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Chemistry

定性的には生体試料中のRNAおよびDNAを区別するために迅速比色アッセイ

doi: 10.3791/50225 Published: February 4, 2013

Summary

比色アッセイのスイートが急速に区別するタンパク質、RNA、DNA、および潜在的に異種生体試料中の再ducing糖に記載されている。

Abstract

生化学的な実験は、一般的に潜在的に異種の標本で正確な核酸の初期段階での知識、、、タンパク質、その他の生体分子のコンポーネントを必要とします。核酸は、それは容易に区別することはできませんが( 例えば 、260)、蛍光( 例えば 、蛍光色素の結合)、または比色(ヌクレオシド特有の発色の化学反応)。1光度アール分析方法など、いくつかの確立されたアプローチを介して検出することができますそれは280 nm付近で主に吸収260nmおよびタンパク質近く主に吸収する核酸、の相対量の簡便かつ迅速な2アセスメントを提供しているので、DNAからRNAが、260/280比は、一般的に採用されている。 1.5 3比<純粋な核酸(NA)の比によって特徴付けられる一方0.8は、 "純粋な"タンパク質試料の指標として採用されています>。

ホーwever、タンパク質/ NAのコンテンツがあると明確に、または確実に単純なUV-VIS分光光度測定から推測できないようなシナリオがあります。いくつかの小さなRNA結合タンパク質の場合と同様、例えば、(i)のサンプルは、≈280 nmの(トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン)の吸収を担当する芳香族アミノ酸の相対的に欠いている1つ以上のタンパク質が含まれていたり、 (ⅱ)サンプルはタンパク質/ NA含有量ははるかに少ない明らかであり、さらにタンパク質とNAコンポーネント間のいくつかの高親和性の関連性を反映している可能性がある中間の260 / A 280比(〜0.8 <〜1.5)を、示すことができる。このようなシナリオのために、私たちは急速に生体分子の潜在的混合試料中のRNA、DNA、および還元糖を区別するための比色アッセイの本明細書中にスイートを記述します。方法はベネディクトの、Bial社の(オルシノール)、およびDischeの(ジフェニルアミン)試薬にペントースおよび他の炭水化物の感受性差に依存して、合理化されたプロトコルは、comできるコンポーネントを分離することのいずれかの追加手順なしで、ほんの数分で竣工。アッセイは、RNAとDNAの区別だけでなく、例えば、グルコース、フルクトース、リボース( 図1)のようなフリーの還元糖の存在を示すために並行して行うことができる。

Introduction

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多くの細胞生物学では、DNAとRNAが関与する分子間相互作用を介して行われます。4これらの天然に存在する核酸(NAS)( 例えば 、二価カチオンタンパク質、6とし、in vivoでの小分子化合物とリガンドのホストと、互いに5対話7)。相互作用は(動力学的に)短期または長命かもしれ範囲高から低親和性(熱力学的強度)に中等度の場合があり、また化学的性質や特異性の大幅な変動を示すことができます-いくつかの団体は、非常に特異的である( 例えば 、DNA· ··転写因子は、RNA···スプライシング因子)、他の相互作用は、必ずしも、はるかに一般的な( 例えば 、DNA···細菌のヒストン様蛋白質HU 8)している間。 NASとの非特異的な相互作用はbiomoの混合物を含むin vitro実験のための実用的な結果をもたらす可能性があるlecules、それはいくつかのNASは、少なくとも使用されている実験条件のいくつかのサブセット(イオン強度、溶液のpH、 )で、目的の生体分子に関連付けることが可能で、さらにそうであるように。

