אנו מתארים כאן את ההליכים למיצוי והטיהור של mRNA ומטבוליטים מ<em> דרוזופילה</em> ראשים. אנו מיישמים שיטות אלה כדי להבין טובים יותר את ההפרעות הסלולריות שבבסיס ניוון עצבי. מתודולוגיות אלה וניתן לשנות בקלות ומותאמת לפרויקטים אחרים "omic".
בעשור האחרון, יש לנו ניסינו להבין את המנגנונים המולקולריים ותאיים של ניוון עצבי באמצעות תסיסנית כאורגניזם מודל. למרות זבובי פרות מספקים יתרונות ברורים ניסיוניים, מחקר על מחלות ניווניות הסתמך בעיקר על טכניקות מסורתיות, כולל אינטראקציה גנטית, היסטולוגיה, immunofluorescence, וביוכימיה חלבון. טכניקות אלה יעילות למכניסטית, מחקרי השערת מונחה, שיובילו להבנה מפורטת של התפקיד של גנים בודדים בבעיות ביולוגיות מוגדרות היטב. עם זאת, מחלות ניווניות הן מורכבות ביותר ולהשפיע האברונים מרובים סלולריים ותהליכים לאורך זמן. כניסתו של טכנולוגיות חדשות וגיל omics מספקת הזדמנות ייחודית להבין את ההפרעות הסלולריות הגלובליות שבבסיס מחלות מורכבות. אורגניזמים מודל גמישים כגון דרוזופילה הם אידיאליים עבור התאמת טכנולוגיות חדשות אלה בגלל ANNOT החזק שלהםation ועקיבות גבוהות. אתגר אחד עם החיות קטנות האלה, אם כי, הוא הטיהור של מולקולות מידע מספיק (ה-DNA, ה-mRNA, חלבון, המטבוליטים) מרקמות רלוונטיות ביותר כגון מוח זבוב. אתגרים אחרים מורכבים איסוף מספר גדול של זבובים לניסוי משכפל (קריטי לחוסן סטטיסטי) ופיתוח נהלים עקביים לטיהור חומר ביולוגי באיכות גבוהה. כאן, אנו מתארים את ההליכים לגביית אלף ראשי זבובים והחילוץ של תמלילים ומטבוליטים להבין כיצד שינויים הגלובליים בביטוי גנים וחילוף חומרים תורמים למחלות ניווניות. הליכים אלו להרחבה בקלות וניתן ליישם את המחקר של תרומות proteomic וepigenomic למחלה.
במאה האחרונה, דרוזופילה הוכיחה להיות כלי רב ערך עבור מעבדה חוקרת שאלות עמוקות ביולוגיות, בעיקר בפיתוח, ביולוגיה של תא, גנטיקה, ונוירוביולוגיה 1. הסיבות להצלחה זו הן שזבובי פרות הם קלים לתמרן, יש ארגז כלי הרחבה אי פעם 18, 21, 31, ובעלי הגנום פשוט יחסית עם ביאור באיכות גבוהה 26. יתרונות אלה טכניים, בשילוב עם תחכום וחדשנות מתמדת בתוך קהילת הזבוב, הביאו לתרומתו מדעית הרחבה, כפי שבאו לידי הביטוי בהענקת שלושה פרסי נובל (1933, 1995, 2011). לאחרונה, דרוזופילה התפתחה כמודל רלוונטי לחקר מחלות אדם, הפרעות התפתחות, בעיקר חסינות מולדת, סרטן והניוון של מערכת עצבים 2. אנחנו מעוניינים בעיקר בחשיפת הבסיס התאי ומולקולרי במחלות ניווניות. שיתוף מורכב ומגוון אלהnditions צמוד למכלולים, oligomers אולי מסיס, של חלבונים מקופלים באופן חריג, ועל כן, במודל קלות בזבובים. כל מחל ניווניות העיקריות, כוללים אלצהיימר, פרקינסון ומחלת הנטינגטון, הטרשת לרוחב amyotrophic, כמה ataxias, tauopathies, מחלות פריונים, והפרעות נדירות אחרות, כבר