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Chemistry

Schnelle kolorimetrische Assays zur Qualitativ unterscheiden RNA und DNA in Biomolekulare Proben

doi: 10.3791/50225 Published: February 4, 2013

Summary

Eine Reihe von kolorimetrischen Assays wird zum schnellen Unterscheidungsmerkmal Protein, RNA, DNA und Reduk-tion Zuckern in potentiell heterogenen biomolekularen Proben beschrieben.

Abstract

Biochemischer Experimente in der Regel erfordert genaue Kenntnisse, in einem frühen Stadium, der Nukleinsäure, Protein und anderen biomolekularen Komponenten in potentiell heterogenen Proben. Nukleinsäuren können über mehrere etablierte Methoden, einschließlich analytischen Methoden, die spektrophotometrische sind (z. B. A 260), fluorometrische (z. B. die Bindung von Fluoreszenzfarbstoffe) oder farbmetrisch (Nukleosid-spezifischen chromogenen chemische Reaktionen). 1 Obwohl es nicht leicht unterscheiden kann erkannt werden RNA aus DNA, das A 260 / A 280-Verhältnis wird üblicherweise verwendet, da sie einen einfachen und schnellen 2 Beurteilung der relative Gehalt an Nukleinsäure, die überwiegend in der Nähe 260 nm absorbiert und Protein, das hauptsächlich in der Nähe 280 nm absorbiert bietet. Ratios <0,8 werden als Indikator für die "reinen" Protein Proben entnommen, während reine Nukleinsäure (NA) durch Verhältnisse gekennzeichnet ist> 1,5 3.

However, gibt es Situationen, in denen das Protein / NA Gehalt nicht deutlich oder können als zuverlässig abgeleitet von einfachen UV-VIS spektrophotometrische Messungen. Zum Beispiel werden (i) Proben können ein oder mehrere Proteine, die relativ frei von den aromatischen Aminosäuren, die für Absorption bei ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe) sind, wie es der Fall mit einigen kleinen RNA-bindenden Proteinen und (ii) Proben weisen Zwischenprodukt A 260 / A 280-Verhältnisse (~ 0,8 <~ 1,5), wo das Protein / NA Inhalt ist weit weniger klar und kann sogar auf eine gewisse hoher Affinität Zusammenhang zwischen dem Protein und NA-Komponenten. Für derartige Szenarien beschreiben wir hier eine Reihe von kolorimetrischen Assays rasch unterscheiden RNA, DNA und reduzierende Zucker in einer potentiell Mischprobe von Biomolekülen. Die Methoden beruhen auf der Differenz Empfindlichkeit der Pentosen und andere Kohlenhydrate Benedikt, Bial (Orcin) und Disches (Diphenylamin) Reagenzien, die gestrafft Protokolle com seinabgeschlossen innerhalb weniger Minuten, ohne irgendwelche zusätzlichen Schritte aufweist, um die Komponenten zu isolieren. Die Assays können parallel durchgeführt werden, um zwischen RNA und DNA zu unterscheiden, sowie die Anwesenheit von freien reduzierenden Zucker wie Glucose, Fructose, Ribose und (Abbildung 1).

Introduction

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Ein Großteil der Zellbiologie erfolgt über molekulare Wechselwirkungen zwischen DNA und RNA. 4 Diese natürlich vorkommenden Nukleinsäuren (NA) miteinander zusammenwirken, 5 mit Proteinen, 6 und mit einer Vielzahl von niedermolekularen Verbindungen und Liganden in vivo (zB divalente Kationen 7). Die Wechselwirkungen können kurz-oder langlebig (kinetisch), können von hohen Bereich zu geringe Affinität (thermodynamische Kraft) moderieren und können zeigen auch erhebliche Unterschiede in den chemischen Eigenschaften und Spezifität - einige Verbände sind recht spezifisch (zB DNA · · · Transkriptionsfaktoren, RNA · · · Spleißfaktoren), während andere Kommunikationen notwendigerweise weit mehr generische (zB DNA · · · bakteriellen histonähnliche HU-Proteine ​​8). Nicht-spezifische Interaktionen mit NAs können praktische Konsequenzen für in vitro Experimente mit Mischungen von biomolecules, da es möglich und sogar wahrscheinlich ist, dass einige NAs wird mit den Biomoleküle von Interesse zu verbinden, zumindest unter gewissen Teilmenge der experimentellen Bedingungen verwendet wird (Ionenstärke, pH usw.).