大腸菌細胞培養における組換えタンパク質の異種過剰発現を介して 、例えば、利息(ポイ)のタンパク質の産生を考慮して、そのような手順は、日常的に実質的に任意の構造生物学の研究室で行われる9さらなる実験のための準備では、そのような。生化学/生物物理学的特性、結晶化などのように、初期の取り組みは、一般的に理想的に化学的に均質と生物物理学的に単分散の標本として、できるだけ純粋な形としてPOIの十分な量を得ることに焦点を当てる。宿主細胞の破壊の後、代表的な浄化ワークフローの初期段階では、EからPOIを隔離することを目指して大腸菌タンパク質、核酸、細胞壁の破片、細胞溶解物のおよびその他のコンポーネント。ただし、ホストNASはいくつかの物理化学的な理由のためにポイと共精製することができる-非常に基本的なPOIが非特異プルダウン宿主DNA / RNAのかもしれません。POIは( 例えば 、前述のHU)ジェネリックNA-結合活性を持つことができます。 POIは、宿主のRNAまたはDNAでかなり特定のNA-結合タンパク質が、展示物の交差反応性であってもよく、ホストNASはPOIにクロマトグラフィーマトリックスと相互作用し、それによって、単に共溶出ができるように続きます。 NAの不純物はおそらく下流の実験( 例えば 、POI•RNA結合10の蛍光異方性アッセイ)を妨害する可能性がありますので、POIにホストNAの見境のない、高親和性結合は厄介な問題を提起することができます。このような相互作用は、POIの核酸結合能を照らす別の方法として、予期せぬPOIが···NAの関連付けも、偶発的に閲覧することができます。どちらにしても、NASはキーコンポーネントや汚染物質であるかどうか、片方が最初に定量化しなければなりません下流の実験の準備のために共同浄化NAのタイプ(DNA、RNA)を識別します。

いくつかの分析法の検出とサンプルでNASを定量するために存在しています。利用可能なメソッドのほとんどは、(基本的にはどちらか( 例えば 、チアゾールオレンジまたはNAに他の蛍光色素の結合)蛍光( 例えば 、260の吸光度値と260 / A 280比)分光光度、または比色アール化学反応へのヌクレオシドの感受性しかし、RNAまたはDNAのポリヌクレオチドの種類を識別するための重要なステップは、これらの定量の多くの範囲を超えて、電磁スペクトルの紫外-可視領域で吸収降伏発色団)が、、最近ドゥ·メイによって記載され、図1アプローチ。ここでは、急速にタンパク質性のサンプルにはNAコンポーネントの種類を識別するための比色アッセイのセットを提供します。

プロトコルは、ここでcを説明効率的に潜在的なNAの不純物を分離する追加のステップなしで実行され、糖質11を減少させるためベネディクトのアッセイに依存し、2'-deoxypentosesのペントース12,13及びジフェニルアミン反応14,15( 図1および図2)オルシノール検定さ。ベネディクトのテスト( 図2a)は、アルドース糖の形として砂糖のカルボニルの付随酸化によるCu 2 Oのカルボン酸部分と生産にCu 2 +を 、減少させるために、線形、開鎖(アルデヒド)の能力を活用不溶性の赤色沈殿。この反応は、アルドースやケトースのようなフリーの還元糖(エンジオール中間体を介して対応するアルドースに変換する)とではなく、DNAまたはRNAポリヌクレオチドの共有バックボーンの一部として循環形式にロックされペントース糖と陽性になります。無料のヘミアセタール機能のミニマル要件、他の共有者のためしたがって、潜在的な妨害物として働く- -このアッセイで陽性でしたmpoundsは、α-ヒドロキシケトンおよび短いオリゴ糖( 例えば二糖マルトース)が含まれています。両方Bial社のオルシノール( 図2b)とDischeのジフェニルアミン( 図2c)の反応は、ポリヌクレオチド鎖の最初の破壊に基づくものであり、ヌクレオシドの脱プリン反応、さらに酸または親ヌクレオチドの塩基触媒による加水分解を経て、フラン-2を得るためにカルボアルデヒド( フルフラール )誘導体;これらのデリバティブは、そのようなオルシノール(Bial社の)またはジフェニルアミン(Discheの)大部分は未知の化学構造の着色された縮合生成物を形成するための試薬 ​​としてフェノールどちらヒドロキシと反応する。 DischeのアッセイのRNA特異対DNAは五炭糖がさらにジフェニルアミンと反応して、ω-hydroxylevulinylアルデヒドに酸化されやすいようにするために、2'-脱酸素化でなければならないという事実から生じ酸性条件下で明るい青コンデンセート( 図2c)を得た。ここで説明する合理化されたプロトコルを使用して、我々はこれらの糖特異的比色反応はRNAとDNAとを区別することができ、また、そのような生体分子試料中のグルコース、フルクトース、またはリボースなどのフリー還元糖の存在を示すことに気づいています。