עצב בזבובים בחמש עשר השנים האחרונות 23. מעבדות Fly תרמו להבנת מחלות אלה בעיקר על ידי ניצול היכולת של דרוזופילה גנטיקה לזהות גנים חדשים מעורבים ברעילות העצבית של החלבונים פתוגניים. ברגע שהגנים חדשים רלוונטיים למפל neurotoxic מזוהים, השפעותיהם נתחו בדרך כלל על ידי גישות מסורתיות, כולל היסטולוגיה לדפוסי נוכחים לברר של ניוון, immunofluorescence כדי לקבוע חלוקת חלבון והסלולרי, פתולוגיה וניתוחים ביוכימיים להעריך את הכמות והסוג של תצורות חלבון נורמליות . לבסוף, התנהגויותניתוח ioral משמש כreadout תפקודי של תוצאות מחלה. טכניקות מבוססות היטב אלה נוצלו כדי לבחון את התרומה של אחד או כמה גני מועמדים לתהליך המחלה, כולל סטרס חמצונים ותפקוד המיטוכונדריה 13, dysregulation תעתיק 9, 27, 30, תחבורת axonal חריג ופעילות הסינפטית 14, החריג רנ"א 9 ביולוגיה, dysregulated תא איתות 29, dyshomeostasis ER 6, הפריעה proteostasis סלולרי 33, ועוד רבים אחרים 23. עם זאת, לא ברור כיצד חלבונים רעילים אלה עלולים להפריע זמנית עם מסלולים המחוברים ביניהם מרובים, מהו הרצף של הזמן של שינויים אלו, ומהי התרומה היחסית של כל מסלול לפתוגנזה. עשרות שנים של מחקר התמקדו בגן יחיד, גישות השערת מונחה, באדם ומודלים של בעלי חיים הובילו לתמונה שלמה, תמוהה של המנגנונים התאיים הגורמיםניוון מוחיה. ההבנה הלקויה הנוכחית של המנגנונים המדויקים שבאמצעותו חלבונים רעילים מכלולים אלה גורמים נוירופתולוגיה היא מגבלה מרכזית להתפתחות של מחלות-modifying טיפולים.
עכשיו אנחנו מעוניינים ביישום של גישות חדשות להבנה כיצד חלבונים פתוגניים אלה לגרום הפרעות סלולריות גלובליות. כניסתו של עידן omics מאפשרת חיטוט העמוק של בעיות ביולוגיות מורכבות תוך שימוש בטכנולוגיות מתוחכמות תפוקה גבוהה, אשר יכול להוביל לטיפול במחלה אפקטיבי בעתיד הקרוב. מחקרי ביטוי גנים (transcriptomics) הוקמו בעקבות השלמת רצפי הגנום מרובים מאז ביאור באיכות גבוהה יכול לחזות רוב התמלילים. הבקשה האחרונה של הדור הבא של רצף לניתוח תמליל (RNA-seq) ספקה יתרונות ולהזדמנויות חדשות בהשוואה לmicroarrays, כולל גישה בלתי משוחד, מגוון הכמותית שפר, ועלות המופחתת 32.אנחנו רוצים לנצל את היתרונות של RNA-seq להבין טוב יותר את הצורה הנפוצה ביותר של אטקסיה התורשתית דומיננטי, סוג Spinocerebellar אטקסיה 3 (SCA3) או מחלת Machado-Joseph. SCA3 הוא מחל monogenic, דומיננטית עם חדירנות מלאה, שנגרמה על ידי התרחבות trinucleotide CAG בגן Ataxin3 (ATXN3) 16. מוטציה זו גורמת לייצור של חלבון עם Atxn3 polyglutamine מסלול ארוך (polyQ) שעושה את זה נוטה לצבור. מאז המוטציה Atxn3 הוא הסוכן העצבי בSCA3 האחראי לכל הפרעות הקשורות למחלה, זו מחלה אידיאלית ליישום גישות omic החדשים אלה. בנוסף, SCA3 היה האחת המחלות ניווניות המוקדמות ככבו בזבובים 34.
