Мы описываем здесь процедуры выделения и очистки мРНК и метаболиты<em> Drosophila</em> Головами. Мы применяем эти методы, чтобы лучше понять сотовой возмущения, лежащие в основе дегенерации нейронов. Эти методики можно легко масштабировать и адаптировать для других "ЭКОНОМИЧЕСКОЕ» проектов.
За последнее десятилетие мы пытались понять молекулярные и клеточные механизмы дегенерации нейронов использованием Drosophila в качестве модельного организма. Хотя плодовых мушек обеспечивает очевидные преимущества экспериментальные исследования в области нейродегенеративных заболеваний, в основном полагаются на традиционные методы, в том числе генетических взаимодействий, гистология, иммунофлюоресценции, и биохимии белка. Эти методы являются эффективными для механистической, гипотеза управляемой исследования, которые приводят к глубокому пониманию роли отдельных генов в четко определенных биологических проблем. Тем не менее, нейродегенеративные заболевания являются очень сложными и затрагивают многочисленные клеточные органеллы и процессов с течением времени. Появление новых технологий и возраст омик предоставляет уникальную возможность понять глобальной сотовой возмущения, лежащие в основе сложных заболеваний. Гибкая модельных организмов, таких как Drosophila идеально подходят для адаптации этих новых технологий из-за их сильной AnnotATION и высокая уступчивость. Одна из проблем с этими мелкими животными, однако, заключается в очищении достаточно информационных молекул (ДНК, РНК, белков, метаболитов) с весьма актуальны ткани, такие как мухи мозги. Другие проблемы включают сбор большого количества мух для экспериментальной репликации (критический для статистической устойчивости) и развивающихся последовательные процедуры для очистки высокого качества биологического материала. Здесь мы описываем процедуры для сбора тысячи мух руководителей и добыча стенограммы и метаболитов, чтобы понять, как глобальные изменения в экспрессии генов и обмена веществ способствуют нейродегенеративных заболеваний. Эти процедуры легко масштабируются и могут быть применены к изучению протеомных и эпигеномном вклад в болезнь.
В прошлом веке, Drosophila оказалось бесценным инструментом лабораторию для исследования глубоких биологических вопросов, прежде всего в развитии, клеточной биологии, генетики и нейробиологии 1. Причины этого успеха в том, что плодовые мухи легко манипулировать, имеют постоянно расширяет инструментарий 18, 21, 31, и обладают относительно простой геном с высоким качеством аннотацию 26. Эти технические преимущества, в сочетании с изобретательностью и постоянные инновации в лету сообщества, привели к широкому научному вкладу, о чем свидетельствует присуждение трех Нобелевских премий (1933, 1995, 2011). Совсем недавно, Drosophila стала соответствующих моделью для изучения человеческих болезней, в первую очередь нарушениями развития, врожденный иммунитет, рак и нейродегенеративные 2. Мы особенно заинтересованы в раскрытии клеточные и молекулярные основы нейродегенеративных заболеваний. Эти сложные и разнообразные сотрудничествеnditions связаны с собрания, возможно, растворимых олигомеров, аномально свернутых белков и, следовательно, легко моделируется в мух. Все основные нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, Паркинсона и болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз, несколько атаксии, tauopathies, прионных заболеваний и других редких заболеваний, были смоделированы у мух за последние пятнадцать лет 23. Fly лаборатории внесли свой вклад в понимание этих заболеваний главным образом за счет использования доблесть дрозофилы генетики для выявления новых генов, участвующих в нейротоксичности патогенных белков. После новых генов, имеющих отношение к нейротоксическое каскада будут определены, их последствия, как правило, анализируются традиционные подходы, в том числе гистологии, чтобы установить формы дегенерации, иммунофлюоресценции, чтобы определить распределение белков и клеточной патологии и биохимические анализы для оценки количества и типа аномальной конформации белка . Наконец, поведениеioral анализа служит в качестве функционального считывания исходы заболевания. Эти устоявшихся методов были использованы для изучения вклада одного или нескольких генов-кандидатов в процесс болезни, в том числе окислительного стресса и митохондриальная дисфункция 13, транскрипционной регуляции 9, 27, 30, аберрантной аксонального транспорта и синаптической активности 14, ненормальные РНК Биология 9, нарушения регуляции клеточной сигнализации 29, ER dyshomeostasis 6, препятствует сотовой proteostasis 33, и многие другие 23. Тем не менее, пока не ясно, как эти токсичные белки могут помешать одновременно с несколькими взаимосвязанными путями, что это временная последовательность этих изменений, и то, что относительный вклад каждого путь к патогенез. Десятилетия исследований, направленных на одного гена, гипотеза управляемой подходы у людей и животных моделях привело к неполной, загадочные картины клеточные механизмы, которые вызываютнейродегенерации. В настоящее время плохое понимание точных механизмов, с помощью которых эти токсичные сборки белка вызывает невропатологии является основным ограничением для развития болезни изменения терапии.