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Protocol

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1。糖分を減らすためのベネディクトのアッセイ

  1. 940 mMの無水炭酸ナトリウム、588 mMクエン酸ナトリウム水和物、68 mMの硫酸銅(II)五水和物 - ベネディクト試薬の適切な量を用意する。この試薬は、反応性に目立った変化が、少なくとも6ヶ月間室温(RT)で保存することができます。
  2. 上記試薬は6倍です。このように、600μlの反応のために、アッセイすべき試料につき、新しい1.5 mlマイクロチューブ( 例えば 、エッペンドルフブランド)にベネディクト試薬100μlを加える。
  3. このチューブに10μlのサンプルを500μlのどこにでも追加します。最適なボリュームが初期試運転で発色の強度に基づいて決定することができる。十分なサンプルが利用可能であれば、その後のアッセイで希釈後、可能な最大サンプル·ボリューム( すなわち 、全体的な反応容量6分の5、この場合のサンプルを500μl)でこのような試験を開始します。
  4. TUに蒸留H 2 Oを追加ボルテックスまたはピペッティングにより溶液を混ぜて、600μlに最終的なボリュームをもたらすことである。
  5. 沸騰水浴中で20分間、サンプルをインキュベートする。
  6. 浴から加熱された試料を取り出して、それを室温で10分間放置してください。
  7. 土砂任意の粒子状物質をするために5分間> 9300 XG(FA45-24-11エッペンドルフ固定アングルローターで〜10,000 rpm)でサンプルチューブを遠心し、このステップでは、定量的ではなく、質的研究のためにも重要である。
  8. アリコートきれいにキュベットに注入し、このチューブから上清。
  9. 水とUV-VIS分光光度計を空白にします。
  10. 475 nmで、このサンプルの吸光度を測定します。

2。ペントース糖用Bial社のオルシノールアッセイ

  1. 新鮮Bial社の試薬 ​​の適量準備- 24.2 mMのオルシノール水和物(この化合物の構造について図2bを参照)、6 M塩酸、0.025%(w / v)の塩化第二鉄六水和物の点に注意してくださいストレージ容量を拡張できる、Bial社の試薬 ​​は、2つの別々の原液として調製することができる:(i)試薬[濃HClで0.05%(w / v)のFeCl3•6H 2 O〕および(ii)試薬B [422 mMのオルシノール水和物は95で調製した%エタノール]。試薬6ヶ月間室温で保存できます。試薬Bは、光の露出を制限するための箔で覆って、1ヶ月間、4℃で保存することができます。これらの原液を15()中で混合されています:使用前に1(b)はV / v比。
  2. 上記試薬は2倍に拡張しています。したがって、1.0 mlの反応では、アッセイすべき試料につき、新しい1.5 mlマイクロチューブにBial社の試薬500μlを添加する。
  3. このチューブに10μlのサンプルを500μlにどこでも入れる。十分なサンプルが利用可能である場合はノート1.3%(上記)と同様にして、可能な最大サンプル量を( すなわち 、半分反応全体のボリューム、この場合のサンプルを500μl)を用いて試験反応を開始し、そこから薄める。
  4. fを持って来るためにチューブに蒸留H 2 Oを追加1.0ミリリットルにinal容積;ボルテックスまたはピペッティングにより溶液を混ぜる。
  5. 沸騰水浴中で20分間、サンプルをインキュベートする。
  6. 浴から加熱された試料を取り出して、それを室温で10分間放置してください。
  7. 土砂任意の粒子状物質をするために5分間> 9300 XG(FA45-24-11エッペンドルフ固定アングルローターで〜10,000 rpm)でサンプルチューブを遠心し、このステップでは、定量的ではなく、質的研究のためにも重要である。
  8. アリコート目視検査のためのクリーンなキュベットに注入し、このチューブから上清。
  9. 半定量分析のために、水とUV-VIS分光光度計をブランクおよび660nmでキュベット、サンプルの吸光度を測定する。