בעוד לשים במקום את נהלי איסוף מספר גדול של ראשים לטוס לRNA-seq, הבינו שאנחנו יכולים להשתמש באותו חומר לביצוע מחקרים הגלובליים של מולקולות מידע אחרות. בין discip משקים מתעוררים אחרקווים, פרוטאומיקה, epigenomics וmetabolomics לאפשר בחינה של הפתולוגיה התאית בעומק לא השיג בעבר, אם כי לא בלי אתגרים. בניגוד ל- mRNA, הקטלוג של חלבונים ומטבוליטים הוא די חסר בשלב זה בשל הקושי המוגבר בניבוי כל הווריאציות האפשריות ושחבור המוצא אפילו מסתורי יותר מכל מטבוליטים הרגילים ופתוגניים. מאמצים גדולים נמצאים כרגע בעיצומו לקטלג את החלבונים באורגניזמים רבים ובתנאי מחלה. לשם כך, אנחנו רוצים להתמקד בתרומה של מטבוליטים ששונו SCA3 הפתוגנזה באמצעות האורגניזם פשוט, כגון דרוזופילה. זהו תחום חדש יחסית ומבטיח, במיוחד עם המבוא האחרון של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), המספק שחזור גבוה ולא להרוס את דגימות 5, 24. אנו מציעים כי פרופיל המטבוליט יכול לתרום לזיהוי סמנים ביולוגיים ומנגנונים מעורבים במחל neurodegeneratiב.
שיקול חשוב אחד עם פרויקטי omic האלה הוא שהם דורשים דגימות גדולות ואחידות (200 ראשי זבובים), כמו גם טכניקות טיהור מדויקות כדי למזער וריאציה ניסיונית. התחלנו לאסוף זבובים בעקבות הליכים שהשתמשנו בם בעבר עבור microarrays וגם בשימוש לאחרונה ל12 RNA-seq. אבל מהר מאוד נתקל במספר בעיות הקשורות לmisexpressing את SCA3 המבנים. ראשית, היה עלינו לבחור נהג Gal4 לניסויים אלה 4, שבו רקמת היעד לניתוח המוח. הבחירה הברורה תהיה נהג הפאן עצבי מאז SCA3 היא מחלה מוחית. עם זאת, כיוון שאנו מתכוונים לאסוף mRNA ומטבוליטים מראשים שלמים, אפשרות זו הייתי לייצר חומר מעורב מרקמות להביע ולא מבטאות את המבנים. כדי להפיק דגימות הומוגניות שבו כל התאים מבטאים את המבנים, החליט להשתמש בקו חלש, אבל בכל מקום נהג, daughterless (דה)-Gal4. Interesמדגדג, רבים מהגנים המעורבים במחלות ניווניות, כולל ATXN3 20, יש לי הפצה רחבה, מה שהופך את הבחירה של ביטוי בכל המקום מתאים. ואז, נתקל בבעיה שנייה: ביטוי נפוץ של פתוגניים Atxn3-78Q גרמה קטלני במהלך פיתוח. כדי לעקוף את הקטלניות זה, אנו משולבים Gal80 ts לשלוט הפעלה הזמנית של Gal4 19. זה אפשר לנו לאסוף את הזבובים הניסיוניים, גילם לתקופה של עד 20 ימים, להקפיא אותם, ולעבד אותם לראשי lyophilized או רנ"א (TRIzol) או חילוץ מטבוליט (מתנול, כלורופורם) (איור 1). יש לנו כבר בשימוש בפרוטוקול זה לקבלת דגימות לניתוחי transcriptomic וmetabolomic, אבל יש יישומים ברורים אחרים לטכניקה זו (לדוגמא proteomic או ניתוחי נוירו peptidomic).