Betrachten wir zum Beispiel Herstellung eines Proteins von Interesse (POI) über heterologe Überexpression des rekombinanten Proteins in Escherichia coli Zellkultur; solches Verfahren wird routinemäßig in praktisch jedem strukturellen Biologielabor durchgeführt 9 In Vorbereitung für weitere Experimente, wie. Als biochemischen / biophysikalischen Charakterisierung, Kristallisation, etc., anfänglichen Bemühungen in der Regel auf die Erzielung einer ausreichenden Menge des POI konzentrieren möglichst reiner Form wie möglich, idealerweise als chemisch homogen und biophysikalisch monodisperse Probe. Nach dem Aufbrechen der Wirtszellen, zielen die frühen Phasen eines typischen Aufreinigung Workflow, um den POI aus E. isolieren coli-Proteine, Nukleinsäuren, Zellwandtrümmern,und andere Komponenten des zellulären Lysat. Jedoch Host NAs kann mit dem POI mehrere physikochemische Gründen co-läutern - ein hochbasisches POI kann unspezifisch Pulldown-Wirts-DNA / RNA, die POI kann ein generisches NA-bindende Aktivität aufweisen (zB die oben erwähnten HU); das POI kann eine ziemlich spezifische NA-Bindungsprotein sondern zeigen Kreuzreaktivität mit Host-RNAs oder DNAs sein; Host NAs kann mit einer Chromatographiematrix wechselwirken und dadurch einfach koeluieren mit dem POI, und so weiter. Willkürliche, hoch-affine Bindung von Host NAs zu einem POI können stellen eine ärgerliche Problem, weil die NA Verunreinigungen wird wahrscheinlich mit nachgeschalteten Experimente (zB Fluoreszenzanisotropie Assays POI • RNA-Bindung 10) stören. Alternativ unerwartete POI · · · NA Verbände können auch zufällig angesehen werden, wie solche Wechselwirkungen beleuchten die POI-Nukleinsäure-bindende Kapazität. So oder so, ob NAs wichtigen Komponenten oder Verunreinigungen sind, muss man zunächst quantifizieren undBestimmung der Art (DNA, RNA) von Co-Reinigungskatalysator NAs in Vorbereitung für nachfolgende Versuche.

Mehrere analytischen Methoden existieren zur Detektion und Quantifizierung von NA in einer Probe. Die meisten der verfügbaren Methoden sind grundsätzlich entweder spektrophotometrischen (z. B. A 260 Extinktionswerte und A 260 / A 280-Verhältnisse), fluorometrische (z. B. die Bindung von Thiazolorange oder andere fluoreszierende Farbstoffe auf NA) oder farbmetrisch (Suszeptibilität von Nukleosiden, um chemische Reaktionen Ausbeute daß Chromophore absorbierend im UV-VIS-Bereich des elektromagnetischen Spektrums), wie kürzlich von De Mey et al. 1 Jedoch ist der entscheidende Schritt des Identifizieren des Typs des Polynukleotid, wie RNA oder DNA über den Rahmen viele dieser Quantifizierung Ansätze. Hier bieten wir einen Satz von kolorimetrischen Assays für die schnelle Erkennung der Arten von NA-Komponenten in einem proteinhaltigen Probe.

Die hier beschriebenen Protokolle ceine effizient ohne zusätzlichen Schritte der Isolierung der potentiellen NA Verunreinigungen ausgeführt werden, und sich auf Benedikts Assay für reduzierende Zucker 11, das Orcinol-Assay für Pentosen 12,13, 14,15 und Diphenylamin Reaktionen von 2'-deoxypentoses (Abbildungen 1 und 2) . Die Benedikts Test (2a) nutzt die Fähigkeit der linearen, offenkettige (Aldehyd)-Form einer Aldose Zucker zu Cu 2 +, unter Oxidation des Zuckers Carbonylgruppe zu einer Carboxylat-Komponente und Produktion von Cu 2 O als eine Reduzierung unlöslichen roten Niederschlag. Diese Reaktion testen mit freien reduzierenden Zuckern wie Aldosen und Ketosen (die mit den entsprechenden Aldosen über Endiol Zwischenprodukte umzuwandeln) positive, aber nicht mit Pentosezucker, dass in zyklischer Form als Teil der kovalenten Rückgrat eines DNA-oder RNA-Polynukleotid gesperrt. Aufgrund des minimalistischen Erfordernis einer freien Halbacetal Funktionalität, andere Compounds, die positiv getestet werden in diesem Test konnte - und wirken somit als potenzielle Störfaktoren - gehören α-Hydroxy-Ketone und kurze Oligosaccharide (zB das Disaccharid Maltose). Sowohl die Bial Orcin (Abbildung 2b) und Disches Diphenylamin (Abbildung 2c) Reaktionen werden bei der erstmaligen Zerstörung des Polynukleotid Backbone, über Depurinierung der Nukleosid-und weitere Säure-oder Basen-katalysierten Hydrolyse der Muttergesellschaft Nukleotide, die Furan-2 ergeben -carbaldehyd (Furfural) Derivate; diese Derivate reagieren dann entweder mit einem Polyhydroxyphenol wie Orcin (Bial) oder Diphenylamin (Disches) Reagenzien, farbige Kondensationsprodukte von weitgehend unbekannten chemischen Struktur zu bilden. Die DNA im Vergleich zu RNA-Spezifität des Disches Assay beruht auf der Tatsache, daß der Pentosezucker muss 2'-desoxygenierten, um es zu Störungen durch Oxidation zu ω-hydroxylevulinyl Aldehyd, das weiter reagiert mit Diphenylaminunter sauren Bedingungen unter Bildung eines hellblauen Kondensat (Abbildung 2c). Mit den hier beschriebenen Protokolle gestrafft haben wir gefunden, dass diese zuckerfreie spezifischen kolorimetrischen Reaktionen können zwischen RNA und DNA zu unterscheiden, und wird auch auf das Vorhandensein von freien reduzierenden Zucker wie Glucose, Fructose oder Ribose in einer biomolekularen Probe.

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Protocol

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Ein. Benedikt Assay für reduzierende Zucker

  1. Bereiten Sie eine geeignete Menge von Benedict-Reagenz - 940 mM wasserfreies Natriumcarbonat, 588 mM Natriumcitrat-Dihydrat, 68 mM Kupfer (II)-Sulfat-Pentahydrat. Dieses Reagenz kann bei Raumtemperatur (RT) für mindestens sechs Monate ohne merkliche Änderung der Reaktivität gespeichert werden.
  2. Das obige Reagenz 6x. So 600 ul Reaktionen, mit 100 ul von Benedikt-Reagenz ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (zB Eppendorf-Marke), pro Probe untersucht werden.
  3. Hinzufügen zwischen 10 ul und 500 ul Probe auf diesem Rohr, das optimale Volumen kann auf der Basis der Intensität der Farbbildung in einem anfänglichen Probelauf ermittelt werden. Wenn ausreichend Probe ist dann beginnen solche Studien an der maximal mögliche Probenvolumen (dh fünf Sechstel des gesamten Reaktionsvolumen, 500 ul der Probe in diesem Fall), und dann verdünnen anschließenden Tests.
  4. Fügen ddH 2 O an der TUsein, um das Endvolumen auf 600 ul bringen; mische die Lösung durch Vortexen oder Pipettieren.
  5. Inkubiere die Proben für 20 Minuten in einem kochenden Wasserbad.
  6. Entfernen Sie die erhitzten Probe aus dem Bad und lassen Sie es bei RT für 10 min abkühlen.
  7. Zentrifugieren Probenröhre bei> 9300 xg (~ 10.000 rpm in einem FA45-24-11 Eppendorf Festwinkelrotor) für 5 min, um Partikel zu sedimentieren; dieser Schritt ist wichtig für die quantitative statt qualitative Untersuchungen.
  8. Aliquot des Überstandes von dieser Röhre in ein sauberes Küvette.
  9. Blank UV-VIS Spektralphotometer mit Wasser.
  10. Die Extinktion dieser Probe bei 475 nm.

2. Bial Orcinol Assay für Pentosezucker

  1. Bereiten Sie eine geeignete Menge an frischem Bial-Reagenz - 24,2 mM Orcin Monohydrat (siehe Abbildung 2b für die Struktur dieser Verbindung), 6 M HCl, 0,025% w / v Eisenchloridhexahydrat. Hinweis:Für eine längere Lagerung können die Bial-Reagenz als zwei separate Stammlösungen hergestellt werden: (i) Reagenz A [0,05% w / v FeCl3 • 6H 2 O in konzentrierter HCl] und (ii) Reagenz B [422 mM Orcin Monohydrat in 95 vorbereitet % Ethanol]. Reagenz A kann bei RT für sechs Monate gelagert werden; Reagenz B können bei 4 ° C einen Monat gelagert werden, mit einer Folie zu Belichtung zu begrenzen. 1 (B) v / v-Verhältnis vor Gebrauch: Diese Stammlösungen werden in einem 15 (A) gemischt.
  2. Die obige Reagenz 2x. So werden 1,0 ml Reaktionen, 500 ul Bial-Reagenz ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, pro Probe untersucht werden.
  3. Fügen Sie überall von 10 ul bis 500 ul der Probe in dieser Röhre. Da pro Note 1,3 (oben), wenn eine ausreichende Probe besteht dann beginnen Studie Reaktionen mit der maximal möglichen Probenvolumen (dh die Hälfte der gesamten Reaktionsvolumens, 500 ul Probe in diesem Fall) und von dort zu verdünnen.
  4. Hinzufügen ddH 2 O, um das Rohr um den f bringeninal Volumen auf 1,0 ml; mische die Lösung durch Vortexen oder Pipettieren.
  5. Inkubiere die Proben für 20 Minuten in einem kochenden Wasserbad.
  6. Entfernen Sie die erhitzten Probe aus dem Bad und lassen Sie es bei RT für 10 min abkühlen.
  7. Zentrifugieren Probenröhre bei> 9300 xg (~ 10.000 rpm in einem FA45-24-11 Eppendorf Festwinkelrotor) für 5 min, um Partikel zu sedimentieren; dieser Schritt ist wichtig für die quantitative statt qualitative Untersuchungen.
  8. Aliquot des Überstandes von dieser Röhre in ein sauberes Küvette für Sichtprüfung.
  9. Für semi-quantitativen Analyse, blank Das UV-VIS Spektralphotometer mit Wasser und messen die Absorption der Küvette Probe bei 660 nm.