3。 2'-deoxypentose糖についてDischeのジフェニルアミンアッセイ

  1. 60mMのジフェニルアミン、11M氷酢酸、179 mMの硫酸、62%v / vエタノール- Discheのジフェニルアミン試薬の適切な量を用意する。この試薬は、事前にすることができます事前に比べ、ダーク容器内に室温で保存、または光の露出を制限するために、箔で覆われている。実際には、それが反応性には明らかな変化と、2〜3ヶ月を準備することができますが、光感受性のために試薬が、無期限に保存するべきではありません。
  2. 上記試薬は2倍に拡張しています。したがって、1.0 mlの反応では、アッセイすべき試料につき、新しい1.5 mlマイクロチューブにDischeの試薬500μlを添加する。
  3. このチューブに10μlのサンプルを500μlにどこでも入れる。十分なサンプルが利用可能である場合はノート1.3%(上記)と同様にして、可能な最大サンプル量を( すなわち 、半分反応全体のボリューム、この場合のサンプルを500μl)を用いて試験反応を開始し、そこから薄める。
  4. 1.0mlに最終的なボリュームを持って来るためにチューブに蒸留H 2 Oを追加します;ボルテックスまたはピペッティングにより溶液を混ぜる。
  5. 沸騰水浴中で20分間、サンプルをインキュベートする。
  6. 浴から加熱された試料を取り出して、アロ室温で10分間冷却して、それをワット
  7. 土砂任意の粒子状物質をするために5分間> 9300 XG(FA45-24-11エッペンドルフ固定アングルローターで〜10,000 rpm)でサンプルチューブを遠心し、このステップでは、定量的ではなく、質的研究のためにも重要である。
  8. アリコート目視検査のためのクリーンなキュベットに注入し、このチューブから上清。
  9. 半定量分析のために、水とUV-VIS分光光度計をブランクおよび600nmでキュベット、サンプルの吸光度を測定する。

4。さらに使用上の注意

  1. 分子の以下のクラスは、各アッセイのために、正と負の制御反応に適した参照化合物である:
    • ベネディクトの-正=フリーリボース、フルクトース、グルコース、負=、RNA、DNA、ATP、 など 。 (任意の糖類が遊離還元糖の機能性を欠いている)
    • Bial社の-正= RNA( 例えばパン酵母エキス)、リボースは、ATP、UMP、負=ウシSERUMアルブミン(BSA)、または任意の他のタンパク質
    • Discheの-正= DNA( 例えばウシ胸腺)、負= RNA、ATP など 。 (任意の非2'-脱酸素ヌクレオチド)
  2. これらのアッセイは、しばしばタンパク質精製で使用される化合物にかなり弾力的であることが判明している。例えば、NaClなど、(NH 4)2 SO 4、K 2 SO 4などの一般的な塩には干渉しなかったし、反応がで一般的に影響現れる希釈剤の内容。 pHは非常に基本的である場合、界面活性剤または尿素のようなカオトロピック剤は、アッセイの反応性に影響を与える可能性があり、酸性のpH範囲にニュートラル(テキストと陽子を見ているから、基礎となる反応化学の一般Bial社さんとDischeのアッセイのために最も最適である図2b、c)のインチ潜在的に次善の反応条件は、疑いのある干渉など 。正と負の制御実験wを使用して、ケース·バイ·ケースでテストする必要がありますi番目の基準化合物。