В настоящее время мы заинтересованы в применении новых подходов к пониманию того, как эти патогенные белки вызывают глобальное сотовой возмущения. Наступление эры омик позволяет глубокой зондирования сложные биологические проблемы с помощью сложных высокопроизводительных технологий, которые могут привести к эффективному лечению заболевания в ближайшем будущем. Экспрессия генов (транскриптомику) исследований были установлены после завершения нескольких последовательностей генома, так как высококачественное аннотации может предсказать наиболее стенограммы. Последнее приложений следующего поколения секвенирования для анализа транскриптов (РНК-след) предоставил новые преимущества и возможности по сравнению с микрочипов, в том числе беспристрастный подход, улучшение количественного диапазона, а также снижение стоимости 32.Мы хотим, чтобы использовать преимущества РНК-след, чтобы лучше понять наиболее распространенная форма преимущественно унаследовала атаксия, спиноцеребеллярные типа атаксии 3 (SCA3) или Мачадо-Джозефа болезни. SCA3 является моногенных, доминантное заболевание с полной пенетрантностью, вызванных CAG тринуклеотидной расширения в гене Ataxin3 (ATXN3) 16. Эта мутация приводит к производству Atxn3 белка с длинным полиглутаминовых (polyQ) трека, что делает его склонным к совокупности. Поскольку мутант Atxn3 является нейротоксическое агента в SCA3 ответственность за все связанные с болезнью возмущения, это идеальный болезни для применения этих новых подходов OMIC. Кроме того, SCA3 был одним из первых нейродегенеративных заболеваний, смоделированные в мух 34.
При установлении процедуры сбора большого количества мух головки для РНК-след, мы поняли, что мы могли бы использовать тот же материал для проведения глобальных исследований других информационных молекул. Среди других новых discipлиний, протеомики, epigenomics, и метаболомики позволяют рассмотрении клеточной патологии на глубину не ранее достигнутые, хотя и не без проблем. В отличие от мРНК, каталог белков и метаболитов довольно неполными в это время в связи с увеличением трудности в прогнозировании всех возможных вариантов сплайсинга и еще более загадочное происхождение всех нормальных и патогенных метаболитов. Большие усилия в настоящее время в каталог белков во многих организмах и при болезненных состояниях. Для этого мы хотели сосредоточиться на вклад измененных метаболитов в патогенезе SCA3 помощью простых организмов, таких, как дрозофилы. Это относительно новое и перспективное направление, особенно с недавним введением ядерного магнитного резонанса (ЯМР), который обеспечивает высокую воспроизводимость и не разрушает образцов 5, 24. Мы полагаем, что метаболит профилирования может способствовать выявлению и биомаркеров заболевания механизмы, вовлеченные в neurodegeneratiо.
Одним из важных моментов с этими ЭКОНОМИЧЕСКОЕ проектов является то, что они требуют больших, однородных образцах (200 глав лету), а также точные методы очистки, чтобы минимизировать экспериментальные вариации. Мы начали собирать мух следующие процедуры мы использовали ранее для микрочипов, а также используется в последнее время для РНК-след 12. Но вскоре мы столкнулись с рядом проблем, связанных с misexpressing SCA3 конструкций. Во-первых, мы должны были выбрать Gal4 драйверов для этих экспериментов 4, где ткани-мишени для анализа была мозга. Очевидный выбор был бы пан-нейронных драйвера, так как SCA3 это болезнь мозга. Однако, поскольку мы намерены собрать мРНК и метаболитов из цельной головы, эта опция будет производить смешанный материал из тканей выразить и не выражает конструкций. Для создания однородных образцов, где все клетки экспрессируют конструкций, мы решили использовать слабые, но вездесущий драйвер линии, daughterless (да)-Gal4. Интереспокалывание, многие из генов, участвующих в нейродегенеративных заболеваний, в том числе ATXN3 20, имеют широкого распространения, делая выбор повсеместного выражение уместно. Затем, с которыми мы столкнулись вторая проблема: повсеместное выражение патогенного Atxn3-78Q вызвало летальность при развитии. Чтобы обойти эту летальность, мы включили Gal80 TS контролировать временную активацию Gal4 19. Это позволило нам собрать экспериментальную мухи, возраст их на срок до 20 дней, заморозить их, и обрабатывать их лиофилизированный главы либо РНК (TRIzol) или метаболит (метанол-хлороформ) добычи (рис. 1). Мы уже использовали этот протокол для получения образцов для транскриптомных и metabolomic анализов, но есть и другие очевидные применения этой методики (например, протеомных или нервно-peptidomic анализов).