סקירה ניסויית: המטרה הכללית של פרוטוקולים אלה היא לתמוך באוסף של consiדגימות של סטנט ראשים לטוס לחילוץ של תמלילים ומטבוליטים. המטרה הספציפית של נהלים אלה היא לרכוש זבובים מבטאים Atxn3-27Q וAtxn3-78Q (מבנים שאינם פתוגניים ופתוגניים ניסיוניים), כמו גם LacZ (מבנה שליטה), שבו יחיד מדגם מורכב של 200 ראשי זבובים. למרות שטכנולוגיה נוכחית מאפשרת הניתוח של דגימות קטנות מאוד, כולל תאים בודדים 28, נאגדנו 200 ראשים לחסל וריאציה ניסויית, ביולוגית וטכנית, ובכך מאפשר לנו לזהות את השינויים התאיים הקשורים בתהליך המחלה בביטחון סטטיסטי גבוה. גישה זו נועדה לזהות רק את אותם שינויים בביטוי גנים שאינם עקביים באוכלוסייה שכיוונה אותנו לכיוון השבילים הקריטיים ביותר נהיגת ניוון. מכיוון שאנו מעוניינים בשינויים תלויי גיל בראשיהם של הזבובים האלה, כל גנוטיפ הושג ב1, 10, ו 20 ימים של גיל.
היבט מהותי מאלהניתוחים הגלובליים הוא הייצור ביולוגי משכפל תמיכה שניתוח סטטיסטי חזק. הניסיון הקודם שלנו עם microarrays וRNA-seq מרמז כי הניתוח של דגימות ביולוגיות בשלושה עותקים לספק מובהקות סטטיסטיות חזקות של 11 נתונים, 12. אנו מתארים בסעיף 1) איך לייצר לשכפל ביולוגי בודדה (1 הודעות) עבור כל נקודת גנוטיפ וזמן. נהלים אלה ניתן לחזור לייצר חזרות 2 ו 3, או נעשים במקביל, כל עוד כל הודעות מזוהות כהלכה. למרות 3 חזרות היא המטרה, הגדרת הברירה רביעית (או אפילו 5) מומלצת מאוד לכיסוי נושאים הקשורים לתשואה נמוכה, אובדן של זבובים במהלך ההזדקנות, או אובדן של חומר (זבובים, ראשים, או RNA) באחד או יותר דגימות.
מצאנו כי 10 צלבים (בקבוקים זוהו על ידי אותיות AJ) מיוצרים מספיק צאצאים כדי להשיג 200 ראשים / גנוטיפ / נקודת זמן. זהירות רבה יש ליישם כדי למנוע בלבול, שכן כמויות גדולות של בקבוקים במחדש נדרש לקבל הודעות 1 (10 x 3 בקבוקי גנוטיפים x 3 נקודתי זמן = 90 בקבוקים). לשם כך, אנו משתמשים בכל בקבוק מיועד גנוטיפ, נקודת זמן, ומכתב בקבוק. לדוגמה, SCA3-27Q 20E מתייחס לבקבוק החמישי (מתוך 10) של זבובים מבטאים Atxn3-27Q התיישן במשך 20 ימים. ברגע eclose הצאצאים, את הזבובים נשמרים בצלוחיות הנפרדות שכותרתו עם המזהה הייחודי.
שמרנו את המספרים של זבובים שהתקבלו עבור כל דגימה, בקבוק, ונקודת איסוף (בוקר וערב) בגיליון אלקטרוני של Excel. אנו תוקנו מספר הזבובים לבקבוקון לפני ההקפאה לקחת בחשבון הקטלניות ונמלטים. מהספירה האחרונה האלה, בקבוקוני הוספת 200 זבובים יכולים להימצא בקלות לפני שפתח את המקפיא וכך תורמים לשמירה על הדגימות. מאז זבובים שנאספו מבקבוק אחד ניתן להשתמש רק במחדל אחד, אנחנו מוגדלים תרומתם ללשכפל ביולוגי, למרות כל החזרות הכילו זבובים מבקבוקים מרובים. אנו שמוריםאת הזבובים מבקבוקים לא השתמשו בהודעות המתוכננות שלהם לחזרות אחרות, כדוגמאות להחלפה, או לניסויים אחרים הקשורים (מערבי כתם, qPCR).