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Representative Results

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結果は、既知の基準化合物へのこれらの比色アッセイのアプリケーションについては、 図3に示されている。代表的な定性データは、ベネディクトの(a)は、Bial社のオルシノール(b)、およびDischeのジフェニルアミン(c)のアッセイのために示されており、これらの3つのアッセイのための標準曲線を図4に示します。パネル3(AC)で、左側のパネルは適切に反応/反応しない検体を使用して、ポジティブ/ネガティブコントロール実験を示す;プロトコル1-3(上)で説明するように、これらの視覚的な結果がキュベットに、 その場で表示されます。サブパネルの権利は、それぞれの検体の滴シリーズを示しています。ネガティブコントロールは、水、ジェネリックタンパク質(0.75 mg / mlのBSA)、および2つの非還元糖(DNAの0.75 mg / mlであるがベネディクトの検定()では、陽性対照は、リボース(0.42 mg / ml)であるとRNAで12.5 mg / ml)を。オルシノール検定(b)に、陽性対照は、リボース(0.15 mg / ml)を、RNA(7.5 mg / ml)であり、DNA(0.45 mg / ml)であり、一方、水とBSタンパク質は、(0.45 mg / ml)をネガティブコントロールです。ジフェニルアミンアッセイ(c)では、子牛胸腺DNAは(0.45 mg / ml)を陽性対照として示されており、水、酵母エキスのRNA(7.5 mg / ml)を、リボース(0.15 mg / ml)を、およびBSA(0.45ミリグラム/ ml)をネガティブコントロールとして機能します。 DNAの2濃度は左の2つのサンプル中のポジティブコントロール(キュベット1-2)、DNA + RNAの混合物(のように表示されます最後に、パネル(d)は、異質性を変えるのサンプルでDischeの反応を示すことによってアッセイの堅牢性を示して様々な比率で)は、次の3つのサンプル(3-5)に示すように、最終的な3つのサンプルは、核酸結合タンパク質 "HFQ 'の不在(サンプル6)または存在下(試料7-8)でDNAを示しています。 Discheのアッセイの陽性結果であっても'汚染' RNAまたはタンパク質の存在下でDNA含有試料のために保持されていることに注意してください16。

定量分析:各ので、パネルは異なり、図3の希釈範囲(AC)反応は、アッセイされる砂糖の種類に応じて、異なる視覚検出限界を持っています。光度は、むしろビジュアルより、検出は、 例えば (a)としてベネディクトの、(b)にBial社の、および(c)Discheのアッセイのために、図4に示すように測定レンジを改善するために使用することができます。ここに記載されているプロトコルは、主に定性的なアッセイとして意図されているけれども、吸光度と濃度の間のランベルト·ベールの関係は砂糖や核酸含量の少なくとも半定量的な推定を可能にします。ベネディクトのテストの校正のための標準曲線の一例として、リボース濃度に対する吸光度の線形回帰当てはめ(475 nm)は図4(a)に示され、エラーバーは標準= 3複製さnの偏差、示す乗相関係数が用意されています。非常に低いリボース濃度( 例えば 0.28 mMの測地系)での直線からの偏差は、このアッセイの感度が制限を反映している。のようだ主に質的研究のために意図されており、以下のガイドラインは、半定量分析のために提案されて書かれています:

  • ベネディクトのアッセイ( 図4a)の場合:反応読み出し(475nm)などの三連で行われ、少なくとも範囲0.04→0.5 mg / mlの検体にわたって線形であることが判明した。
  • Bial社のアッセイ( 図4b)の場合:(パン酵母RNA)が少なくとも範囲で0→0.5 mg / mlの検体線形であった吸光度データ(660nmの )、アッセイは三連で行われた(R 2 = 0.99線形回帰係数)。試料を吸光度測定前に明確にするために遠心分離したものの、全く沈殿剤は、検体のこれらの低濃度で見つからないので、遠心分離段階は厳密には必要ではありませんでした。アッセイは、この範囲を超える検体の濃度の線形性から外れる。
  • 600nmの :Discheのアッセイ( 図4c)のために2 = 0.99)三重で行われた。吸光度のプロット対[検体]線形応答領域の境界を示す、0.90 mg / mlのDNAでプラトーに始まった。
  • 定量的又は半定量分析のための実践的な考慮事項:特に吸光度を妨げる沈殿した物質を除去するには、すべての3つのアッセイは、時間の合理的な長さのための最大速度(25,000 xgで、または何でも限界マイクロチューブで耐えることができる)で遠心分離を必要とする( 例えば 、20分)、これは高い分析物濃度では特に重要です。遠心分離後、清澄サンプルは便利吸光度測定用キュベットまたはマイクロプレート( 例えば 、96ウェルマイクロタイタープレート)に転送することができます。

図1 図1。アッセイのためのデシジョンツリー。生体分子の潜在的に不均質な試料( 例えば 、全細胞溶解物から)を皮切りに、ここで説明した比色アッセイ混合物は非還元糖を(ベネディクトのテスト)が含まれているかどうかを判断するために使用することができます。もしそうなら、Bial社のオルシノールテストはさらに、非還元糖の人口はペントース環(DNAまたはRNAのように)、対ヘキソース( 例えば 、グルコース、他のピラノース)そしておそらくまだ他のアルドースを含むかどうかを明らかにする。サンプルはDNAの少なくとも適度分数が含まれている場合は最後に、その後、2'-デオキシリボース環は目に見えて青縮合生成物を得、Discheのジフェニルアミン試薬と(酸性化し、加熱時)に反応します。この図では、 決定木ではなく、フローチャートであることに注意してください:検定結果の論理が示されているのeriallyが、アッセイは、並列に実行することができる。

図2
図2。基礎となる化学反応は対応する反応と一緒に示されている検出可能な着色された製品で、比色アッセイのために示されている。 (a)はCu 2 Oの不溶性、赤い沈殿物が糖を減少させるためのベネディクトのアッセイの陽性の結果である。 (b)の加熱と酸性化すると、ペントース環を含有する糖は、水溶性の青緑色付加物を得た後、オルシノールと反応してフルフラール (Bial社の試薬 ​​)に分解します。 Discheの検定、2 '位水酸基の置換基の欠如が開環 ​​酸化反応、さらにジフェニルアミンと反応して、そのうちのアルデヒド生成を可能にするには[(PH)2 NH]明るい青生成物を得た。化学世紀ructuresは、大規模マルチリングオルシノールの縮合生成物(b)とジフェニルアミン(c)の反応のため不明である。

図3
図3。基準化合物および異種のサンプルに比色アッセイのアプリケーション。サンプル結果は、ベネディクトの(a)は、Bial社の(b)、およびDischeの(c)の比色アッセイのために示されている。 (A)→(c)で、左サブパネルは、各分析対象成分の滴定系列を表示適当に反応/反応しない検体とサブパネル権利を使用してポジティブ/ネガティブコントロールを示しています。また、(d)に示す前記検体が不均一に変化Dische反応の実例パネルです - DNA単独(左)、DNA / RNAの異なる比(中央)の混合物、または核酸結合タンパク質(の存在下でDNAのいずれかを'HFQ')。これらのパネルさらにテキストの代表的な結果セクションで説明されています。

図4
図4。参照化合物のアッセイから標準曲線。検量線は各アッセイについて線形応答領域の代表的な部分を描いた、ベネディクトの()、Bial社の(b)、およびDischeの(c)のアッセイのために示されている。線形回帰の近似と対応する相関係数はそれぞれのアッセイのために示されている。標準パン酵母RNA(b)およびウシ胸腺DNA(c)は、これらの滴シリーズの検体であった。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください

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Discussion

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比色アッセイは、急速にそのようなさらなる研究のための準備として、全細胞溶解物からのタンパク質、RNAまたは複合体を精製する際に遭遇するなどの生体分子の混合物の化学的性質を評価するためのシンプルなアプローチを提供するここに提示した。構造生物学は、このような試料の不均一性など、よりネイティブライクなアセンブリ、徐々に大きな課題を追求したように、複雑で多成分複合体によってもたらされます。超分子集合体は、多くの場合、わずかに安定しており、彼らの成功したアイソレーションはそれほど厳しく精製条件( 例えば 、スプライソソームsnRNP複合体17,18のために見られるように)要求することができる。そのような温和な条件に本物と偽の両方の下にポイ···NAの相互作用が持続することにより、標的タンパク質または核酸とダウンストリームアッセイに干渉する可能性が高くなります。必要な最初のステップは、これらの試料中の化学成分の種類の同定である。

RNA、DNA、タンパク質を検出するve_content ">メソッドは、最も重要なのは、一つは検体の可能性が高い化学組成に関する予備知識です。タンパク質性材料はによって検出することができ、おそらく量および検体の濃度が、利用可能なリソースと時間の制約に応じて変化し、分光しているもの(280)を含む、多くの十分に確立された方法で、流体力学(ゲル電気泳動)、質量分析法を経由して高い感度と精度で化学/比色19( 例えば 、ペプチド結合のためビウレット試験)と、同様に、NASメソッドの機能の各タイプの特性の長所と短所は、SYBRゴールド、ピコグリーン、例えば。分光(260)、蛍光または化学的ア ​​ッセイ(ここで説明)によって検出され、他のシアニン系蛍光色素がに極めて敏感であることができます核酸(比色アッセイを超えて何桁)は、( 例えば 、ピック選択の様々な程度を示すoGreenは、二本鎖DNAのために、SYBR-Goldは、ほとんどのNAS)に結合し、また、定量を目的とした広いダイナミックレンジを備えています。染料は、エチジウムブロマイドと同類変異原性物質として扱われます。色素は検出のための、より高度な機器(ゲル用transilluminators、バッチサンプル用spectrofluorometers)、対比色アッセイのシンプルなビジュアル読み出しを必要とし、そこに:しかし、これらのアプローチには限界がないわけではないアッセイ条件に関する規制(;> 200 mMのNaClでピコグリーン信号強度の30%削減など 、SYBR-Goldの7から8.5の推奨pH範囲)です。従って、比色及び蛍光ベースのアッセイは相補的である:核酸色素は、急速な比色アッセイで陰性結果の場合に特に有用であること、または、より慎重にする方法として、(定量的)比色アッセイからの初期結果に拡大する可能性がある。比色NAのプロトコルの基本的な利点は、使いやすさに加えて、彼らはもっぱら内的共に依存していることであるむしろfold/3D構造、反応性、あるいは配列と異なる場合がありますバイオポリマーの他の特性よりもNAの原子価構造。

プロトコルは、反応生成物の簡単な目視検査を用いて行ったときに、特に、最も困難に対して頑健である、ここで説明、特別な注意は、より定量(吸光光度法)分析のために採取する必要があります。例えば、ベネディクトのアッセイでリボースの高濃度の存在下で形成赤色沈殿剤は、(ppt)を前に分光光度分析に除去されなければならないが、これは容易に遠心分離によって達成される。 Discheのアッセイのために、ジフェニルアミン試薬の添加は、加熱によって可溶化することができるホワイトpptの形成を伴っている、DNAの存在下でのフォームは分光光度測定に干渉する可能性と定量分析の前に除去しなければならないことを緑のppt。また、各アッセイは影響を受けやすい化学反応に基づいている潜在的な干渉に、冒頭で述べた、以下にさらに詳述。最後に、我々はDNA / RNAの混合物中のRNAの高い相対濃度がDischeのアッセイの予想された肯定的な結果を隠すことができることに注意して、DNAのこの偽陰性は、RNAの高いモル分率も反応するという事実に起因し、 フルフラール中間を経由して 、 Discheの試薬を用いたが、無色の製品ではなく、DNAの2'-deoxypentose砂糖との反応によって生成される青付加物が得られます。

潜在的な妨害物:糖、脂質やタンパク質の明白なケースを超えては仮に交差反応性(偽陽性)またはマスクされた反応性(偽陰性)のために、これらの比色アッセイとのトラブルを引き起こす可能性が他の二つの生体分子である。原理的には、細胞脂質にはいくつかの種類が考えられる糖と共役glycosylglycerolsや他グリセロ脂質、スフィンゴ糖脂質( 例えば 、ろう膜を含む、干渉する可能性があるbrosides)ので、上のsaccharolipids( 例えば 、グルコサミン誘導体)、リポ多糖、および。彼らは比較的まれであるのに対し、はるかに豊富なリン脂質、したがって、私たちのアッセイの検出限界以下であるため、実際には、脂質のこれらのクラスは、親油性タンパク質での作業に問題を引き起こすことはほとんどありません。前述の細胞脂質のほとんどはむしろペントースよりもヘキソース(ガラクトース、グルコース)の上に構築されるので、それらはBial社のまたはDischeのアッセイにおける偽陽性として干渉すべきではない。偽陽性を与える可能性があります無料の単糖はフルクトース、galactofuranose、または他のフラノースが含まれています。これに関連して、不要な糖からの干渉は、マルトース結合タンパク質(MBP)のタグで発現させた組換えタンパク質の問題になる可能性があります。アフィニティークロマトグラフィーでは、このような融合構築物を精製するために使用されるステップ、マルトースは、タンパク質を溶出するために使用され、それが下流の製剤中の残留マルトースは番目に干渉する可能性があることが考えられる電子ベネディクトのアッセイ(それがアッセイの最も一般的/非特異的であり、マルトースのグルコース単位はBial社のまたはDischeの下で反応してはならない)。したがって、1つは残留マルトースが誤った結果が得られなかったことを保証するために、ポストクロマトグラフィー工程に警戒する必要があります。我々は、グルコシルタンパク質または他の糖タンパク質をテストしていませんが、我々は糖鎖部分は、と予想するので、それはそのようなタンパク質(又は糖脂質、プロテオグリカン、または他の複合糖質)の糖の存在のための明確な肯定的な結果を得ることは困難であろうことを疑う私たちのアッセイの感度限界の下にある。原理的には、酸加水分解を介してグルコシルタンパク質から遊離グルコースなどのフリーアルドヘキソースを含有する溶液は、ベネディクトのアッセイにより陽性となる、同様に、そのようなキシロースのような糖タンパク質由来のペントースは、Bial社の中で肯定的な結果が得られるはずアッセイ。しかし、実際には糖タンパク質の陽性結果は、非常に時間が必要となるなぜなら低糖/タンパク質のモル比であっても乗算グリコシル化ポリペプチドのためのIgHタンパク質濃度、、。

すなわち 、小さなボリュームまたは検体の低濃度-ここに記載のアッセイプロトコルは、小さなサンプルサイズの限界を扱えるように拡張し、適応することができます。限られたサンプルの注文については、我々は反応が100μlの範囲( 例えば 、PCRチューブおよびインキュベーションステップ用サーマルサイクラーを使用)に縮小することができることを見出した。低濃度で小容量の試料(検出限界に近い)は、プレートリーダーを搭載した分光光度計を使用することができ、そのようなシナリオでは、唯一の予想される困難は、事前吸光度測定に不要な沈殿剤の除去となります。簡単な目視検査の限られた検出範囲にもかかわらず、ここで説明するアプローチの利点は、加熱時に瞬時に分析することができるサンプルを用いて、その効率性と迅速性です。

"プロトコルの>アプリケーションは、共精製化合物、RNAまたはDNA純度の評価、およびタンパク質サンプル中の残留NAまたは砂糖の汚染の検出の識別を含むここに提示した。例えば、我々のアッセイによって検出された不要なNAはから削除することができます化学的手段( 例えば 、RNAのアルカリ加水分解)または酵素消化( 例えば 、ヌクレアーゼ処理)を介してタンパク質の予備校。このようなアプリケーションへの代替的アプローチがありますが、ここで説明する方法は、時間とコストの両方の点で非常に効率的である、とすることができますしたがって、簡単に実験のワークフローに統合すること。フリー還元糖、RNA、DNA、またはタンパク質などの共精製化合物の早期発見は、下流の精製工程の設計、対骨の折れる試行錯誤の研究を指導することができます我々のプロトコールに従って一般的なステップは、チオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出、またはDNA ALONのリカバリーを介して 、DNAとタンパク質からRNAを単離するかもしれないE(チオシアン酸を除くことにより)20フェノール-クロロホルム抽出に起因するNAの純度を評価するためには、これらの比色アッセイは、電気泳動やDNase処理の単純な代替として使用することができます。これと他の方法では、ここで説明する比色アッセイは、タンパク質と異種生体試料中のRNA、DNAおよびタンパク質成分を解明するため、迅速かつ堅牢なシステムを実現するNAの決定のための十分に確立された方法と組み合わせることができます。

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Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgments

この作品は、バージニア大学とJeffress記念信託(J-971)によって賄われていた。我々は有用な議論と原稿の批判的な読みに対して、L.コロンバス、K. Jainさん、およびP.ランドルフに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous sodium carbonate Fisher Scientific S263
Sodium citrate dihydrate Sigma S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate VWR VW3312-2
Orcinol monohydrate Sigma-Aldrich O1875
Concentrated HCl VWR BDH3030
Ferric chloride hexahydrate Sigma F-2877
Diphenylamine Aldrich 112763
Glacial acetic acid Fisher Scientific A28
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Ethanol Koptec V1101
Ribose Sigma R-7500 prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae) Sigma R6750 prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus Sigma D1501 prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C

Reagents, Equipment & Safety

Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.

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定性的には生体試料中のRNAおよびDNAを区別するために迅速比色アッセイ
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Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).More

Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).

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