Экспериментальный обзор: общая цель этих протоколов является поддержка коллекция ПОСЛУЖИТЬСтент образцов лету главы по добыче стенограммы и метаболиты. Конкретная цель этих процедур является приобретение мух выражения Atxn3-27Q и Atxn3-78Q (не-патогенных и патогенных экспериментальных конструкций), а также LacZ (контроль конструкция), где один образец состоит из 200 глав лету. Хотя современная технология позволяет анализировать очень маленькие образцы, в том числе одиночных камерах 28, мы объединенных 200 голов для устранения экспериментальных, биологических и технических изменений, что позволяет нам идентифицировать клеточные изменения, связанные с процессом болезни с высокой статистической достоверностью. Этот подход предназначен для обнаружения только те изменения в экспрессии генов, которые соответствуют населения, направляя нас к наиболее важным пути движения дегенерации. Так как мы заинтересованы в возрастных изменений в головах этих мух, каждый генотип был получен на 1, 10 и 20 дней от роду.
Одним из основополагающих аспектов этихглобального анализа является производство биологических повторяет, которая поддерживает устойчивое статистического анализа. Наш опыт работы с микрочипов и РНК-след показывает, что анализ биологических образцов в трех экземплярах обеспечивают сильную статистическую значимость данных 11, 12. Мы описываем в разделе 1) как создать единый биологический повторных (Rep 1) для каждой точки генотипа и времени. Эти процедуры могут быть повторены для создания Репс 2 и 3, или сделать параллельно, так как каждый Rep правильно идентифицировать. Хотя три Репс это цель, установив четвертый (или даже пятый) Вес Настоятельно рекомендуется, чтобы покрыть вопросы, связанные с низкой доходностью, потеря мух в процессе старения, или случайной потери материала (мухи, головы, или РНК) в одном или нескольких образцам.
Мы обнаружили, что десять крестов (бутылки обозначены буквами AJ) производится достаточно для получения потомства 200 голов / генотип / момент времени. Особая осторожность должна применяться, чтобы избежать путаницы, поскольку большое количество бутылокповторно, необходимых для получения одного Rep (10 бутылок х 3 х 3 генотипов моменты времени = 90 бутылок). Для этого мы обозначили каждую бутылку, используя генотип, момент времени, и бутылка письмо. Например, SCA3-27Q 20E относится к пятой бутылки (из десяти) мух выражения Atxn3-27Q в возрасте за 20 дней. После того, потомство eclose, мухи сохраняются в отдельных флаконах с надписью уникальный идентификатор.
Мы сохранили количество мух, полученные для каждого образца, бутылки, и пункт сбора (утром и вечером) в таблицу Excel. Мы пересмотрели количество мух на флакон до замораживания, чтобы принять во внимание летальности и беглецов. Из тех, окончательный подсчет, флаконы добавлением 200 мух может быть легко расположен перед открытием морозильной камеры, способствуя тем самым сохранению образцов. Так как мухи собраны из одной бутылки может быть использован только в одном Вес, мы максимально их вклад в биологическую повторных, хотя все Репс, содержащихся мух от нескольких бутылок. Мы зарезервировалимух от бутылки не используются в их запланировано Вес для других Репс, в качестве замены образцов, или других связанных с экспериментами (вестерн-блот, КПЦР).