3. Disches Diphenylamin Assay für 2'-deoxypentose Zucker

  1. Bereiten Sie eine geeignete Menge Disches Diphenylamin Reagenz - 60 mM Diphenylamin, 11 M Eisessig, 179 mM Schwefelsäure, 62% v / v Ethanol. Dieses Reagenz kann vorbestellt werdenVergleich im Voraus und bei RT in einem dunklen Behälter oder mit Folie abgedeckt, um Belichtung begrenzen. Aufgrund Lichtempfindlichkeit sollte das Reagenz nicht unbegrenzt gelagert werden, obwohl in der Praxis kann es alle zwei bis drei Monate ohne sichtbare Veränderung in der Reaktivität vorbereitet werden.
  2. Die obige Reagenz 2x. So werden 1,0 ml Reaktionen, 500 ul Disches Reagens an ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, pro Probe untersucht werden.
  3. Fügen Sie überall von 10 ul bis 500 ul der Probe in dieser Röhre. Da pro Note 1,3 (oben), wenn eine ausreichende Probe besteht dann beginnen Studie Reaktionen mit der maximal möglichen Probenvolumen (dh die Hälfte der gesamten Reaktionsvolumens, 500 ul Probe in diesem Fall) und von dort zu verdünnen.
  4. Fügen ddH 2 O an das Rohr, um das Endvolumen auf 1,0 ml zu bringen; mische die Lösung durch Vortexen oder Pipettieren.
  5. Inkubiere die Proben für 20 Minuten in einem kochenden Wasserbad.
  6. Entfernen Sie die erhitzten Probe aus dem Bad und allow es bei RT für 10 min abkühlen gelassen.
  7. Zentrifugieren Probenröhre bei> 9300 xg (~ 10.000 rpm in einem FA45-24-11 Eppendorf Festwinkelrotor) für 5 min, um Partikel zu sedimentieren; dieser Schritt ist wichtig für die quantitative statt qualitative Untersuchungen.
  8. Aliquot des Überstandes von dieser Röhre in ein sauberes Küvette für Sichtprüfung.
  9. Für semi-quantitativen Analyse, blank Das UV-VIS Spektralphotometer mit Wasser und messen die Absorption der Küvette Probe bei 600 nm.

4. Weitere Hinweise zur Verwendung

  1. Die folgenden Klassen von Molekülen eignen Referenzsubstanzen für positive und negative Kontrollreaktionen für jeden Assay:
    • Benedikt - Positive = freie Ribose, Fructose, Glucose, Negative = RNA, DNA, ATP, etc. (Alle Saccharid fehlt eine kostenlose reduzierenden Zucker-Funktionalität)
    • Bial - Positive = RNA (zB Bäcker Hefe-Extrakt), Ribose, ATP, UMP, Negative = bovine serum Albumin (BSA) oder jedes andere Protein
    • Disches - Positive = DNA (zB Kalbsthymus); Negativ = RNA, ATP, etc. (Alle nicht-2'-desoxygeniertem Nukleotid)
  2. Diese Assays haben sich als ziemlich elastisch ist, um Verbindungen häufig in der Proteinreinigung eingesetzt, so z. B. gemeinsame Salze wie NaCl, (NH 4) 2 SO 4 und K 2 SO 4 nicht stören, und die Reaktionen im Allgemeinen erscheinen unberührt der Inhalt des Verdünnungsmittels. Detergenzien oder chaotropen Agenzien wie Harnstoff kann sich auf die Reaktivität der Assays, wenn der pH-Wert hochbasischen; einem neutralen bis sauren pH-Bereich liegt in der Regel optimal für die Bial und Disches Assays aufgrund der darunterliegenden Reaktions Chemie (siehe den Text und die Protonen in Abbildung 2b, c). Potenziell suboptimal Reaktionsbedingungen, vermutete Störkomponenten, etc. sollten auf einer Fall-zu-Fall-Basis getestet werden, wobei positive und negative Kontrolle Experimenten with Referenz-Verbindungen.

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Representative Results

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Die Ergebnisse sind in Abbildung 3 für die Anwendung dieser kolorimetrische Assays bekannt Referenzsubstanzen gezeigt. Vertreter qualitative Daten für die Benedikt (a), Orcin (b) Bial und Disches Diphenylamin (c) Assays gezeigt, und Standard-Kurven für diese drei Tests sind in Abbildung 4 dargestellt. Einsatzplatten 3 (ac) zeigen die linke Felder positive / negative Kontrollexperimente unter Verwendung geeigneter reaktiver / unreaktiv Analyten; diese visuellen Ergebnisse sind in situ gezeigt, in den Küvetten nach Protocols 1-3 (oben) beschrieben. Die richtige Sub-Panels zeigen eine Titration Serie für den jeweiligen Analyten. Innerhalb der Benedikts Assay (a), ist die positive Kontrolle Ribose (0,42 mg / ml), Negativkontrollen Wasser, eine allgemeine Protein (0,75 mg / ml BSA), und zwei nicht-reduzierenden Zucker (DNA bei 0,75 sind mg / ml und RNA bei 12,5 mg / ml). In der Orcinol-Assay (b) sind die positiven Kontrollen Ribose (0,15 mg / ml), RNA (7,5 mg / ml), und DNA (0,45 mg / ml), während Wasser und BSEin Protein (0,45 mg / ml) sind negative Kontrollen. Im Diphenylamin Assay (c) wird Kalbsthymus-DNA (0,45 mg / ml) als Positivkontrolle gezeigt, und Wasser, Hefe Extrakt RNA (7,5 mg / ml), Ribose (0,15 mg / ml) und BSA (0,45 mg / ml) als Negativkontrolle zu dienen. Schließlich veranschaulicht Platte (d) die Robustheit der Assays, indem der Disches Reaktion mit Proben unterschiedlicher Heterogenität: zwei Konzentrationen von DNA werden als positive Kontrolle in den linken zwei Proben (Küvetten 1-2), DNA + RNA Mischungen gezeigt ( in verschiedenen Verhältnissen) in den nächsten drei Proben (3-5) gezeigt, und die letzten drei Proben zeigen DNA in Abwesenheit (Probe 6) oder Gegenwart (Proben 7-8) der Nukleinsäure-bindenden Proteins "Hfq '. 16 Hinweis, daß das positive Ergebnis des Assay für Disches beibehalten DNA-haltigen Proben selbst in der Anwesenheit von "kontaminierenden" RNA oder Protein.

Quantitative Analyse: Die Verdünnung Bereiche in der Abbildung 3 (ac) Platten variieren, da jederReaktionsprodukt hat eine deutliche visuelle Detektionsgrenze, abhängig von der Art des Zuckers, die untersucht. Spektrophotometrische, anstatt visuelle kann Detektion verwendet, um die Meßbereiche, z. B. wie in 4 für die (a) Benedikts gezeigt, (b) Bial, und (c) Disches Assays zu verbessern. Obwohl die hier beschriebenen Protokolle als primär qualitativen Assays bestimmt sind, ermöglicht die Lambert-Beer-Beziehung zwischen Absorption und Konzentration zumindest semi-quantitative Bestimmung des Zuckers oder Nucleinsäuregehalt. Als ein Beispiel einer Standard-Kurve für die Kalibrierung des Benedikts Test wird ein linearen Regressionsanpassung der Extinktion (475 nm) gegen Ribose-Konzentration in 4 (a) gezeigt; Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung aus n = 3 Wiederholungen, und die quadrierten vorgesehen ist. Die Abweichung von der Linearität bei sehr niedrigen Konzentrationen Ribose (zB das 0,28 mM Nullpunkt) spiegelt die begrenzte Empfindlichkeit dieses Assays. Obwohl die wiesagt in erster Linie für qualitative Studien bestimmt, werden die folgenden Richtlinien für die semi-quantitative Analyse vorgeschlagen:

  • Für die Benedikts Assay (4a): Die Reaktion Ausleseschicht (A 475nm) erwies sich zumindest über den Bereich von 0,04 lineare → 0,5 mg / ml Analyt, wie in dreifacher Ausführung durchgeführt.
  • Für die Bial Assay (4b): Die Absorption Daten (A 660 nm) waren linear zumindest über den Bereich von 0 → 0,5 mg / ml Analyt (Bäckerhefe RNA), wobei der Assay in dreifacher (R 2 = 0,99 lineare Regression durchgeführt Koeffizient). Obwohl die Proben zur Klärung, bevor Extinktionsmessungen zentrifugiert wurden, wurde kein Fällungsmittel bei diesen niedrigen Konzentrationen von Analyten gefunden und damit der Zentrifugationsschritt war nicht unbedingt erforderlich ist. Der Test weicht von Linearität bei Analytkonzentrationen außerhalb dieses Bereichs.
  • Für Disches Assay (Abbildung 4c): Die A 600nm 2 = 0,99) durchgeführt. Die Auftragung der Absorption gegen die [Analyt] begannen Plateau bei 0,90 mg / ml DNA, die die Grenze angibt des linearen Antwortbereich aufweist.
  • Praktischen Erwägungen für die quantitative oder semi-quantitative Analyse: Zur ausgefallene Material, die sonst mit Absorptionswerte stören würden entfernen, benötigen alle drei Assays Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit (25.000 × g, oder wie durch die Grenze kann Mikrozentrifugenröhrchen widerstehen) zum angemessenen Zeitlängen (zB 20 min), das ist besonders wichtig bei hohen Analytkonzentrationen. Nach Zentrifugation geklärt Proben auf eine Küvette oder Mikrotiterplatte übertragen werden (z. B. 96-Well Mikrotiterplatten) für die bequeme Extinktionsmessungen.

Abbildung 1 Abbildung 1. Entscheidungsbaum für die Anwendung der Tests. Beginnend mit einem potentiell heterogenen Probe von Biomolekülen (zB von Ganzzell-Lysaten), können die kolorimetrischen Assays hier beschriebenen verwendet werden, um festzustellen, ob die Mischung nicht-reduzierenden Zucker (Benedict-Test) werden. Wenn ja, dann Bial Orcinol Test zeigt ferner, ob die Population von nicht-reduzierenden Zuckern Pentose Ringe (wie in DNA oder RNA), im Vergleich zu Hexosen (z. B. Glucose, anderen Pyranosen) und eventuell noch anderen Aldosen enthält. Schließlich, wenn die Probe zumindest eine moderate Bruchteil DNA dann der 2'-Desoxyribose-Ring reagieren wird (beim Ansäuern und Heizung) mit Disches Diphenylamin Reagens, was zu einem sichtbaren blauen Kondensationsprodukt. Beachten Sie, dass dieses Diagramm ein Entscheidungsbaum, nicht ein Flussdiagramm ist: Die Logik der Testergebnisse wird angezeigt serially, aber die Assays können parallel ausgeführt werden.

Abbildung 2
Abbildung 2. Zugrundeliegende chemische Reaktionen für die kolorimetrische Assays gezeigt, mit der detektierbaren gefärbtes Produkt neben den entsprechenden Reaktionen gekennzeichnet. (A) Ein unlösliches, roter Niederschlag von Cu 2 O ist das positive Ergebnis der Benedikt-Assay für reduzierende Zucker. (B) Beim Erhitzen und Versauerung wird Zucker mit Pentose Ringe Furfural, das dann mit Orcin (Bial-Reagens) zu zersetzen, um eine lösliche blau-grün-Addukt erhalten. In Disches Assay Fehlen einer Hydroxyl-Substituent an der 2'-Position einer Ringöffnungs-Oxidationsreaktion, das Aldehydprodukt davon weitere reagiert mit Diphenylamin ermöglicht [(Ph) 2 NH], um eine hellblaue Produkt zu ergeben. Chemische structures unbekannt bleiben für die großen, multi-Ring Kondensationsprodukte der Orcin (b) und Diphenylamin (c) Reaktionen.

Abbildung 3
Abbildung 3. Die Anwendung der kolorimetrischen Assays zur Referenz-Verbindungen und heterogene Proben. Ergebnisse der Proben für die Benedikt (a), Bial (b) und Disches (c) kolorimetrischen Assays gezeigt. In (a) → (c) zeigen die linken Sub-Panels positive / negative Kontrollen durch entsprechend reaktiv / nicht reaktiv Analyten und das Recht sub-Tafeln zeigen eine Titration Serie für jeden Analyten. Ebenfalls gezeigt ist eine veranschaulichende Panel von Dische Reaktionen (d) worin der Analyt in Heterogenität variiert - entweder DNA alleine (links), DNA / RNA-Gemischen unterschiedlicher Verhältnisse (Mitte), oder DNA in Gegenwart einer Nukleinsäure-associated protein ( 'Hfq'). Diese Plattenwerden in dem Repräsentative Ergebnisse Abschnitt des Textes beschrieben.

Abbildung 4
Abbildung 4. Standardkurven von Assays mit Referenzsubstanzen. Eichkurven für die Benedikts (a) gezeigt, Bial (b) und Disches (c)-Assays, zeigt eine repräsentative Anteil des linearen Antwortbereich aufweist, für jeden Assay. Die lineare Regression passt und entsprechenden Korrelationskoeffizienten für jeden Assay angedeutet. Standard Bäckerhefe RNA (b) und Kalbsthymus DNA (c) waren die Analyten in dieser Titration Serie. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Discussion

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Die kolorimetrische Assays hier vorgestellten bieten eine einfache Ansatz rasch beurteilt die chemische Natur der biomolekularen Mischungen, wie sie beispielsweise auftreten, wenn Reinigung von Proteinen, RNAs oder-Komplexen aus Ganzzellen-Lysat in Vorbereitung für weitere Studien. Als Strukturbiologie verfolgt mehr native-like Baugruppen zunehmend größeren Herausforderungen wie Probe Heterogenität wird durch die komplizierte und Mehrkomponenten-Komplexen gestellt werden. Supramolekularen Aggregate sind oft nur marginal stabil, und ihre erfolgreiche Isolierung kann weniger strenge Reinigung Bedingungen erfordern (zB für spleißosomalen snRNP-Komplexe 17,18 gefunden). Unter solchen milderen Bedingungen sowohl authentisch und unecht POI · · · NA Wechselwirkungen sind wahrscheinlich fortbestehen und damit einzumischen in nachgelagerten Assays mit einem Zielprotein oder Nukleinsäure. Ein notwendiger erster Schritt ist die Identifizierung der verschiedenen Arten von chemischen Komponenten in diesen Proben.

ve_content "> Methoden, um RNA, DNA und Protein nachzuweisen variieren Menge und Konzentration des Analyten, verfügbaren Ressourcen und Zeitgründen Abhängigkeit und, was vielleicht am wichtigsten ist, kann man das Vorwissen über die wahrscheinliche chemische Zusammensetzung der Analyten. Proteinartige Material durch nachweisbar viele etablierte Methoden, einschließlich derer, die spektroskopischen sind (A 280), hydrodynamische (Gelelektrophorese), Chemie / kolorimetrischen 19 (zB Biuret-Test für Peptidbindungen) und mit großer Empfindlichkeit und Genauigkeit, mittels Massenspektrometrie. Ebenso NAs kann durch spektroskopische (A 260), fluorometrische oder chemischer Assays (hier beschrieben) erkannt werden. Jede Art von Verfahren weist charakteristischen Stärken und Schwächen. Beispielsweise sind PicoGreen, SYBR-Gold und andere Cyanin-basierten Fluoreszenzfarbstoffe recht empfindlich Nukleinsäure (viele Größenordnungen über den kolorimetrischen Assays) weisen verschiedene Grade an Selektivität (z. B. PicoGreen für doppelsträngige DNA bindet SYBR-Gold meisten NAs), und verfügen über breite dynamische Bereiche zur Quantifizierung Zwecke. Jedoch sind diese Ansätze nicht unbegrenzt: die Farbstoffe erfordern mehr moderner Ausrüstung für den Nachweis (Transilluminatoren für Gele, Spektrofluorometer für Batch Proben), gegenüber einfache visuelle Ablesung der kolorimetrische Assays, die Farbstoffe als Mutagene, verwandt mit Ethidiumbromid behandelt, und es Beschränkungen bezüglich Testbedingungen (zB eine empfohlene pH-Bereich von 7-8,5 für SYBR-Gold, eine 30% ige Reduktion der PicoGreen Signalintensität bei> 200 mM NaCl). Somit sind kolorimetrischen und Fluoreszenz-basierten Assays komplementäre: Nukleinsäure Farbstoffe könnte besonders nützlich im Falle von negativen Ergebnissen mit den schnellen kolorimetrischen Assays oder als eine Möglichkeit, genauer (quantitativ) Erweitern am ersten Ergebnisse kolorimetrischen Assays. Ein grundlegender Vorteil der kolorimetrischen NA Protokollen, zusätzlich zu Einfachheit der Verwendung ist, dass sie ausschließlich auf dem intrinsischen co angewiesenvalenten Struktur NAs anstatt fold/3D Strukturen Reaktivitäten oder andere Eigenschaften des Biopolymer, das mit Sequenz, variieren kann.

Die hier beschriebenen Protokolle sind gegen die meisten Schwierigkeiten robust, insbesondere wenn sie mit einfachen visuellen Inspektion der Reaktionsprodukte durchgeführt wird; Besondere Vorsicht muß für weitere quantitative (spektrophotometrische) Analysen genommen werden. Zum Beispiel werden in der Benedikts Assay die rote Fällungsmittel (PPT), der in Gegenwart von hohen Konzentrationen von Ribose bildet müssen vor der spektrophotometrischen Analyse entnommen werden, was ohne weiteres durch Zentrifugation erzielt. Für die Disches Assay wird der Zusatz von Diphenylamin Reagenz durch Bildung eines weißen ppt, der durch Erhitzen gelöst werden kann begleitet, eine grüne ppt dass Formen in Gegenwart von DNA kann mit spektrophotometrischen Messungen stören und müssen vor der quantitativen Analyse entnommen werden. Zusätzlich wird jedes Assay auf chemischen Reaktionen, die anfällig sind basierendpotenzielle Interferenten, wie in der Einleitung erwähnt und nachstehend näher erläutert. Schließlich stellen wir fest, dass eine hohe relative Konzentration der RNA in einem DNA / RNA-Gemisch kann die erwartete positive Ergebnis Disches Assay maskieren; dies falsch negative für DNA resultiert aus der Tatsache, dass eine hohe Molenbruch von RNA reagiert auch über Furfural Zwischenprodukte, mit der Disches Reagenzien, sondern ergibt ein farbloses Produkt anstelle des blauen Addukt durch Reaktion mit dem 2'-deoxypentose Zucker der DNA hergestellt.

Potenzielle Störfaktoren: Neben den offensichtlichen Fall von Zucker, Lipide und Proteine ​​sind zwei weitere Biomoleküle, die hypothetisch verursachen könnten Probleme mit dieser kolorimetrischen Assays aufgrund Kreuzreaktivität (false positives) oder maskierte Reaktivität (falsch negativ). Im Prinzip könnten verschiedene Arten von zellularen Lipide denkbar stören, einschließlich glycosylglycerols und andere Glycerolipiden konjugiert Zuckern, Glycosphingolipide (zB Wachshautbrosides), saccharolipids (z. B. Glucosamin-Derivate), Lipopolysaccharide, und so weiter. In der Praxis sind diese Klassen von Lipiden kaum ein Problem im Umgang mit lipophilen Proteinen darstellen, da sie relativ selten, sind im Vergleich zu den viel häufiger Phospholipide, und damit unterhalb der Nachweisgrenze der Assays. Da die meisten der oben genannten zellulären Lipide auf Hexosen (Galaktose, Glukose) als Pentosen gebaut werden, sollten sie nicht als False-Positives in der Bial-oder Disches Assays stören. Kostenlose Monosacchariden, die False-Positives geben kann Fructose, Galactofuranose oder andere Furanosen. Auf einem verwandten beachten, könnten Störungen durch unerwünschte Zucker ein Problem für rekombinante Proteine ​​mit Maltose-bindende Protein (MBP) Tags ausgedrückt werden. Im Affinitätschromatographieschritte verwendet, um solche Fusionskonstrukte Reinigung wird Maltose verwendet, um das Protein zu eluieren, und es ist denkbar, daß restliche Maltose in nachgeschalteten Zubereitungen konnten mit th interferierene Benedikt Assay (es ist die allgemeine / unspezifische der Assays, die Glucose-Einheiten von Maltose sollte nicht unter der Bial-oder Disches reagieren). So müsste man vorsichtig in den post-chromatographischen Schritten auszuüben, um sicherzustellen, dass verbleibende Maltose nicht ergeben falsche Ergebnisse. Wir haben nicht glucosylierten Proteine ​​oder andere Glykoproteine ​​getestet, aber wir vermuten, dass es schwierig wäre, ein klares positives Ergebnis auf die Anwesenheit von Zuckern auf solche Proteine ​​(oder Glycolipid, Proteoglykan, oder andere Glycokonjugate) zu erhalten, da zu erwarten, dass die Gruppierungen Glykans würde liegen unterhalb der Empfindlichkeitsgrenze der Assays. Im Prinzip wird eine Lösung, die eine freie Aldohexose wie Glucose, befreit von einer glucosylierten Protein über Säurehydrolyse, würde positiv getestet durch das Benedikts Assay; ähnlich, ein Glykoprotein-abgeleiteten Pentose, wie Xylose, sollte ein positives Ergebnis im Bial nachgeben Assay. In der Praxis jedoch ein positives Ergebnis für Glykoproteine ​​würde erfordern extrem h igh Proteinkonzentrationen, auch für mehrfach glykosylierten Polypeptiden, wegen der geringen Zucker / Protein Molverhältnis.