בונים על הניסיון הקודם שלנו ב11 transcriptomics, 12, חילוף חומרים של 15, ומחלות ניווניות 6, 8, אנו מציגים כאן פרוטוקול חדש לאיסוף אלף ראשי זבוב עם ביטוי מבוגר ספציפי של גני מחוללי מחלות, וmRNA טיהור ומטבוליטים לRNA- seq וספקטרוסקופית NMR, בהתאמה. הטבע של ניסויים אלה נדרש שילוב של מספר חידושים לפני האוסף לטוס, כולל מבחר של Gal4 קו בכל מקום והשימוש בתקנה זמנית של ביטוי גנים. לגבי ביטוי Gal4, בכל מקום מtransgenes היה מכריע משתי סיבות. ראשית, מספר גדול של גני המעורבים במחלות ניווניות, כולל ATXN3, huntingtin, חלבון מבשר עמילואיד, וSuperoxide dismutase 1, בין יתר, באים לידי ביטוי באופן נרחב בתאי עצב וגליה, כמו גם בסוגי תאים אחרים מחוץ למערכת העצבים. רצינומודל נכון היבט זה של הביולוגיה של גני מחוללי מחלות אלה על ידי ניתוח ההשלכות של ביטוי בכל מקום, במקום להתמקד רק בביטוי עצבי. שנית, זה לא ריאלי לאסוף מוחות לטוס במספרים גדולים, אבל אנחנו יכולים לעשות זאת עם ראשי זבוב (מעל 200 בשלושה עותקים לכל מצב) 11, 12. מאז הומוגניזציה של ראשים שלמים מתערבבת רקמות עצביות ולא עצביות, ביטוי transgene כל מקום הופך להיות קריטי לקבלת רנ"א ומטבוליטים אחידים מאוכלוסיות של תאים המבטאים את אותם גנים המושתלים. חשוב לציין כי דה Gal4 נבחר להפצה שלה די אפילו, לא בגלל רמת הביטוי הגבוהה שלה, למרות שהדו"ח אחרון שהציע דה Gal4 לא יכול להיות לגמרי בכל מקום 25. היינו לנו קודם לכן נחשבים Gal4 קווים בכל מקום אחרים, כולל זרוע, אמבטיה, והחוק-Ga4, אבל כולם הראו דפוסי ביטוי מורכבים במערכת עצבים מרכזיים ושרירים למבוגרים, מה שהופך אותם פחותdequate למחקר זה. למעשה, immunofluorescence במוחות בוגרים הראה כי דה Gal4 גורם ביטוי נפוץ אך חלש, שצבר רק ברמות גבוהות במרכזים במוח המורכבים מכמה אלף אקסונים ובכמה תאים עצב גדולים (איור 2). למרות שרמות הביטוי של המבנים היו נמוכות, תנאים אלה צומצמו באופן משמעותי הישרדות באופנה polyQ תלויה. דינמיקת ביטוי זה מלא את הצרכים שלנו, תוך שמירה על רמות נמוכות ביטוי, מה שהיו חשוב להתבוננות בשינויים האיטיים וההדרגתיים הסלולריים המושרים על ידי חלבוני neurotoxic.
תוצאה צפויה של גרימת ביטוי נפוץ של חלבוני neurotoxic הייתה שזה גרם קטלני לפני eclosion המבוגר. למרבה המזל, היה סיבוך זה עקף עם השימוש בGal80 ts. כאמור לעיל, הגיע לרמות ביטוי גנים מקסימאליים כ 48 שעות לאחר שינוי הטמפרטורה, המשתלב היטב עם הזמן fraשלי הניסוי. יתרון נוסף של שימוש באחד Gal80 ts היה כי, בניגוד לניסויים שבו באים לידי ביטוי חלבוני neurotoxic constitutively הפאן עצבי, לא היה שום ביטוי במהלך ההתפתחות של מערכת העצבים. לפיכך, השימוש בGal80 ts יצר רקע "נקי" שבו מערכת העצבים לא נחשף לפעילות הרעילה של חלבוני neurotoxic אלו במהלך שלבי התפתחות רגישים. לדעתנו, הפעלה של ביטוי גנים במבוגרים הביאה למודל טוב יותר לסוג כזה של פתולוגיות מבוגרי התפרצות. עם זאת, Gal80 ts הציג גם כמה סיבוכים הקשורים לשינויי הטמפרטורה. אחד מהם היה שזבובים גדלו בטמפרטורות נמוכות (18-20 מעלות צלזיוס) עכבו את מחזור החיים, מה שהופך את הניסויים באופן משמעותי יותר. כמו כן, זה ידוע שזבובי גידול בטמפרטורות גבוהות (29-31 מעלות צלזיוס) מאיצים את חילוף החומרים שלהם, כפי שהומחש על ידי קיצור תוחלת החיים בהשוואה לזבובים בגילי 25 ° C. סיNCE יבוצעו מחקרי התעתיק וטבולים בזבובים בגילים בטמפרטורה גבוהה, אנו יכולים לצפות לראות שינויים חשובים במסלולי מתח סלולריים וחילוף חומרי אנרגיה. זו הסיבה שזה היה כל כך קריטי להציג שני פקדים לניסוי, אחד עם-פתוגניים אינם Atnx3-27Q ושליטה שאינה קשורה להביע LacZ. פקדים אלה יספקו בסיס לביטוי גנים ושינויים מטבוליים הקשורים לטמפרטורה גבוהה, כדי שנוכל לזהות את אותם שינויים המקושרים ישירות לביטוי של Atxn3 הרעיל. בסך הכל, יש לנו הצגנו כמה שינויים באוסף של זבובים המספקים יתרונות רבים – וכמה חסרונות (בעיות הטמפרטורה והסעיף הבא) – ללימוד מבוגר התפרצות מחלות, נאורה.
למרות שההסדרה הזמנית עם Gal80 ts הייתה תוספת מועילה, הוא גם הציג סיבוך בלתי צפוי. תוך יצירה את הזבובים שנשאו הן Gal80 tsnd-Gal4 da מבנים במניות יציבות, הבחינו שטס כפליים הומוזיגוטים לשני המבנים היו קיימא אך עקרים. מאז הומוזיגוטים Gal80 ts וGal4 da זנים היו קיימא ופורים בעצמם, אין זה ברור מדוע שילוב מוצג פוריות נמוכה. זה כבר ידוע מזה זמן כי Gal4 הוא מעט רעיל לרקמות תסיסנית 22. זה אפשרי, אם כן, שהביטוי של Heterologous Gal80 repressor שמרי התעתיק תרם לרעילות של Gal4 ידי הפרעה, באופן פוטנציאלי, במכונות בתעתיק אנדוגני. רעילות זו עשויה להחריף הפצה בכל המקום של Gal4 תחת שליטתו של דה, גן שמשחק תפקיד מפתח בהתפתחותו המוקדמת ונחישות מינית. ללא תלות בגורמים הבסיסיים של העקרות, הרחיב Gal80 ts; da-Gal4 זבובים על ידי שמירת איזון כרומוזום על דא Gal4 תוך שמירה על הוmozygosity לGal80 t S, טוען כי Gal4 הוא תורם קריטי יותר לעקרות. פתרון זה היה מפתח כי אנחנו משמשים מאה הגברים האלה כל שבוע שני לעבור עם כל אחד מהגנים המושתלים כטב"מ. עם זאת, חוצה ביצוע איזון שנוצר בעבודה נוספת במהלך הבחירה של הצאצאים המתאימים. רק רבע (25%) של הצאצאים נאסף (נקבות, שאינו איזון), שהוסיף זמן בחירה, הקטין את התשואה לבקבוק, והגדיל את מספר הבקבוקים הדרושים כדי להשיג לפחות 200 זבובים לגנוטיפ / לשכפל / שעה נקודה. בסך הכל, למרות שהאוסף של זבובים הפך לארוך זמן רב בשל את הקבוצות הגדולות הדרושות, ואנו בטוחים כי לימוד שינויים תאיים רק כמה שעות לאחר הפעלת הביטוי של גנים פתוגניים ubiquitously יזהה תהליכים חדשניים ומעניינים שהיה מעורבים באיבוד עצבי פרוגרסיבי.
לאחר השלמת התכנון הגנטי היה במקום, שלם תשומת לב מיוחדת למניפולציה שיכולה להציג את השונות ביולוגיות. ראשית, אנו נאספים רק נקבות בתולות כדי להבטיח האחידות של הדגימות, למרות שזה אמור לזרוק את הזכרים ובדיקת הצאצאים פעמים ביום. במהלך הזדקנות, לא יותר מ 12 זבובים הוחזקו באותו הבקבוקון כדי למנוע צפיפות ולחץ. כמו כן, לפני ההקפאה, זבובים הועברו לcryovials ללא הרדמה והורשו להתאושש מההעברה למשך 30 דקות. הגורמים לכאורה הפעוטים הללו יכולים להשפיע על ביטוי גנים וחילוף חומרים, מציגים השתנות בסופו שלא יהיה רלוונטי לניסוי.
כדי להבטיח את איכות החומרים הקפואים (ראשים, RNA, ומטבוליטים), שלם תשומת לב מיוחדת לכל פרט שיכול לתרום לניוון רקמות. מאז זבובים מועברים לcryovials במספרים קטנים (עד 12 זבובים לבקבוקון), היה לנו לאחזר רבים בקבוקונים לאוסף של 200 ראשים. מניפולציות אלה היו דאחד עם זהירות רבה בחדר קר עם קרח יבש וחנקן נוזלי. האוסף של זבובים, הפרדה של ראשים, וטיהור של מולקולות מידע הוא יותר מדי זמן רב כדי לגלות כי החומר היה מושפל בסוף התהליך הארוך הזה. בנוסף להבטחה כי החומר שומר על איכותו, פרוטוקול זה מתאר מספר צעדים למקסם את התשואה של רנ"א ומטבוליטים, כוללים ייבוש בהקפאה ומכות חרוז. צעדים אלה אינם נדרשים לעקירות רגילות לRT-PCR או כמותית PCR מזבובים שלמים, אבל הם קריטיים לטיהור עקבית מדגימות קטנות כגון ראשי זבובים. אנחנו קבענו שצעדים אחרים משפיעים על התשואה של רנ"א. למשל, זבובים מבוגרים מיוצרים באופן משמעותי פחות מאשר רנ"א זבובים צעירים יותר, ללא קשר לגנוטיפ. תצפית זו רמזה שתהליך הזדקנות בטמפרטורה גבוהה גורמת לשינויים דרמטיים. כמו כן, לחילוץ מרנ"א 100 ראש היה דווקא יעיל יותר מ200 ראשים, אז המשיך לטהר ב2 בatches של 100 לדוגמה, רק כדי לשלב אותם לאחר אימות של איכות עם BioAnalyzer. כמו כן, עמודות לטיהור mRNA נראות להרוות בקלות, כך שהכמות של RNA כלל משמשת לעמודה צריכה להיות מותאמת.
מטבוליטים הם תמהיל מגוון של מולקולות קטנות, ולכן בקרת איכות היא יותר קשה מאשר עם DNA, RNA או חלבונים. למרבה הצער, אין קטלוג מלא של מטבוליטים לכל מודל חיה בשלב זה, משהו שיכול להיות שינוי בכמה השנים הבאות הודות ליישום של כמה חידושים טכנולוגיים, כולל ספקטרוסקופית NMR והרחבת השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית – המוני ספקטרומטריית ( LC-MS). למרות NMR הוא פחות רגיש מטרשת נפוצה, זה מראה יתרונות מבטיחים רבים, כולל לא הרס של דגימות, אין נהלים אנליטיים המציגים הטיה (LC), ושחזור גבוה המאפשר השוואה סטטיסטית של חזרות וכמה תנאי ניסוי 24. כך, לדוגמא יכולה להיותהערכה מחדש כדי לוודא תצפיות או מחדש נותחה על ידי-LC-MS לאימות נתוני NMR. הנה, הראו נתוני תמ"ג ראשוניים מזבובים שאנו משתמשים כדי להדר קטלוג של מטבוליטים בדרוזופילה. מידע זה יהיה קריטי לקביעת אופן הביטוי של גנים פתוגניים משנה חילוף חומרים תקין, פתיחה של חלון חדש כדי לקדם את הבנת המנגנונים התאיים העומדים בבסיס מחלות ניווניות.
