Snabba kolorimetriska analyser att kvalitativt Skilj RNA och DNA mot biomolekylär Prover

Summary

En svit av kolorimetriska analyser beskrivs för att snabbt skilja protein, RNA, DNA, och åter-rande socker i potentiellt heterogena biomolekylära prover.

Abstract

Biokemisk experiment kräver i allmänhet exakt kunskap, på ett tidigt stadium, av nukleinsyran, protein och andra komponenter biomolekylära i potentiellt heterogena prover. Nukleinsyror kan detekteras genom flera etablerade metoder, inkluderande analytiska metoder som är spektrofotometrisk (t.ex. A _260), fluorometrisk (t.ex. bindning av fluorescerande färgämnen), eller kolorimetriska (nukleosid-specifika kromogena kemiska reaktioner). ¹ Även om det inte kan lätt skilja RNA från DNA, A ₂₆₀ / A ₂₈₀ förhållande används vanligen, eftersom den erbjuder ett enkelt och snabbt ² bedömning av den relativa halten av nukleinsyra, som absorberar övervägande nära 260 nm och protein, som absorberar huvudsakligen nära 280 nm. Förhållanden <0,8 tas som indikation på "rena" protein prover, medan ren nukleinsyra (NA) kännetecknas av förhållanden> 1,5 ^3.

HoWever finns scenarier där protein / NA innehåll inte kan vara lika tydligt eller tillförlitligt härledas från enkla UV-Vis spektrofotometriska mätningar. Till exempel, (i) Prover kan innehålla ett eller flera proteiner som är relativt saknar de aromatiska aminosyrorna ansvarar för absorption vid ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe), såsom är fallet med några små RNA-bindande proteiner, och (ii) prov kan uppvisa mellanliggande A ₂₆₀ / A ₂₈₀ nyckeltal (~ 0,8 <~ 1,5), där proteinet / NA innehåll är långt mindre klart och kan även spegla en viss hög affinitet association mellan protein och NA-komponenter. För sådana scenarier beskriver vi här en rad kolorimetriska analyser att snabbt skilja RNA, DNA och reducerande sockerarter i en potentiellt blandat urval av biomolekyler. Metoderna är beroende av differentiella känslighet pentoser och andra kolhydrater till Benedictus, Bial s (orcinol) och Dische s (difenylamin) reagenser, de strömlinjeformade protokollen kan jämförasslutfördes under några minuter, utan några ytterligare steg för att behöva isolera komponenterna. Analyserna kan utföras parallellt för att skilja mellan RNA och DNA, samt indikera närvaron av fria reducerande sockerarter såsom glukos, fruktos, och ribos (Figur 1).

Introduction

Mycket av cellbiologi sker via molekylära interaktioner mellan DNA och RNA. ⁴ Dessa naturligt förekommande nukleinsyror (NAS) samverkar med varandra, ⁵ med proteiner, ⁶ och med en mängd små molekylföreningar och ligander in vivo (t.ex., tvåvärda katjoner ^7). De interaktioner kan vara kort-eller långlivat (kinetiskt) kan variera från hög till måttlig till låg affinitet (termodynamisk styrka), och kan också uppvisa betydande variation i kemiska egenskaper och specificitet – vissa sammanslutningar är ganska specifika (t.ex. DNA · · · transkriptionsfaktorer, RNA · · · skarvning faktorer), medan andra interaktioner med nödvändighet mycket mer generisk (t.ex. DNA · · · bakteriella histon-liknande HU proteiner ^8). Icke-specifika interaktioner med Nas kan få praktiska konsekvenser för in vitro försök med blandningar av biomolecules, eftersom det är möjligt, och med troligt, att vissa nationella programkontoren kommer att associera med biomolekylerna av intresse, åtminstone under någon del av de experimentella betingelser som används (jonstyrka, pH, osv).

Tänk till exempel produktion av ett protein av intresse (POI) genom heterolog överuttryck av det rekombinanta proteinet i Escherichia coli cellodling, ett sådant förfarande rutinmässigt i praktiskt taget alla strukturbiologi labb ⁹ I förberedelserna för ytterligare experiment, så. som biokemisk / biofysikalisk karaktärisering, kristallisering osv., inledande insatser generellt inriktas på att få en tillräcklig mängd av POI i så ren form som möjligt, helst som en kemiskt homogen och biofysiskt monodispersa exemplar. Efter avbrott av värdceller, de tidiga stadierna av en typisk rening arbetsflöde syftar till att isolera POI från E. coli-proteiner, nukleinsyror, cellvägg skräp,och andra komponenter i det cellulära lysatet. Dock kan värd nationella programkontoren tillsammans rena med POI flera fysikalisk-kemiska skäl – en mycket grundläggande POI kan ospecifikt rullgardinsmenyn värd DNA / RNA, POI kan ha en allmän NA-bindande aktivitet (t.ex. den tidigare nämnda HU); intressepunkten kan vara en ganska specifik NA-bindande protein men uppvisar korsreaktivitet med värd RNA eller DNA, värd nationella programkontoren kan interagera med en kromatografimatris och därigenom enkelt sam-eluera med intressepunkten, och så vidare. Godtycklig, högaffinitetsbindning av värd NAS till en IP kan utgöra ett förargliga problem eftersom NA föroreningar sannolikt störa nedströms experiment (t.ex. fluorescensanisotropi analyser av POI • RNA-bindning ^10). Alternativt · oväntad POI · · NA föreningar också kan ses slump, eftersom sådana interaktioner belyser POI nukleinsyrabindande kapacitet. Hursomhelst, om nationella programkontoren är viktiga komponenter eller föroreningar, måste en kvantifiera först ochidentifiera typen (DNA, RNA) i sam-renande nationella programkontoren inför nedströms experiment.

Flera analytiska metoder finns för att detektera och kvantifiera nas i ett prov. De flesta av de tillgängliga metoderna är i grunden antingen spektrofotometrisk (t.ex. en ₂₆₀ absorbansvärden och A ₂₆₀ / A ₂₈₀ nyckeltal), fluorometrisk (t.ex. bindning av tiazolorange eller andra fluorescerande färgämnen Na) eller kolorimetrisk (mottaglighet nukleosider till kemiska reaktioner att avkastningen kromoforer absorberar i UV-VIS området av det elektromagnetiska spektrumet), såsom nyligen beskrivits av De Mey et al. ¹ är emellertid avgörande steget att identifiera den typ av polynukleotid som RNA eller DNA utanför ramen för många av dessa kvantifiering tillvägagångssätt. Här erbjuder vi en uppsättning kolorimetriska analyser för att snabbt identifiera vilka typer av NA komponenter i en proteinhaltig prov.

Protokollen som beskrivs här cen effektivt utföras utan ytterligare steg att isolera de potentiella föroreningarna NA, och förlita sig på Benedictus analys för reducerande sockerarter ^11, den orcinol analys för pentoser ^12,13, och difenylamin reaktioner ^14,15 av 2'-deoxypentoses (figurerna 1 och 2) . Benedict test (figur 2a) utnyttjar förmågan hos linjära, öppen kedja (aldehyd) formen av en aldos socker för att minska Cu ^{2 +,} med samtidig oxidation av sockrets karbonyl till en karboxylat-grupp och produktion av Cu ₂ O som en olöslig röd fällning. Denna reaktion kommer att testa positivt med fria reducerande sockerarter såsom aldoser och ketoser (som omvandlas till motsvarande aldoser via endiol intermediärer), men inte med pentos socker som är låsta i cyklisk form som en del av den kovalenta ryggraden i en DNA-eller RNA-polynukleotid. På grund av den minimalistiska kravet på en fri hemiacetal funktionalitet, andra compounds som kan testa positivt i denna analys – och därmed fungera som potentiella störande – inkluderar α-hydroxi-ketoner och korta oligosackarider (t.ex. disackarid maltos). Både Bial s orcinol (figur 2b) och Dische s difenylamin (Figur 2c) reaktioner baserat på initial förstörelse av polynukleotiden ryggraden via depurinering av nukleosiden och ytterligare syra-eller bas-katalyserad hydrolys av de överordnade nukleotider, för att ge furan-2 -karbaldehyd (furfural) derivat, dessa derivat reagerar sedan med antingen en polyhydroxi fenol, såsom orcinol (Bial s) eller difenylamin (Dische s) reagens för att bilda färgade kondensationsprodukter av i stort sett okända kemiska struktur. DNA: t mot RNA-specificiteten hos Dische s analysen beror på det faktum att den pentossockret måste vara 2'-deoxiderad för att vara mottagliga för oxidation till ω-hydroxylevulinyl aldehyd, som reagerar vidare med difenylaminunder sura betingelser för att ge en klarblå kondensat (figur 2c). Använda strömlinjeformade protokollen här har vi funnit att dessa socker-specifika kolorimetriska reaktioner kan skilja mellan RNA och DNA, och kommer också att visa på närvaron av fria reducerande socker, såsom glukos, fruktos, eller ribos i ett biomolekylär prov.

Protocol

1. Benedictus Analys för reducerande socker Förbered en lämplig mängd Benedicts reagens – 940 mm vattenfritt natriumkarbonat, 588 mM natriumcitrat torkar, 68 mM koppar (II) sulfat pentahydrat. Denna reagens kan förvaras vid rumstemperatur (RT) under minst sex månader med ingen märkbar förändring i reaktivitet. Ovanstående reagenset är 6x. Sålunda, för 600 pl reaktioner, tillsätt 100 pl Benedicts reagens till en ren 1,5 ml mikrocentrifugrör (t.ex. Eppendorf varumärke) per pro…

Representative Results

Resultat visas i figur 3 för applicering av dessa kolorimetriska analyser med kända referensföreningar. Representativa kvalitativa data visas för Benedicts (a), Bial s orcinol (b), och Dische s Difenylamin (c) analyser, och standardkurvor för dessa tre analyser visas i figur 4. I paneler 3 (ac), de vänstra fälten visar positiva / negativa kontrollexperiment med användning lämpligen reaktiva / oreaktiva analyter, dessa visuella resultat visas in situ, i kyvetterna som b…

Discussion

De kolorimetriska analyser som presenteras här erbjuder en enkel metod för att snabbt utvärdera den kemiska naturen av biomolekylära blandningar, såsom påträffas vid rening av proteiner, RNA eller komplex från hel-cellysat som förberedelse för vidare studier. Som strukturbiologi bedriver fler infödda-liknande församlingar, progressivt större utmaningar, såsom prov heterogenitet, kommer orsakas av de invecklade och flera komponenter komplex. Supramolekylära församlingar ofta endast marginellt stabil…

Materials

Reagent or equipment	Supplier/company	Catalog number	Comments, notes
Anhydrous sodium carbonate	Fisher Scientific	S263
Sodium citrate dihydrate	Sigma	S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate	VWR	VW3312-2
Orcinol monohydrate	Sigma-Aldrich	O1875
Concentrated HCl	VWR	BDH3030
Ferric chloride hexahydrate	Sigma	F-2877
Diphenylamine	Aldrich	112763
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A28
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Ethanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker’s yeast (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus	Sigma	D1501	prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C
			Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.