Опираясь на наш опыт в 11 транскриптомику, 12, метаболизм 15, и нейродегенеративные заболевания, 6, 8, приведем здесь новый протокол для сбора тысячи лету головы взрослой конкретное выражение патогенного гена и очистки мРНК и метаболитов для РНК- след и ЯМР-спектроскопии, соответственно. Характер этих экспериментов требует включения нескольких нововведениях до лету коллекции, в том числе выбор повсеместно Gal4 линии и использование временной регуляции экспрессии генов. Что касается Gal4, повсеместное выражение трансгенов было важно по двум причинам. Во-первых, большое количество генов, участвующих в нейродегенеративных заболеваний, в том числе ATXN3, Huntingtin, белка-предшественника амилоида, и супероксиддисмутазы 1, среди прочих, широко экспрессируется в нейронах и глиальных клетках, а также в другие типы клеток за пределами нервной системы. Мы хотелиправильно смоделировать этот аспект биологии этих патогенных генов, анализируя последствия повсеместного выражение, а не сосредотачиваясь только на нейронные выражение. Во-вторых, это не представляется возможным собрать лету мозга в большом количестве, но мы можем сделать это с лету глав (более 200 в трех экземплярах за состояние) 11, 12. С гомогенизации смеси целые главы нервной и без нервных тканей, повсеместное выражение трансгена становится критическим для получения равномерного РНК и метаболитов из популяции клеток, экспрессирующих же трансгенов. Важно отметить, что да-Gal4 был выбран из-за его достаточно равномерное распределение, а не из-за его высокого уровня экспрессии, хотя в последнее докладе говорится, что да-Gal4 не может быть абсолютно повсеместно 25. Мы ранее рассмотрены и другие повсеместно Gal4 линий, в том числе рука, Тюб-и Закон-GA4, но все они показали сложные паттерны экспрессии во взрослой ЦНС и мышцы, делая их менееdequate для данного исследования. В самом деле, иммунофлюоресценции у взрослого мозга показали, что да-Gal4 вызывает широкое распространение, но слабые выражения, которые только накопленный на высоком уровне в мозговые центры, состоящей из нескольких тысяч аксонов и в нескольких крупных нейронов (рис. 2). Хотя уровни экспрессии конструкции были низкими, эти условия резко сократилось выживания в polyQ зависит от моды. Это выражение динамики выполнены нашими потребностями, сохраняя при этом выражение низкого уровня, что было важно для наблюдения за медленно, прогрессивная сотовая изменения индуцированных нейротоксических белков.
Предсказуемым следствием вызывая повсеместное выражение нейротоксических белков в том, что она вызвала летальность до вылета имаго. К счастью, это осложнение было обойти с помощью Gal80 TS. Как уже говорилось выше, экспрессия генов достигла максимального уровня примерно 48 часов после сдвига температуры, которая хорошо вписывается время FRAМне эксперимента. Еще одно преимущество использования Gal80 TS в том, что, в отличие от экспериментов, в которых нейротоксических белков конститутивно выразил пан-ЦНС, не было никакого выражения во время развития нервной системы. Таким образом, использование Gal80 TS создан "чистый" фона, на котором нервная система не подвергалась токсичных деятельности этих нейротоксических белков в чувствительных стадий развития. На наш взгляд, активации экспрессии гена у взрослых в результате лучшей моделью для этого класса взрослом возрасте патологии. Тем не менее, Gal80 TS также представила несколько осложнений, связанных с изменением температуры. Один из них был, что рост мух при низких температурах (18-20 ° C) задержали жизненного цикла, что делает эксперименты значительно больше. Кроме того, известно, что выращивание мух при высокой температуре (29-31 ° C) ускоряет их метаболизм, как показано на укороченный срок службы по сравнению с мухами возрасте при 25 ° C. Систь транскрипции и метаболические исследования будут проводиться в возрасте от мух при высокой температуре, мы можем ожидать увидеть важные изменения в клеточных путей стресс и энергетического обмена. Вот почему это было так важно ввести два элемента управления экспериментом, один с непатогенные Atnx3-27Q и связанных контроль выразив LacZ. Эти элементы управления будут обеспечивать основу для экспрессии генов и метаболических изменений, связанных с высокой температурой, так что мы можем идентифицировать эти изменения напрямую связаны с выражением токсичных Atxn3. В общем, мы внесли несколько изменений в коллекции мух, которые предоставляют множество преимуществ – и несколько недостатков (температура вопросов и следующий пункт) – для изучения взрослом возрасте, прогрессирующих заболеваний.