Die Assay-Protokolle können die hier beschriebenen erweitert und angepasst werden, um die Grenzen der kleinen Stichprobe Griff - dh, kleine Volumina oder niedrige Konzentrationen von Analyten. Zur begrenzten Probenmengen haben wir gefunden, dass die Reaktionen können nach unten zu der 100-ul Bereich skaliert werden (zB unter Verwendung PCR-Röhrchen und einen Thermocycler für die Inkubationsschritte). Für kleine Probenvolumina bei niedrigen Konzentrationen (in der Nähe der Nachweisgrenze), ein Spektralphotometer mit einem Teller-Leser ausgestattet sind, können verwendet werden, in solchen Szenarien, die einzige zu erwartende Schwierigkeiten würden Entfernung von unerwünschten Fällungsmittel vor Absorptionsmessungen sein. Trotz der begrenzten Erfassungsbereich einfache Sichtprüfung ist ein Vorteil der hier beschriebene Ansatz ihrer Effizienz und Geschwindigkeit, mit Proben geeignet ist, sofort beim Erhitzen analysiert.

"> Anwendungen des Protokollen dargestellt sind hier die Identifizierung von Verbindungen mit-Reinigungskatalysator, Beurteilung der RNA oder DNA-Reinheit und dem Nachweis von Rest NA oder Zucker Kontamination in Proteinproben. Beispielsweise unerwünschte NA von unseren Assays detektiert aus entfernt werden kann ein Protein prep über chemische Mittel (z. B. alkalische Hydrolyse von RNA) oder enzymatischen Abbau (zB Nukleasebehandlung). Obwohl es alternative Lösungswege für die genannten Anwendungen sind, sind die hier beschriebenen Methoden hocheffiziente sowohl in Bezug auf Zeit und Kosten und kann daher leicht in einem experimentellen Arbeitsablauf integriert werden. Das frühzeitige Erkennen von Co-Reinigungskatalysator Verbindungen als freie reduzierende Zucker, RNA, DNA oder Protein kann das Design der nachgeschalteten Reinigungsstufen, gegenüber mühsamen Versuch und Irrtum Studien führen. Ein gemeinsamer Schritt nach unserer Protokollen könnte die Isolierung von RNA aus DNA und Protein sein, über Thiocyanat-Phenol-Chloroform Extraktion oder Rückgewinnung von DNA alone (durch Ausschließen thiocyanat). 20 Um die Reinheit der NA, die aus Phenol-Chloroform-Extraktionen beurteilen können diese kolorimetrischen Assays als einfache Alternative zur Elektrophorese oder DNase-Behandlung verwendet werden. In dieser und anderen Möglichkeiten, können die kolorimetrische Assays hier beschriebenen mit etablierten Methoden zur Protein-und NA Entschlossenheit, eine schnelle und robuste System für die Aufklärung der RNA, DNA und Protein-Komponenten in heterogenen biomolekularen Proben zu erzielen kombiniert werden.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der University of Virginia und der Jeffress Memorial Trust (J-971) finanziert. Wir danken L. Columbus, K. Jain, und P. Randolph für hilfreiche Diskussionen und die kritische Durchsicht des Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous sodium carbonate Fisher Scientific S263
Sodium citrate dihydrate Sigma S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate VWR VW3312-2
Orcinol monohydrate Sigma-Aldrich O1875
Concentrated HCl VWR BDH3030
Ferric chloride hexahydrate Sigma F-2877
Diphenylamine Aldrich 112763
Glacial acetic acid Fisher Scientific A28
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Ethanol Koptec V1101
Ribose Sigma R-7500 prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae) Sigma R6750 prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus Sigma D1501 prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C

Reagents, Equipment & Safety

Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.

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Schnelle kolorimetrische Assays zur Qualitativ unterscheiden RNA und DNA in Biomolekulare Proben
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Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).More

Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).

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