese), chemische / colorimetrische 19 (bijvoorbeeld biureet test voor peptidebindingen) en met grote gevoeligheid en nauwkeurigheid, via massaspectrometrie. Ook NAs kan worden gedetecteerd door spectroscopische (A 260), fluorometrische of chemische assays (hier beschreven). Elk type werkwijze heeft karakteristieke sterktes en zwaktes. bijvoorbeeld PicoGreen, SYBR-goud en andere cyanine gebaseerde fluorescente kleurstoffen zijn erg gevoelig voor nucleïnezuur (vele ordes van grootte dan de colorimetrische assays), vertonen verschillende graden van selectiviteit (bijvoorbeeld PicoGreen voor dubbelstrengs DNA, SYBR-goud bindt meeste NA) en verder over breed dynamisch bereik voor kwantificering gebruikt. Maar deze benaderingen niet zonder beperkingen: de kleurstoffen vereisen meer geavanceerde apparatuur voor detectie (transilluminators voor gels, spectrofluorometers voor batch monsters) versus eenvoudige visuele uitlezing van colorimetrische testen, de kleurstoffen zijn behandeld als mutagene verwant aan ethidium bromide en er zijn beperkingen op de testomstandigheden (zoals een aanbevolen pH-bereik van 7-8,5 voor SYBR-Gold, een 30% reductie van PicoGreen intensiteit van het signaal bij> 200 mM NaCl). Zo colorimetrische en fluorescentie gebaseerde assays zijn complementair: nucleïnezuur kleurstoffen kan bijzonder nuttig in geval van negatieve resultaten met de snelle colorimetrische testen, of als een manier om nauwkeuriger (kwantitatief) uitbreiden op eerste resultaten van colorimetrische testen. Een fundamenteel voordeel van de colorimetrische NA protocollen naast eenvoudige bediening, dat ze uitsluitend op de intrinsieke covalent structuur van NAs plaats fold/3D structuren reactiviteiten of andere eigenschappen van het biopolymeer die kunnen variëren met sequentie.

De protocollen beschreven zijn bestand tegen de meeste problemen, vooral wanneer uitgevoerd met een eenvoudige visuele inspectie van de reactieproducten bijzondere zorg moet worden genomen om meer kwantitatieve (spectrofotometrische) analyses. Bijvoorbeeld in de assay Benedictus de rode precipitant (ppt) die zich vormt in de aanwezigheid van hoge concentraties ribose moeten voor spectrofotometrische analyse worden verwijderd, dit gemakkelijk bereikt via centrifugatie. Voor de assay Dische is, is de toevoeging van difenylamine reagens gepaard met vorming van witte ppt dat kan worden opgelost door verwarming, een groene ppt die zich vormt in de aanwezigheid van DNA kan interfereren met spectrofotometrische metingen en moeten voor de kwantitatieve analyse worden verwijderd. Bovendien wordt elke assay gebaseerd op chemische reacties die gevoeligmogelijke interfererende, zoals vermeld in de inleiding en hieronder nader. Tenslotte merken we op dat een hoge relatieve concentratie van RNA in een DNA / RNA mengsel de verwachte positieve resultaten van de analyse Dische het masker, deze valse negatief DNA voort uit het feit dat een hoge molfractie van RNA reageert ook, via furfural tussenproducten, Dische met de reagentia, maar levert een kleurloos product in plaats van de blauwe adduct gevormd door reactie met de 2'-deoxypentose suiker DNA.

Potentiële interfererende: Voorbij de duidelijk geval van suikers, vetten en eiwitten zijn twee andere biomoleculen die hypothetisch zou kunnen leiden tot problemen met deze colorimetrische assays als gevolg van kruisreactiviteit (fout-positieven) of gemaskerde reactiviteit (fout-negatieven). In beginsel kunnen verschillende soorten cellulaire lipiden denkbaar, zoals mengen glycosylglycerols en glycerolipids geconjugeerd aan suikers, glycosfingolipiden (bijvoorbeeld cerebrosides), saccharolipids (bijvoorbeeld glucosaminederivaten), lipopolysacchariden, enzovoort. In de praktijk zijn deze categorieën lipiden waarschijnlijk geen probleem vormen in samenwerking met lipofiele eiwitten, omdat ze relatief zeldzaam, versus de veel voorkomende fosfolipiden en dus onder de detectiegrenzen van onze assays. Omdat de meeste van de bovengenoemde cellulaire lipiden gebouwd op hexoses (galactose, glucose) in plaats van pentoses, mogen ze niet interfereren als vals-positieven in de Bial of Dische de assays. Gratis monosacchariden die kunnen leiden tot valse-positieven zijn fructose, galactofuranose of andere furanosen. Op een verwante nota de storende ongewenste suikers geeft reden voor recombinante eiwitten die met maltose-bindend eiwit (MBP) tags. In de affiniteitschromatografiestappen gebruikt om dergelijke fusieconstructen zuiveren wordt maltose gebruikt om het eiwit te elueren, en is het denkbaar dat residuele maltose in downstream preparaten kunnen interfereren met the Benedictus assay (het is de meest algemene / aspecifieke van de assays, de glucose-eenheden van maltose niet reageren onder de Bial of Dische's). Zo zou men voorzichtigheid te betrachten in de post-chromatografische stappen om te verzekeren dat resterende maltose niet onechte resultaten opleveren. We hebben niet getest glucosylated eiwitten of andere glycoproteïnen, maar we vermoeden dat het moeilijk zou zijn om een ​​duidelijk positief resultaat voor de aanwezigheid van suikers op dergelijke eiwitten (of glycolipide, proteoglycan of andere glycoconjugaten) te verkrijgen omdat we verwachten dat de glycan groepen zou liggen onder de detectiegrens van onze assays. In principe een oplossing die een vrije aldohexose zoals glucose, bevrijd van een glucosylated eiwit via zure hydrolyse, zou positief testen door assay de Benedict, evenzo een glycoproteïne afgeleid pentose, zoals xylose, een positief resultaat in de Bial de opbrengst assay. Echter, in de praktijk een positief resultaat voor glycoproteïnen zou vereisen extreem h IGH eiwitconcentraties, zelfs vermenigvuldigen geglycosyleerde polypeptiden, vanwege de lage suiker / eiwit molverhouding.

De assay protocollen beschreven kan worden uitgebreid en aangepast aan de grenzen van kleine steekproef hanteren - vorm van kleine volumes of lage concentraties analyten. Voor beperkte monsterhoeveelheden hebben wij gevonden dat de reacties kunnen worden verlaagd met het 100-ul bereik (met PCR buisjes en thermocycler de incubatiestappen). Voor kleine aantallen monsters bij lage concentraties (nabij de detectielimiet), een spectrofotometer met een plaat-lezer kan worden gebruikt, in dergelijke situaties de enige verwachte problemen de verwijdering van ongewenste neerslagmiddelen zijn voor absorptiemetingen. Ondanks de beperkte detectiebereik van eenvoudige visuele inspectie, een voordeel van de benadering hier de efficiëntie en snelheid, met monsters kunnen worden geanalyseerd direct na verhitting.

"> Toepassingen van de protocollen die hier de identificatie van co-reinigende verbindingen, beoordeling van RNA of DNA zuiverheid en de detectie van residuele NA of suiker verontreiniging in eiwitmonsters. Bijvoorbeeld ongewenste NA vastgesteld door ons assays kunnen worden verwijderd een eiwit prep via chemische middelen (bijvoorbeeld alkalische hydrolyse van RNA) of enzymatische digestie (bijvoorbeeld nuclease behandeling). Hoewel er alternatieve benaderingen voor dergelijke toepassingen de hier beschreven methoden zijn zeer efficiënt in termen van tijd en kosten, en kan daarom gemakkelijk worden geïntegreerd in een experimentele workflow. De vroege identificatie van co-zuiverende verbindingen als vrije reducerende suiker, RNA, DNA of eiwit kan het ontwerp van de downstream-zuiveringsstappen, versus moeizame trial and error studies te begeleiden. Een gemeenschappelijke stap na onze protocollen kan de isolatie van RNA uit DNA en eiwit, via thiocyanaat-fenol-chloroform extractie, of het herstel van DNA alone (met uitsluiting thiocyanaat). 20 Om de zuiverheid van de NA gevolg van fenol-chloroformextracties evalueren, kunnen deze colorimetrische tests worden gebruikt als een eenvoudig alternatief voor elektroforese of DNase behandeling. In deze en andere manieren kan de colorimetrische testen hier beschreven worden gecombineerd met gevestigde methoden voor eiwit en NA een snelle bepaling en robuust systeem te bereiken voor het ophelderen van de RNA, DNA en eiwit componenten in heterogene monsters biomoleculaire.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de Universiteit van Virginia en de Jeffress Memorial Trust (J-971). Wij danken L. Columbus, K. Jain, en P. Randolph voor nuttige discussies en kritische lezing van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous sodium carbonate Fisher Scientific S263
Sodium citrate dihydrate Sigma S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate VWR VW3312-2
Orcinol monohydrate Sigma-Aldrich O1875
Concentrated HCl VWR BDH3030
Ferric chloride hexahydrate Sigma F-2877
Diphenylamine Aldrich 112763
Glacial acetic acid Fisher Scientific A28
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Ethanol Koptec V1101
Ribose Sigma R-7500 prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae) Sigma R6750 prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus Sigma D1501 prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C

Reagents, Equipment & Safety

Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Mey, M., et al. Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms. Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).
  2. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
  3. Ausubel, F. M. Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. 4th, Wiley. (1999).
  4. Voet, D., Voet, J. G. Biochemistry. 4th, John Wiley & Sons. (2011).
  5. Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. The Biochemistry of the Nucleic Acids. 10th, Chapman and Hall. (1986).
  6. Rice, P. A., Correll, C. C. Protein-nucleic acid interactions: Structural biology. RSC Pub. (2008).
  7. Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis. Curr. Opin. Struct. Biol. (2012).
  8. Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids. J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).
  9. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).
  10. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
  11. Benedict, S. R. A reagent for the detection of reducing sugars. J. Biol. Chem. 277, e5 (1908).
  12. Endo, Y. A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism. J. Biochem. 67, 629-633 (1970).
  13. Almog, R., Shirey, T. L. A modified orcinol test for the specific determination of RNA. Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).
  14. Dische, Z. New color reactions for determination of sugars in polysaccharides. Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).
  15. Burton, K. A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid. Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).
  16. Vogel, J., Luisi, B. F. Hfq and its constellation of RNA. Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).
  17. Deckert, J., et al. Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions. Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).
  18. Stevens, S. W., et al. Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP. Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).
  19. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol. Appl. Biochem. 29, (Pt. 2), 99-108 (1999).
  20. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
Snelle Colorimetrische Testen om kwalitatief onderscheid RNA en DNA in Biomoleculaire Monsters
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).More

Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter