Summary

Быстрое колориметрических тестов на качественно Различают РНК и ДНК в биомолекулярных образцов

Published: February 04, 2013
doi:

Summary

Набор колориметрических тестов описан быстро отличительной белков, РНК, ДНК, и вновь ducing сахара в потенциально гетерогенных образцов биомолекул.

Abstract

Биохимические эксперименты как правило, требует точного знания, на ранней стадии, в состав нуклеиновых кислот, белков и других компонентов биомолекулярной в потенциально гетерогенных образцов. Нуклеиновые кислоты могут быть обнаружены через несколько устоявшиеся подходы, включая аналитические методы, которые спектрофотометрического (например, 260), флуорометрической (например, связывания флуоресцентных красителей), или колориметрическим (нуклеозид конкретных хромогенных химических реакций). 1 Хотя это не легко отличить РНК от ДНК, 260 / A 280 отношение обычно используется, так как она предлагает простой и быстрый 2 Оценка относительного содержания нуклеиновых кислот, которые поглощают преимущественно вблизи 260 нм и протеина, который поглощает в основном вблизи 280 нм. Коэффициенты <0,8 принимаются как показатель «чистые» образцы белка, в то время как чистая нуклеиновой кислоты (NA) характеризуется отношение> 1,5 3.

HoWever, существуют сценарии, в которых белок / NA содержание не может быть столь же четко и надежно вывести из простого UV-VIS спектрофотометрического измерения. Например, (я) образцы могут содержать один или несколько белков, которые являются относительно лишенной ароматические аминокислоты отвечают за поглощение при ≈ 280 нм (Trp, Tyr, Phe), как и в случае с некоторыми малыми РНК-связывающие белки, и (II), образцы могут проявлять промежуточные A 260 / A 280 соотношения (~ 0.8 <~ 1.5), где белок / NA содержание гораздо менее ясен и даже может отражать некоторые высоким сродством связь между белком и Н. А. компонентов. Для такого сценария, мы опишем здесь набор колориметрические анализы быстро отличать РНК, ДНК, и снижение сахара в потенциально смешанного образца биомолекул. Методы опираются на различную чувствительность пентоз и других углеводов, чтобы Бенедикта, Bial (в орцинола), и Дише (в дифениламина) реагентов; обтекаемой протоколов может быть комзавершена в течение нескольких минут, без каких-либо дополнительных шагов от того, чтобы изолировать компоненты. Анализы могут выполняться параллельно проводить различие между ДНК и РНК, а также указывают на наличие свободных редуцирующих сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, рибоза и (рис. 1).

Introduction

Большая часть клеточной биологии происходит через молекулярные взаимодействия с участием ДНК и РНК. 4 Эти естественные нуклеиновых кислот (НО) взаимодействуют друг с другом, 5 с белками, 6 и с множеством малых молекул соединений и лигандов в естественных условиях (например, двухвалентных катионов 7). Взаимодействия могут быть кратко-или долгосрочных (кинетически), могут варьироваться от умеренных до высоких к низким сродством (термодинамические силы), а также может обладать существенным изменением химических свойств и специфики – некоторые ассоциации являются достаточно специфическими (например, ДНК · · факторы транскрипции, РНК · · · факторы сплайсинга), в то время как другие взаимодействия обязательно являются гораздо более общие (например, ДНК · · · бактериальный гистона-подобных белков HU 8). Non-специфическими взаимодействиями с НСБУ может иметь практические последствия для лабораторного эксперимента с участием смесей biomolecules, как это возможно, и даже вероятно, что некоторые ВПЛ будут ассоциировать с биомолекул интерес, по крайней мере в некоторое подмножество экспериментальных условиях используются (ионной силы, рН раствора и т.д.).

Рассмотрим, например, производство белка интереса (POI) через гетерологичных чрезмерной экспрессии рекомбинантных белков в Escherichia культуре клеток кишечной; такая процедура обычно выполняется практически в любой лаборатории структурной биологии 9 В подготовкой для дальнейших экспериментов, например. как биохимическая / биофизических характеристик, кристаллизация, и т.д.., первоначальные усилия правило, сосредоточены на получении достаточного количества POI в качестве чистой, по возможности, идеально, как химически однородной и биофизически монодисперсных образцов. После разрушения клеток-хозяев, на ранних стадиях типичный рабочий процесс очистки стремиться изолировать POI из E. палочки белков, нуклеиновых кислот, мусор клеточной стенки,и другие компоненты клеточных лизатов. Тем не менее, хозяин NAS может совместно очищают с POI в течение нескольких физико-химических причин – очень основной POI могут неспецифически выпадающего хозяин ДНК / РНК; POI могут иметь общие NA-связывающей активности (например, вышеупомянутый HU); POI может быть достаточно конкретным NA-связывающего белка, но экспонат перекрестной реактивности с принимающей РНК или ДНК, принимающих NAS может взаимодействовать с матрицей хроматографии и тем самым просто совместно элюируются с POI, и так далее. Неизбирательное, высокое сродство связывания хозяин NAs к POI могут представлять неприятная проблема, потому что НС примесей, скорее всего, мешают вниз по течению экспериментов (например, анализы флуоресценции анизотропии POI • связывание РНК 10). Кроме того, непредвиденные POI · · · НС ассоциации также могут быть просмотрены случайно, так как такое взаимодействие освещения нуклеиновой кислоты связывающей способности POI автора. В любом случае, независимо от того НАН Украины являются ключевыми компонентами или загрязняющих веществ, нужно сначала количественно иопределить тип (ДНК, РНК) совместной очистки НАН Украины в подготовке к вниз по течению экспериментов.

Некоторые аналитические методы для обнаружения и количественного НАН Украины в образце. Большинство из доступных методов принципиально либо спектрофотометрический (например, A 260 значения абсорбции и 260 / A 280 коэффициентов), флуорометрической (например, связывание тиазола оранжевого или других флуоресцентных красителей НС), или колориметрическим (восприимчивость нуклеозидов в химических реакциях что выход хромофоров поглощающие в УФ-VIS области электромагнитного спектра), а недавно описаны де Мей и др. 1. Тем не менее, важным шагом в определении типа полинуклеотид как РНК или ДНК, выходят за рамки многих из этих количественного подходы. Здесь мы предлагаем набор колориметрических тестов для быстрого выявления типов компонентов НС в белковой образца.

Протоколов, описанных здесь сбыть эффективно выполнены без дополнительных мер изоляции потенциальных примесей NA, и полагаться на анализ Бенедикта для снижения сахара 11, орцинола анализа для пентоз 12,13 и 14,15 реакции дифениламина 2'-deoxypentoses (рис. 1 и 2) . Тест Бенедикт (рис. 2а) использует способность линейной, открытой цепью (альдегид) форма альдозы сахара снизить Cu 2 +, с сопутствующей окисление карбонильных сахара в карбоксилат фрагмент и производства Cu 2 O в качестве нерастворимого красного осадка. Эта реакция будет положительной реакцией с бесплатным снижения сахара, такие как альдоз и кетоз (которые преобразуют в соответствующие альдоз через enediol промежуточные продукты), но не с пентозы сахара, которые зафиксированы в циклической форме, как часть ковалентной основу ДНК или РНК полинуклеотида. В связи с минималистичным требование свободного полуацеталь функциональность, другие сотрудничествеmpounds, которые могли бы положительный результат в этом тесте – и, следовательно, выступать в качестве потенциальных мешающих – включают α-гидрокси-кетоны и коротких олигосахаридов (например, дисахарид мальтозу). И Bial в орцинола (рис. 2б) и Дише в дифениламина (рис. 2, в) реакции основаны на начальном разрушение полинуклеотида позвоночника, через депуринизации нуклеозида и дальнейшего кислоты или основания катализируемого гидролиза родителей нуклеотида, с получением фуран-2 -карбальдегида (фурфурол) производные; эти производные затем реагировать либо с полигидрокси фенола, такие как орцинола (Bial) или дифениламина (Дише автора) реагентами с образованием окрашенных продуктов конденсации в значительной степени неизвестной химической структуры. ДНК по сравнению с РНК специфика анализа Дише проистекает из того факта, что пентозы сахара должно быть 2'-венозная для того, чтобы быть восприимчивым к окислению ω-hydroxylevulinyl альдегид, который далее реагирует с дифениламинав кислых условиях с получением ярко-синий конденсата (рис. 2). Использование обтекаемой протоколов, описанных здесь, мы обнаружили, что эти сахара конкретных колориметрических реакций могут дифференцироваться между РНК и ДНК, а также будет свидетельствовать о наличии свободных редуцирующих сахаров, таких как глюкоза, фруктоза, рибоза или в молекулярно-биологических образцов.

Protocol

1. Бенедикт анализа для редуцирующих сахаров Подготовить соответствующее количество реагентов Бенедикта – 940 мм безводного карбоната натрия, 588 мМ цитрат натрия дигидрат, 68 мм меди (II) сульфата пентагидрата. Этот реагент можно хранить при комнатной температуре (RT) в течение по край?…

Representative Results

Результаты представлены на рисунке 3 для применения этих колориметрических тестов с известными соединениями ссылки. Представитель качественные данные приведены для (а), Бенедикт Bial в орцинола (б) и Дише в дифениламина (C) анализы, и стандартные кривые для этих трех анализов пок?…

Discussion

Колориметрических тестов, представленные здесь предлагают простой подход к быстрой оценки химической природы биомолекулярных смесей, таких как встречаются при очистке белков, РНК или комплексы из цельного клеточный лизат в подготовке для дальнейших исследований. Как структурной…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась в университете Вирджинии и Джеффресс Memorial Trust (J-971). Мы благодарим Л. Columbus, K. Jain, П. Randolph за полезные обсуждения и критического чтения рукописи.

Materials

Reagent or equipment Supplier/company Catalog number Comments, notes
Anhydrous sodium carbonate Fisher Scientific S263  
Sodium citrate dihydrate Sigma S-4641  
Copper (II) sulfate pentahydrate VWR VW3312-2  
Orcinol monohydrate Sigma-Aldrich O1875  
Concentrated HCl VWR BDH3030  
Ferric chloride hexahydrate Sigma F-2877  
Diphenylamine Aldrich 112763  
Glacial acetic acid Fisher Scientific A28  
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105  
Ethanol Koptec V1101  
Ribose Sigma R-7500 prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker’s yeast (S. cerevisiae) Sigma R6750 prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus Sigma D1501 prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C
     

Reagents, Equipment & Safety

Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.

References

  1. De Mey, M., et al. Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms. Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).
  2. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
  3. Ausubel, F. M. . Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology. , (1999).
  4. Voet, D., Voet, J. G. . Biochemistry. , (2011).
  5. Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. . The Biochemistry of the Nucleic Acids. , (1986).
  6. Rice, P. A., Correll, C. C. . Protein-nucleic acid interactions: Structural biology. , (2008).
  7. Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis. Curr. Opin. Struct. Biol. , (2012).
  8. Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids. J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).
  9. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).
  10. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
  11. Benedict, S. R. A reagent for the detection of reducing sugars. J. Biol. Chem. 277, e5 (1908).
  12. Endo, Y. A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism. J. Biochem. 67, 629-633 (1970).
  13. Almog, R., Shirey, T. L. A modified orcinol test for the specific determination of RNA. Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).
  14. Dische, Z. New color reactions for determination of sugars in polysaccharides. Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).
  15. Burton, K. A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid. Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).
  16. Vogel, J., Luisi, B. F. Hfq and its constellation of RNA. Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).
  17. Deckert, J., et al. Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions. Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).
  18. Stevens, S. W., et al. Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP. Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).
  19. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (Pt. 2), 99-108 (1999).
  20. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).

Play Video

Cite This Article
Patterson, J., Mura, C. Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples. J. Vis. Exp. (72), e50225, doi:10.3791/50225 (2013).

View Video