Несмотря на временное регулирование с Gal80 TS был полезным Кроме того, он также внес неожиданные осложнения. При генерации мух проведения как Gal80 TSой да-Gal4 конструкций в стабильной складе, мы заметили, что летает дважды гомозиготных по обе конструкции были жизнеспособными, но стерильно. С гомозиготных Gal80 ТС и да-Gal4 штаммы были жизнеспособными и плодородные сами по себе, не ясно, почему комбинация отображается низкой рождаемости. Это было известно в течение некоторого времени, что Gal4 немного токсичны для тканей Drosophila 22. Возможно, то, что гетерологичной экспрессии дрожжей транскрипционный репрессор Gal80 вклад в токсичность Gal4, вмешиваясь, возможно, с эндогенным транскрипционной машины. Это токсичности может быть усилено повсеместное распространение Gal4 под контролем да, ген, который играет ключевую роль в раннем развитии и сексуальной детерминации. Независимо от причины бесплодия, мы расширили Gal80 ТС; да-Gal4 мух, поддерживая балансировки хромосомы более-да-Gal4, сохраняя при этом хоmozygosity для Gal80 T S, предполагая, что Gal4 является более важным фактором бесплодия. Это решение было ключевым, потому что мы использовали сотни таких мужчин каждую неделю, чтобы пересечь с каждым из трансгенов БАС. Тем не менее, пересекает проведения балансировки созданы дополнительные работы при выборе соответствующего потомства. Только четверть (25%) потомства была собрана (женщины, не балансировки), который добавил выбора и снижает доходность за бутылку, и увеличить количество бутылок, необходимые для получения по меньшей мере 200 мух в генотипе / копировать / время точка. В целом, хотя коллекция мух стала много времени из-за больших наборов необходимости, мы уверены, что изучение клеточных изменений, только через несколько часов после включения выражение патогенного гена повсеместно будет идентифицировать новые и интересные процессы вовлечены в прогрессивную потерю нейронов.
После того, генетическая конструкция была на месте, мы уделили особое вниманиеэкспериментальных манипуляций, которые могли бы ввести биологической изменчивости. Во-первых, мы только собрали девственной женщины для обеспечения однородности образцов, хотя это означало, выбрасывая мужчин и проверка на потомство дважды в день. Во время старения, не более 12 мух были сохранены в том же флаконе, чтобы избежать перенаселенности и стресса. Кроме того, перед замораживанием, мухи были переданы криопробирки без анестезии и было разрешено, чтобы оправиться от передачи в течение 30 мин. Эти, казалось бы тривиальная факторы могут влиять на экспрессию генов и обмена веществ, представляя изменчивости в конечном счете, что бы не иметь отношение к эксперименту.
Для обеспечения качества замороженных материалов (глав, РНК и метаболитов), мы уделили особое внимание к каждой детали, которые могут способствовать деградации ткани. Так как мухи переносят в криопробирки в небольшом количестве (до 12 мух в одном флаконе), мы должны были получить много флаконов для сбора 200 голов. Эти манипуляции были годин с крайней осторожностью в холодном помещении с сухой лед и жидкий азот. Коллекция мух, отделение головы, и очистка информационные молекулы слишком много времени, чтобы обнаружить, что материал был деградировали в конце этого длительного процесса. В дополнение к обеспечению того, чтобы материал сохраняет свои качества, этот протокол описывает несколько шагов, чтобы максимизировать выход РНК и метаболитов, в т.ч. сублимационной сушки и шарика избиение. Эти шаги не требуется для нормальной экстракции для RT-PCR или количественный ПЦР из целого мух, но они имеют важное значение для последовательного очищения от небольших образцов, таких как мухи головы. Мы определили, что другие меры влияют на выход РНК. Например, пожилые мух производится значительно меньше, чем у более молодых РНК мух, независимо от генотипа. Это наблюдение предположил, что старение при высокой температуре вызывает серьезные изменения. Кроме того, извлечение РНК из 100 голов было на самом деле более эффективно, чем из 200 голов, так что мы приступили к очистке в двух бatches 100 в образце, только чтобы объединить их после проверки качества с BioAnalyzer. Кроме того, колонки для очистки мРНК, казалось, насытить легко, поэтому количество общей РНК использовали в колонке должна быть оптимизирована.
Метаболиты представляют собой разнородную смесь из малых молекул, поэтому контроль качества гораздо сложнее, чем с ДНК, РНК и белков. К сожалению, нет полного каталога метаболитов для любой модели животных в это время, то, что может измениться в ближайшие несколько лет, благодаря применению ряда технических новшеств, в том числе ЯМР-спектроскопии и расширенное использование жидкостной хроматографии – масс-спектрометрии ( LC-MS). Несмотря на то, ЯМР менее чувствительна, чем MS, это показывает, что многие перспективные преимущества, в том числе не разрушения образцов, нет аналитических процедур, которые систематической ошибки (LC), и высокая воспроизводимость, что позволяет статистическое сравнение Репс и несколько экспериментальных условиях 24. Таким образом, выборка может бытьповторное тестирование для проверки замечания или повторно проанализированы LC-MS для проверки данных ЯМР. Здесь мы показали предварительные данные ