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Chemistry

신속한 Colorimetric Assays는 질적 Biomolecular 샘플에서 RNA와 DNA를 구별 할

doi: 10.3791/50225 Published: February 4, 2013

Summary

colorimetric assays의 스위트 룸은 급속하게 구별 단백질, RNA, DNA, 그리고 잠재적으로 이기종 biomolecular 샘플에 다시 ducing 설탕에 설명되어 있습니다.

Abstract

생화학 실험은 일반적으로 잠재적 이기종 표본에 정확한 핵산의 초기 단계에서 지식,,, 단백질 및 기타 biomolecular 구성 요소가 필요합니다. 핵산이가 쉽게 구별 할 수 있지만 (예를 들어, 260), fluorometric (예, 형광 염료의 결합) 또는 colorimetric (뉴 클레오 사이드 별 chromogenic 화학 반응) 1. 분광 아르 분석 방법 등 여러 설립 방식을 통해 감지 할 수 있습니다 RNA DNA에서 260은 260 nm의 주로 280 nm의 가까이에 흡수 단백질, 근처에 주로 흡수 핵산의 상대적 내용의 간단하고 빠른이 평가를 제공으로 / A 280의 비율이 일반적으로 사용된다. 1.5 비율은 <순수 핵산 (NA)이 비율을 특징으로하는 동안 0.8는 '순수'단백질 표본을 나타내는로 이동합니다>.

호wever, 단백질 / NA 내용으로 명확하게하거나 안정적으로 간단한 UV-VIS 분광 측정에서 유추 할 수 없습니다있는 경우도 있습니다. 예를 들어,은 (i) 샘플 같은 일부 작은 RNA 결합 단백질의 경우는, ≈ 280 nm의 (TRP, 티르, Phe)에서 흡수에 책임이있는 향기로운 아미노산이 상대적으로 결여있는 하나 이상의 단백질을 포함하고 있습니다 (II) 샘플은 단백질 / NA 내용이 훨씬 덜 분명하다, 심지어 단백질과 NA 구성 요소 사이의 높은 친화력 협회가 반영 될 수 있습니다 중간 260 / A 280 비율을 (~ 0.8 <~ 1.5), 전시 할 수 있습니다. 이러한 시나리오의 경우, 우리는 빠르게 RNA, DNA, 그리고 분자의 잠재적 혼합 샘플에 설탕을 줄여을 구분하기 위해 본 colorimetric assays의 스위트 룸을 설명합니다. 방법은 베네딕트의에 pentoses 및 기타 탄수화물의 차동 감도에 의존 Bial의 (orcinol) 및 Dische의 (다이 페닐 아민) 시약은, 간소화 된 프로토콜은 COM 될 수 있습니다구성 요소를 분리해야하는 추가 단계없이 몇 분 만에 pleted. assays는뿐만 아니라 RNA와 DNA 사이의 구분과 같은 포도당, 과당, 그리고 리보오스 (그림 1)과 같은 무료 줄이고 설탕의 존재를 나타 내기 위해 병렬로 수행 할 수 있습니다.

Introduction

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많은 세포 생물학은 DNA와 RNA를 포함하는 분자의 상호 작용을 통해 발생합니다. 4이 자연적으로 발생하는 핵산은 (NAS) (예를 들어, 이가의 양이온 단백질, 6생체 내 작은 분자 화합물 및 리간드의 호스트와 함께 서로 5 상호 작용 7). 상호 작용이있을 수 있습니다 단기 또는 (kinetically) 수명이 긴, 낮은 친화력 (열역학적 힘)에 검토하기 위해 높은 곳에서 다양 할 수 있으며, 또한 화학 특성과 특이성에 상당한 변화를 전시 할 수 있습니다 - 일부 단체 (예, DNA 매우 구체적 · · · 전사 인자, RNA · · · 접합 요소), 다른 상호 작용 반드시 훨씬 더 일반적인하는 동안 (예를 들어, DNA · · · 세균 히스톤 같은 HU 단백질 8). NAS와 비 특정 상호 작용은 biomo의 혼합물을 포함하는 체외 실험에서에 대한 실질적인 결과를 가질 수lecules, 그건 일부 NAS가 적어도 사용되는 실험 조건의 일부 하위 집합 (이온 강도, 솔루션 산도 등)에 따라, 관심있는 분자와 연관 될 가능, 심지어 가능성이 있습니다.

대장균의 세포 배양에서 재조합 단백질의 heterologous 이상의 표현을 통해, 예를 들어, 관심 (POI)의 단백질의 생산을 고려, 이러한 절차는 정기적으로 거의 모든 구조 생물학 실험실에서 수행되는 구를 추가로 실험을 준비, 이러한. 생화학 / biophysical 특성, 결정 등., 초기 노력은 일반적으로 이상적인 화학적으로 균질하고 biophysically monodisperse 표본으로, 가능한 형태로 순수의 관심 장소의 충분한 수량을 확보에 주력으로. 호스트 세포의 파괴 후, 전형적인 정화 워크 플로우의 초기 단계 E.에서 관심 장소를 분리하는 것을 목표로 대장균의 단백질, 핵산, 세포 벽 파편,그리고 세포 lysate의 다른 구성 요소. 그러나, 호스트 NAS는 여러 물리 이유로 관심 장소로 공동 정화 할 수 있습니다 - 매우 기본적인 관심 장소가 아닌 특별히 풀다운 호스트 DNA / RNA 수 있으며, POI (예, 상기 HU) 일반 NA 바인딩 활동을 할 수 있습니다; POI는 호스트 RNAs 또는 DNAs있는 매우 특정 NA 결합 단백질 만 전시 교차 반응성 될 수 있으며,이 등등을하고, 호스트 NAS는 크로마토 그래피 행렬과 상호 작용함으로써 단순히 공동 elute 관심 장소로 할 수 있습니다. NA 불순물 가능성이 하류 실험 (예를 들어, POI • RNA 결합 (10)의 형광 이방성 assays)을 방해하기 때문에 관심 장소로 호스트 NAS의 무차별, 고친 화성 바인딩 애 태우게하는 문제를 야기 할 수 있습니다. 이러한 상호 작용은 POI의 핵산 결합 용량을 조명으로 또는 예기치 못한 POI는 · · · NA 협회는 또한 우연히 볼 수 있습니다. 어떤 방법을 사용하든, NAS 키 구성 요소 나 오염 물질이 있는지, 하나는 먼저 정량화해야합니다하류 실험에 대비 공동 정화 NAS의 유형을 (DNA, RNA) 확인합니다.

몇 가지 분석 방법은 감지하고 샘플에 NAS를 quantitating 존재합니다. 사용할 수있는 방법의 대부분은 (기본적으로 하나 (예를 들어, thiazole 오렌지 또는 NA에 다른 형광 염료의 결합) fluorometric (예를 들면, A 260 흡광도 값과 260 / A 280 비율) 분광, 또는 colorimetric 아르 화학 반응에 nucleosides의 민감도 전자기 스펙트럼의 UV-VIS 지역)에 흡수 항복 chromophores는 등 최근 드 현금 의해 설명되는 1. 그러나, RNA 또는 DNA로 폴리 뉴클레오타이드의 유형을 식별하는 중요한 단계는 다음과 quantitation의 많은의 범위를 벗어납니다 접근. 여기 빠르게 proteinaceous 샘플에서 NA 구성 요소의 유형을 식별하는 colorimetric assays의 집합을 제공합니다.

프로토콜은 여기 C를 설명이 효율적으로 잠재적 인 NA의 불순물을 분리의 추가 단계없이 실행, 그리고 (그림 1과 2) 2'-deoxypentoses의 설탕 11, pentoses 12,13의 orcinol 분석, 그리고 다이 페닐 아민 반응 14,15을 줄이기위한 베네딕트의 분석에 의존 할 수 . 베네딕트의 시험 (그림 2A)는 +, 설탕의 카르 보닐의 수반하는 산화와 같은 잘라 내기 2 O의 카르 복실 잔기 및 생산에 잘라 내기 2 감소 aldose 설탕의 선형, 오픈 체인 (알데히드) 폼의 능력을 활용 불용성 침전물 붉은 색. 이 반응은 aldoses 및 ketoses (이 enediol 중간체를 통해 해당 aldoses으로 변환) 무료로 감소 설탕 이랑 긍정적 인 테스트하지만, DNA 또는 RNA의 폴리 뉴클레오타이드의 공유 결합 백본의 일환으로 고리 형태로 고정되는 펜토 오스 설탕과. 것 무료 hemiacetal 기능의 최소한의 요구 사항, 다른 공동 때문따라서 잠재적 interferents의 역할 - -이 분석에 긍정적 인 테스트 할 수 mpounds은 α-히드 록시-ketones과 짧은 oligosaccharides (예를 들면 이당류의 말토오스)가 포함되어 있습니다. 두 Bial의 orcinol (그림 2B)와 Dische의 다이 페닐 아민 (그림 2C) 반응이 폴리 뉴클레오타이드 백본 초기 파괴에 의해 결정이되고, 뉴 클레오 사이드의 depurination 및 추가 산 또는 모 (母) 세포핵의베이스 촉매 가수 분해를 통해, 퓨란-2를 얻을 수 있도록 - carbaldehyde (푸르 푸랄 수치) 파생 상품, 이러한 파생 그런 다음 orcinol (Bial의) 또는 다이 페닐 아민 (Dische의) 대부분 알 수없는 화학 구조의 색 응축 제품을 구성하는 시약 등의 페놀 중 polyhydroxy으로 반응한다. Dische의 분석의 RNA의 특이성 대 DNA는 펜토 오스 설탕이 더 다이 페닐 아민과 반응 ω-hydroxylevulinyl 알데히드로 산화에 민감되기 위해 2'-deoxygenated해야하기 때문산성 조건 하에서 밝은 푸른 색 응축수 (그림 2C)를 얻을 수 있습니다. 여기에 설명 된 간소화 된 프로토콜을 사용하여, 우리는 이러한 설탕 특정 colorimetric 반응이 RNA와 DNA 구별 할 수 있으며, 또한 biomolecular 샘플에서 포도당, 과당, 또는 리보오스 무료로 감소 당분의 존재를 나타낼 것으로 나타났습니다.

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Protocol

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1. 슈 거즈를 감소시키기위한 베네딕트의 분석

  1. 940 MM 무수 탄산 소다, 588 MM 나트륨 구연산의 탈수, 68 MM 구리 (II) 황산염의 pentahydrate - 베네딕트의 시약의 적절한 수량을 준비합니다. 이 시약은 반응성에 더 눈에 띄는 변화 6 개월 이상 실온 (RT)에 저장할 수 있습니다.
  2. 위의 시약은 6x입니다. 샘플 assayed 할 당 따라서, 600 μl 반응에 대해, 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 (예를 들어, Eppendorf 브랜드)에 베네딕트의 시약 100 μl를 추가합니다.
  3. 10 μl에서 튜브에 샘플 500 μl에 아무 곳이나 추가, 최적의 볼륨이 초기 시운전에 색 형성의 강도에 따라 결정될 수있다. 충분한 샘플을 사용할 수 있다면 다음 assays에 희석 한 후 최대 가능한 샘플 볼륨 (즉, 전체 반응 양의 다섯 6 이죠,이 경우 샘플 500 μl)에서 이러한 실험을 시작합니다.
  4. 부엉에 ddH 2 O를 추가합니다vortexing 또는 pipetting하여 솔루션을 혼합 600 μl에 최종 볼륨을 가지고하는 것입니다.
  5. 끓는 물 목욕에 20 분의 샘플을 품다.
  6. 목욕탕에서 온수 샘플을 제거하고 10 분 동안 RT에서 냉각 할 수 있습니다.
  7. > 9300의 샘플 튜브를 원심 분리기 XG 위해 침전하는 미립자 물질을 5 분에 (FA45-24-11 Eppendorf 고정 각도 회전에 ~ 10,000 RPM)이 단계 양적보다는 질적 연구에 대한 더 중요합니다.
  8. 깨끗한 큐벳에이 관에서 나누어지는 표면에 뜨는합니다.
  9. 물과 UV-VIS 분광 광도계를 빈.
  10. 475 nm의에서이 샘플의 흡광도를 측정합니다.

2. 펜토 오스 슈 거즈에 Bial의 Orcinol 분석

  1. . 신선한 Bial의 시약의 적절한 수량 준비 - 24.2 MM orcinol 수화물 (이 화합물의 구조에 대한 그림 2B 참조), 6 M HCL, 0.025 % w / V 철 염화물 hexahydrate 참고 :확장 스토리지를 들어, Bial의 시약은 두 개의 별도의 가공 솔루션으로 준비 할 수 있습니다 :은 (i) 시약 [집중 HCL에 0.05 % w / v를 FeCl3 • 6H 2 O] 및 (ii) 시약 B [422 MM orcinol 수화물은 95에서 준비 %의 에탄올]. 시약는 6 개월 동안 RT에서 저장 될 수있다; 시약 B는 빛 노출을 제한 할 호일로 덮어 한 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 사용하기 전에 1 (B) 브이 / v 비율 :이 주식 솔루션은 15 (A)에 혼합되어 있습니다.
  2. 위의 시약은 2 배입니다. 샘플 assayed 할 당 따라서, 1.0 ML 반응에 대해, 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 Bial의 시약 500 μl를 추가합니다.
  3. 이 튜브에 10 μl의 샘플 500 μl에 아무 곳이나 추가 할 수 있습니다. 충분한 샘플을 사용할 수있는 경우 1.3에 따라 (위), 후 최대 가능한 샘플 볼륨을 (즉, 한 반 전체 반응 볼륨,이 경우 샘플 500 μl)를 사용하여 시험 반응을 시작하고 거기에서 희석.
  4. F를 가지고 관에 ddH 2 O를 추가합니다1.0 ML에 inal 볼륨, vortexing 또는 pipetting하여 솔루션을 섞는다.
  5. 끓는 물 목욕에 20 분의 샘플을 품다.
  6. 목욕탕에서 온수 샘플을 제거하고 10 분 동안 RT에서 냉각 할 수 있습니다.
  7. > 9300의 샘플 튜브를 원심 분리기 XG 위해 침전하는 미립자 물질을 5 분에 (FA45-24-11 Eppendorf 고정 각도 회전에 ~ 10,000 RPM)이 단계 양적보다는 질적 연구에 대한 더 중요합니다.
  8. 육안 검사를위한 깨끗한 큐벳에이 관에서 나누어지는 표면에 뜨는합니다.
  9. 반 정량 분석​​을 위해, 빈 UV-VIS 분광 광도계 물과 660 nm의에서 큐벳 샘플의 흡광도를 측정합니다.

3. 2'-deoxypentose 슈 거즈를위한 Dische의 다이 페닐 아민 분석

  1. 60 MM 다이 페닐 아민, 11 M 빙하 아세트산, 179 MM 황산 산, V / V 에탄올 62% - Dische의 다이 페닐 아민 시약의 적절한 수량을 준비합니다. 이 시약은 미리 할 수​​ 있습니다사전에 앞에 서와 어두운 용기에 RT에 저장하거나, 빛 노출을 제한하는, 포일가 있었다. 실제로는 반응성에 아무 변화 엔 두 3 개월 준비 할 수 있지만 빛 감도로 인해 시약은 무기한으로 저장하지 말아야합니다.
  2. 위의 시약은 2 배입니다. 샘플 assayed 할 당 따라서, 1.0 ML 반응에 대해, 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 Dische의 시약 500 μl를 추가합니다.
  3. 이 튜브에 10 μl의 샘플 500 μl에 아무 곳이나 추가 할 수 있습니다. 충분한 샘플을 사용할 수있는 경우 1.3에 따라 (위), 후 최대 가능한 샘플 볼륨을 (즉, 한 반 전체 반응 볼륨,이 경우 샘플 500 μl)를 사용하여 시험 반응을 시작하고 거기에서 희석.
  4. 1.0 ML에 최종 볼륨을 가지고 관에 ddH 2 O를 추가, vortexing 또는 pipetting하여 솔루션을 섞는다.
  5. 끓는 물 목욕에 20 분의 샘플을 품다.
  6. 욕조와여에서 온수 샘플을 제거10 분 동안 RT에서 냉각을 w
  7. > 9300의 샘플 튜브를 원심 분리기 XG 위해 침전하는 미립자 물질을 5 분에 (FA45-24-11 Eppendorf 고정 각도 회전에 ~ 10,000 RPM)이 단계 양적보다는 질적 연구에 대한 더 중요합니다.
  8. 육안 검사를위한 깨끗한 큐벳에이 관에서 나누어지는 표면에 뜨는합니다.
  9. 반 정량 분석​​을 위해, 빈 UV-VIS 분광 광도계 물과 600 nm의에서 큐벳 샘플의 흡광도를 측정합니다.

4. 또한 사용 정보

  1. 분자의 다음 수업은 각 시험에 대한 긍정적이고 부정적인 제어 반응에 적합한 참조 화합물은 다음과 같습니다
    • 베네딕트의 - 긍정적 = 무료 리보오스, 과당, 포도당, 부정적 = RNA, DNA, ATP 등. (무료 줄이고 설탕 기능을 부족한 어떤 saccharide)
    • Bial의 - 긍정적 = RNA (예 : 베이커의 효모 추출물), 리보오스, ATP, UMP, 음성 = 소 경음 ... 알부민 (BSA) 또는 다른 단백질
    • Dische의 - 긍정적 = DNA (예 : 송아지 thymus), 음성 = RNA, ATP 등. (비 2'-deoxygenated 염기)
  2. 이러한 NaCl, (NH 4) 2 SO 4, K 2 SO 4 간섭하지 않았어요과 같은 예를 들어, 일반적인 소금, 그리고 반응에 의해 일반적으로 영향을받지 표시되며, 이러한 assays는 종종 단백질 정제에 사용되는 화합물에 매우 탄력적 인 것으로 밝혀졌다 희석제의 내용. 산도가 높은 기본적인 경우 세제 나 요소와 같은 chaotropic 에이전트는 assays의 반응성에 영향을 미칠 수 있으며,이 산성 pH의 범위 중간 (텍스트와 양자를 볼 수 있기 때문에 기본 반응 화학 일반적으로 Bial의와 Dische의 assays에 가장 적합합니다 그림 2B, C)에 있습니다. 잠재적 차선 반응 조건, 의심 interferents 등. 긍정적이든 부정적 제어 실험 w를 사용하여 사안별로 테스트해야i 번째 참조 화합물.

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Representative Results

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결과는 알려진 참조 화합물에 이러한 colorimetric assays의 응용 프로그램에 대한 그림 3에 표시됩니다. 대표 질적 데이터는 베네딕트의 (A), Bial의 orcinol (B), 그리고 Dische의 다이 페닐 아민 (C) assays에 표시되며,이 세 assays에 대한 표준 곡선은 그림 4에 표시됩니다. 패널 3 (AC)에서, 왼쪽 패널은 적절히 반응 / unreactive analytes를 사용하여 부정적인 / 긍정적 인 제어 실험을 표시, 프로토콜 1-3 (위)에 설명 된대로 이러한 시각적 결과는 큐벳에 원위치에 표시됩니다. 하위 패널 권리는 각각의 analyte의 적정 시리즈를 보여줍니다. 부정적인 컨트롤 물, 일반적인 단백질 (0.75 MG / ML BSA)과 0.75 두 개의 비 감소 당분 (DNA 반면 베네딕트의 분석 (A)에서 긍정적 인 컨트롤, 리보오스 (0.42 MG / ML)입니다 MG / ML 와 RNA 12.5에서 MG / ML). orcinol 검정 (B)에서 긍정적 인 컨트롤, 리보오스 (0.15 MG / ML), RNA (7.5 MG / ML) 및 DNA (0.45 MG / ML)하는 동안 물과 BS단백질은 (0.45 MG / ML) 제외 컨트롤입니다. 다이 페닐 아민 분석에서 (C), 송아지 thymus DNA는 (0.45 MG / ML) 긍정적 인 제어로 표시되며, 물, 효모 추출물 RNA (7.5 MG / ML), 리보오스 (0.15 MG / ML) 및 BSA (0.45 밀리그램 / ML)는 부정적인 통제의 역할을합니다. DNA의 두 농도는 필름이 두 샘플에 긍정적 인 제어 (큐벳 1-2), DNA + RNA 혼합 (로 표시됩니다 : 마지막으로, 패널 (D)는 이질성을 변화의 샘플과 Dische의 반응을 보여 assays의 견고성을 보여줍니다 다양한 비율의)는 다음 세 샘플 (3-5)에 표시하고, 마지막 3 샘플은 핵산 결합 단백질 'Hfq'의 부재 (샘플 6) 또는 존재 (샘플 7-8)에서 DNA를 표시합니다. Dische의 분석의 긍정적 인 결과가 보존되는 16 참고 DNA 함유도 '오염'RNA 또는 단백질의 존재에 샘플을.

정량 분석 : 그림 3의 희석 범위 (AC) 패널은 다양 각각 때문에반응은 설탕이 assayed되는 유형에 따라 고유 한 시각적 감지 제한이 있습니다. 분광 아니라 시각보다 감지 측정 예로는 (a) 베네딕트의에 대한 그림 4에 표시된 범위, (B) Bial의, 및 (c) Dische의 assays를 개선하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 주로 질적 assays로 만들어진 것입니다하지만, 흡광도와 농도 사이의 맥주 램버트 관계는 설탕이나 핵산 내용의 적어도 반 정량 평가 할 수 있습니다. 베네딕트의 시험 보정을위한 표준 곡선의 예를 들어, 리보오스 농도에 대한 흡광도의 선형 회귀 적합 (475 nm 정도)는 그림 4 (A)에 표시되어, 오차 막대는 표준 = 3 복제 n의 편차, 그리고을 나타냅니다 제곱 상관 계수가 제공됩니다. 매우 낮은 리보오스 농도 (예 : 0.28 MM 기준면)에서 선형성의 편차는이 분석의 제한된 감도를 반영합니다. 것처럼라고는 주로 질적 연구를위한 다음과 같은 지침은 반 정량 분석​​에 제안합니다 :

  • 베네딕트의 분석 (그림 4A)의 경우 : 반응 판독은 (A 475nm) 이상의 범위를 0.04으로 선형이 발견 된 같은 세중의에서 수행 → 0.5 MG / ML의 analyte.
  • Bial의 분석 (그림 4B)의 경우 : 흡광도 데이터 (660nm) 이상의 범위를 0 이상 선형했다 → 0.5 MG / ML의 analyte (베이커의 효모 RNA)는 분석이 세중의 (R 2 = 0.99 선형 회귀에서 수행 된 것으로 계수). 샘플 흡광도 측정 전에 설명을 위해 centrifuged되었습니다 있지만, 더 침전제는 analyte의 낮은 농도에서 찾을 수 없습니다, 따라서 원심 분리 단계는 엄격하게 필요하지 않습니다였습니다. 검정은이 범위 이외의 analyte 농도에서 직선에서 성적 이상자.
  • 600nm : Dische의 분석 (그림 4C)의 경우 2 = 0.99)에서 수행 된 것으로 범위를 0.15 이상 선형으로 발견되었다. 흡광도의 줄거리 대 [analyte] 선형 응답 지역의 경계를 나타내는 0.90 MG / ML의 DNA에 고원 시작했다.
  • 양적 또는 반 정량 분석​​을위한 실용적인 고려 사항 : 기타 흡광도 판독을 방해 하는것 유발 물질을 제거하려면이 세 assays는 시간의 합리적 길이에 대한 최대 속도 (25,000 XG, 또는 어떤 제한 microfuge 튜브에 의해 버텨 될 수 있습니다)에서 원심 분리가 필요합니다 (예를 들어, 20 분)이 높은 analyte 농도에 특히 중요합니다. 원심 분리 후, 명확 샘플이 편리 흡광도 측정 (예를 들어, 96-잘 microtiter 플레이트) 큐벳 또는 microplate에게 양도 할 수 있습니다.

그림 1 1 그림. assays의 응용 프로그램에 대한 의사 결정 트리. 분자 (예를 들어, 전체 세포 lysates에서)의 잠재적 이기종 샘플로 시작하는 여기에 설명 된 colorimetric assays는 혼합물이 아닌 감소 설탕 (베네딕트의 시험)이 포함되어 있는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 그렇다면 Bial의 orcinol 테스트는 더 비 감소 당분의 인구가 펜토 오스 링 (DNA 또는 RNA에서와 같이), 대 hexoses (예, 포도당, 기타 pyranoses)와 가능성이 아직 다른 aldoses이 포함되어 있는지 보여줍니다. 샘플 DNA 적어도 중간 일부를 포함하는 경우 마지막으로, 다음 2'-deoxyribose 반지는 가시적 푸른 응축 제품을하였으며, Dische의 다이 페닐 아민 시약과 (산성화 및 난방시) 반응합니다. 이 다이어그램은 의사 결정 나무도 순서도입니다 참고 : 분석 결과의 논리는 S 표시됩니다erially하지만 assays은 병렬로 실행될 수 있습니다.

그림 2
그림 2. 근간이 화학 반응는 해당 반응과 함께 표시 감지 색 제품으로, colorimetric assays에 표시됩니다. () 잘라 내기 2 O의 불용성, 붉은 침전물은 설탕 감소시키기위한 베네딕트의 분석의 긍정적 인 결과입니다. (B) 난방 및 산성화되면, 펜토 오스 고리를 포함하는 당분은 수용성 푸른 녹색 adduct를 얻을 수 있도록 다음 orcinol과 반응 푸르 푸랄 수치 (Bial의 시약)로 분해됩니다. Dische의 분석, 2 '위치에 수산기 치환체의 부족은 링 - 오프닝 산화 반응, 더 다이 페닐 아민과 반응 중 알데히드 제품 수에 [(PH) 2 NH] 밝은 파란색 제품을 얻을합니다. 화학 세인트ructures는 orcinol (B)과 다이 페닐 아민 (C) 반응의 대형 멀티 링 응축 제품에 대한 알 수없는 남아있다.

그림 3
그림 3. 참조 화합물 및 이기종 샘플에 colorimetric assays의 응용 프로그램입니다. 샘플 결과는 베네딕트의 (), Bial의 (B), 그리고 Dische의 (C) colorimetric assays에 표시됩니다. (A) → (C)의 왼쪽 서브 패널은 각 analyte의 적정 시리즈를 보여 적절한 반응 / unreactive analytes 및 하위 패널의 오른쪽을 사용하여 긍정적 / 부정적 컨트롤을 보여줍니다. 핵산 - 관련 단백질의 존재에 하나 DNA가 혼자 (왼쪽), DNA / RNA 서로 다른 비율 (가운데)의 혼합물, 또는 DNA (- 또한 Dische 반응의 설명 패널 (D) analyte는 이질성에 따라 다릅니다 점입니다 표시 'Hfq'). 이 패널더 텍스트의 대표 결과 섹션에 설명되어 있습니다.

그림 4
4 그림. 참조 화합물과 assays에서 표준 곡선. 보정 곡선은 각 분석의 선형 응답 지역의 대표 부분을 묘사 (), Bial의 (B), 그리고 Dische의 (C) assays 베네딕트의에 표시됩니다. 선형 회귀 맞는 및 해당 상관 계수는 각 검정에 표시됩니다. 표준 베이커의 효모 RNA (B)와 송아지 thymus DNA (C)은 이러한 적정 시리즈 analytes 있었다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

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colorimetric assays는 빠른 속도 등 자세한 연구를위한 준비 단백질, RNAs 또는 전체 셀 lysate에서 복합체를 정화 할 때 발생하는 등 biomolecular 혼합물의 화학 특성을 평가하기 위해 간단한 방법을 제공합니다 여기에 제시했다. 구조 생물학 이러한 샘플 이질성으로 더 네이티브처럼 어셈블리, 점진적으로 더 큰 도전을 추구으로 복잡하고 다중 구성 요소 단지로 인한 것입니다. Supramolecular 어셈블리 주로 영특 안정적이며, 성공적인 고립는 (예를 들어, 같은 spliceosomal snRNP 단지 17,18를 찾을 수) 덜 엄격한 정화 조건을 요구 할 수 있습니다. 이러한 milder 조건에서 모두 정통과 가짜 POI · · · NA 상호 작용은 대상 단백질이나 핵산과 하류 assays에 계속함으로써 방해 할 가능성이 더욱 높아집니다. 필요한 첫 번째 단계는 이러한 샘플의 화학 구성 요소의 유형을 식별합니다.

RNA, DNA, 그리고 단백질을 감지 할 수 ve_content "> 방법이 가장 중요한 아마도, 수량 및 analytes, 사용 가능한 자원과 시간 제약의 농도에 따라와 달라, analytes의 가능성이 화학 성분에 대해 한의 사전 지식이 필요합니다. Proteinaceous 자료에 의해 감지 할 수 있습니다 spectroscopic되어있는 (A 280), 등 많은 잘 알려진 방법, 유체 역학적 (겔 전기 영동), 질량 분광법을 통해 훌륭한 감성과 정확성과 화학 / colorimetric 19 일 (예를 들어, 펩타이드 결합에 대한 biuret 테스트)와,. 마찬가지로, NAS (260) spectroscopic fluorometric, 또는 화학 assays (여기에 설명 된)에 의해 감지 할 수 있습니다. 방법의 각 유형의 특성 강점과 약점을 갖추고 있습니다. 예를 들어, PicoGreen, SYBR-골드, 그리고 cyanine 기반의 다른 형광 염료는에 매우 민감 핵산 (colorimetric assays없는 크기의 많은 주문), (예를 들어, 그림 선택성의 다양한 학위를 전시oGreen는 두 번 좌초 DNA를 들어, SYBR - 골드는 대부분의 NAS) 바인딩 있으며, quantitation 목적으로 폭 넓은 동적 범위를 제공합니다. 염료는 ethidium 브로마이드과 유사한 mutagens으로 처리되며, 염료가 검출 (일괄 샘플 젤, spectrofluorometers에 대한 transilluminators)에 대한 더 많은 고급 장비를 필요로 대 colorimetric assays의 간단한 시각적 표시 장치 및이 : 그러나, 이러한 접근법은 제한없이 수 없습니다 검정 조건에 제한 (;> 200 MM NaCl의 PicoGreen 신호 강도의 30 % 감면 예를 들어, SYBR-골드에 대한 7-8.5의 권장 산도 범위)입니다. 따라서, colorimetric 및 형광 기반 assays는 보완 : 핵산 염료는 빠른 colorimetric assays와 부정적인 결과의 경우, 또는 좀 더 신중을하는 방법 (양적) colorimetric assays의 초기 결과에 확장으로 특히 유용 할 수 있습니다. colorimetric NA 프로토콜의 기본적인 장점은, 사용의 단순함에 추가, 그들은 오직 본질적인 공동에 의존 것입니다자치 NAS의 구조보다는 fold/3D 구조, reactivities, 또는 순서에 따라 달라질 수있는 생체 고분자의 다른 속성보다.

프로토콜은 반응 제품의 간단한 육안 검사를 수행 특히 때, 대부분의 문제에 대한 강력한 아르 여기에 설명 된, 특별한주의가 더 정량 (분광) 분석을 위해 이동해야합니다. 예를 들어, 베네딕트의 분석에 리보오스의 높은 농도의 면전에서 형성 붉은 침전제는 (PPT) 이전 분광 분석에 제거해야합니다,이 방법은 쉽게 원심 분리를 통해 달성된다. Dische의 분석 내용은 다이 페닐 아민 시약의 추가는 가열에 의해 solubilized 수있는 흰색 PPT 형성이 동반되며 DNA의 존재의 양식 분광 측정에 영향을 줄 수 있습니다 사전 정량 분석​​에 제거해야하는 녹색 PPT. 또한, 각 분석은 민감한 화학 반응을 기반으로합니다잠재적 interferents까지로 소개에서 언급하고 아래에서 더 자세한. 마지막으로, 우리는 DNA / RNA 혼합물 RNA의 높은 상대 농도가 Dische의 분석의 예상 긍정적 인 결과를 마스크 할 수 있습니다, DNA이 허위 제외는 RNA의 높은 몰분율도 반응하기 때문, 푸르 푸랄 수치의 중간체를 통해, Dische의 시약과 함께하지만, 오히려 DNA의 2'-deoxypentose 설탕 반응에 의해 생성 된 푸른 adduct보다 무색 제품을 산출.

잠재적 Interferents : 설탕, 지질 및 단백질의 명백한 경우 넘어서은 가정 교차 반응성 (탐지) 또는 가면 반응성 (거짓 제외)로 인해 이러한 colorimetric assays에 문제가 발생할 수 있습니다 두 개의 다른 분자 있습니다. 원칙적으로, 세포 지질 여러 종류의 이대로 설탕에 복합 glycosylglycerols 및 기타 glycerolipids, glycosphingolipids (예를 들면, cere 포함 영향을 줄 수 있습니다brosides), 등등 saccharolipids (예를 들어, 글루코사민 유도체), lipopolysaccharides합니다. 사람들이 상대적으로 드문, 대 훨씬 더 풍부한 phospholipids, 따라서 우리의 assays의 검출 한계 이하로하기 때문에 실제로, 지질의 이러한 클래스는 lipophilic 단백질과 협력에 문제를 일으킬 가능성이 있습니다. 앞서 언급 한 세포 지질의 대부분은 오히려 pentoses보다 hexoses (갈락토오스, 포도당)에 내장되어 있기 때문에, 그들은 Bial의 또는 Dische의 assays에 허위 - 탐지로 방해해서는 안됩니다. 잘못된 - 탐지를 제공 할 수 있습니다 무료 단당류는 과당, galactofuranose 또는 기타 furanoses이 포함되어 있습니다. 관련 메모에서 원치 않는 당분의 간섭 말토오스 결합 단백질 (MBP) 태그로 표시 재조합 단백질에 대한 문제가 될 수 있습니다. 친 화성 크로마토 그래피에서는 이러한 융합 구조를 정화하는 데 사용되는 단계를, 말토오스는 단백질을 elute하는 데 사용됩니다, 그것은 하류 준비에 잔류 말토오스는 일을 방해 할 수 있다는 생각할 수 있습니다전자 베네딕트의 분석 (이것은 assays의 가장 일반적인 / 특이 현상이 아닙니다, 말토오스의 포도당 단위 Bial의 또는 Dische의에서 반응하지 않아야 함). 따라서, 하나는 잔여 말토오스는 가짜 결과를 얻을하지 않은 확보 후 크로마토 그래피 단계에서주의해야합니다. 우리가 glycan moieties, 기대 때문에 glucosylated 단백질이나 다른 glycoproteins을 테스트하지 않은,하지만 우리는 이러한 단백질 (또는 glycolipid, proteoglycan, 또는 기타 glycoconjugates)에 설탕의 존재에 대한 명확한 긍정적 인 결과를 얻을하기 어려울 것이라고 의심 우리 assays의 감도 제한 아래 누워. 원칙적으로, 이러한 포도당과 같은 무료 aldohexose를 포함하는 솔루션, 산 가수 분해를 통해 glucosylated 단백질을 해방 베네딕트의 분석에 의해 긍정적 인 테스트입니다; 마찬가지로, 크실 로스 등의 당 단백질 - 파생 펜토 오스는 Bial의에 긍정적 인 결과를 얻을해야합니다 검정. 그러나, 연습에 glycoproteins에 대한 긍정적 인 결과는 매우 H 요구 때문에 낮은 설탕 / 단백질 몰 비율의도 곱 glycosylated polypeptides을위한 고등학교 단백질 농도,.

여기에 설명 된 분석 프로토콜은 확장과 작은 샘플 크기의 한계에 처리하도록 구성 할 수 있습니다 - 예를 들면, 작은 볼륨이나 analytes의 낮은 농도를. 제한된 샘플 수량의 경우 우리는 반응이 (예를 들어, PCR 튜브 및 인큐베이션 단계 thermocycler를 사용하여) 100 μl 범위를 줄일 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 낮은 농도 (검출 한계 근처)에서 작은 볼륨 샘플에 대한 판 리더가 장착 된 분광 광도계를 사용할 수 있습니다, 이러한 시나리오에서, 유일한 예상 어려움은 사전 흡광도 측정에 원치 않는 침전제의 제거 것입니다. 간단한 육안 검사의 제한된 검색 범위에도 불구하고, 여기에 설명 된 접근 방식의 이점은 난방시 즉시 분석 될 수있는 샘플, 그 효율성과 급속입니다.

"프로토콜> 응용 프로그램 현재 공동 정화 화합물, RNA 또는 DNA의 순도 평가 및 잔류 NA 또는 단백질 샘플에 설탕 오염의 검출의 확인을 포함 발표했다. 예를 들어, assays에 의해 감지 원치 않는 NA에서 제거 할 수 있습니다 이러한 응용 프로그램에 대한 대체 방법이 있지만 화학 수단 (RNA의 예를 들어, 알칼리 가수 분해) 또는 효소 소화 (예를 들어, nuclease 처리)를 통해 단백질 시험을 치루는. 여기에 설명 된 방법은 시간과 비용 모두의 측면에서 매우 효율적이며, 수 따라서 쉽게 실험 워크 플로우에 통합합니다. 무료로 감소 설탕, RNA, DNA, 또는 단백질과 같은 공동 정화 화합물의 초기 식별는 하류 정화 단계의 설계, 대 힘든 시행 착오 연구를 안내 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜에 따라 일반적인 단계는 thiocyanate-페놀 - 클로로포름 추출, 또는 DNA 아론의 복구를 통해 DNA와 단백질의 RNA의 분리 될 수E (thiocyanate를 제외하여). 20 페놀 - 클로로포름 extractions으로 인한 NAS의 순도를 평가하기는이 colorimetric assays는 전기 또는 DNase 처리에 대한 간단한 대안으로 사용할 수 있습니다. 이것과 다른 방법으로 여기에 설명 된 colorimetric assays는 단백질과 이기종 biomolecular 샘플에서 RNA, DNA, 그리고 단백질 구성 요소를 elucidating위한 신속하고 강력한 시스템을 달성하기 위해 NA 결정을위한 잘 알려진 방법으로 결합 될 수있다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 버지니아 대학과 Jeffress 기념 트러스트 (J-971)에 의해 재정 지원되었다. 우리는 도움이 토론과 원고의 중요한 읽기 L. 콜럼버스, K. 제인, 그리고 P. 랜돌프 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anhydrous sodium carbonate Fisher Scientific S263
Sodium citrate dihydrate Sigma S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate VWR VW3312-2
Orcinol monohydrate Sigma-Aldrich O1875
Concentrated HCl VWR BDH3030
Ferric chloride hexahydrate Sigma F-2877
Diphenylamine Aldrich 112763
Glacial acetic acid Fisher Scientific A28
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Ethanol Koptec V1101
Ribose Sigma R-7500 prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker's yeast (S. cerevisiae) Sigma R6750 prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus Sigma D1501 prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C

Reagents, Equipment & Safety

Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.

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References

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신속한 Colorimetric Assays는 질적 Biomolecular 샘플에서 RNA와 DNA를 구별 할
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Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).More

Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).

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