טכנולוגיות חדשות בomic מתעוררת מציעות את ההזדמנות הטובה ביותר ללמוד מחלות ניווניות ברמת הפירוט שלא הושג בעבר. אולי המכשול הגדול ביותר להתגבר על המחקרים בתפוקה גבוהה האלה הוא האוסף של דגימות לשעתק הנאמן שיכול להיות מנותחות בשיטות רגישות מאוד. הנהלים הציגו כאן מספקים דרך להשיג עקביות זו, ויובילו לתוצאות שניתן להשוות בקלות על מערכי נתונים. למרות שתחומי המחקר העיקריים שלנו היו כרוכים בשינויים שבחנו של גן מפורשיון ומטבוליטים, את הזבובים שנוצרו יכולים גם להיות נתונים לניתוח proteomic או epigenomic. שינויי proteomic וepigenomic מתרחשים במהלך ניוון מוחיה הם גם עשויים להיות בעלת חשיבות עליונה לתהליך המחלה. כשהקהילה המדעית סופו של דבר מזהה את הספקטרום המלא של שינויים מולקולריים המשפיעים על תהליך המחלה, הבנה ברמת מערכות אמיתית של המחלה תהיה אפשרית. ברמה זו, טיפולי מחלה modifying-יהיו סוף הסוף להתגלות כמציאות.
The authors have nothing to disclose.
אנו אסירי תודה לג'ניס סנטיאגו, גבריאל פיגרואה, וחוסת הררה לקבלת סיוע טכני ובלומינגטון תסיסנית מניות המרכז באוניברסיטת אינדיאנה למניות זבוב. ד"ה וCW נתמכו על ידי כספים מNSF-IOS-1051890. PF-F וLMM נתמכו על ידי קרן הזנק הזדמנות מאוניברסיטת פלורידה.
Reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Jazz mix Drosophila food | Fisher Scientific | AS-153 | |
Cryogenic Vials | Corning, Inc. | 430658 | |
Microtubes | Axygen | MCT-175-C-S | |
RNaseZap | Ambion | AM9786 | Treat all surfaces |
5/32″ grinding balls, stainless steel | OPS Diagnostics | GSS 156-5000-01 | |
TRIzol | Ambion | 15596018 | |
1-bromo-3-chloropropane | Sigma | B9673-200ML | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416-500 | |
DEPC-treated water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
DNase I | Promega | M6101 | |
RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Dynabeads mRNA Purification kit | Invitrogen | 610-06 | |
Conical Screw Cap Tubes | Fisher Scientific | 02-681-344 | |
Screw Caps w/O-Rings | Fisher Scientific | 02-681-364 | |
2.0 mm Zirconia beads | BioSpec Products | 11079124zx | |
Methanol, HPLC-grade | Fisher Scientific | A4524 | |
Chloroform, HPLC-grade | Acros organics | AC39076 | |
Drosophila Stocks | |||
da-Gal4 | Bloomington Stock Center | 5460 | |
Gal80[ts] | Bloomington Stock Center | 7108 | |
UAS-MJD-27Q | Bloomington Stock Center | 8149 | |
UAS-MJD-78Q | Bloomington Stock Center | 8150 | |
UAS-LacZ | Bloomington Stock Center | 8529 | |
Equipment | |||
Inject+Matic Sleeper | INJECT+MATIC | ||
Microsieve Set | Fisher Scientific | 3410531 | Use two largest meshes |
Geno/Grinder 2000 | SPEX Sample Prep | SP2100-115 | |
Sorvall Legend Microcentrifuge | ThermoScientific | 75002436 | |
FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System | LabConco | 7670041 | |
BioAnalyzer v. 2.6 | Agilent | 2100 | |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 123-21D | |
NanoDrop spectrophotometer | ThermoScientific | ||
Fast Prep bead-beater | ThermoScientific | FP120 | |
Centrivap Vacufuge Plus | Labconco | 022820001 |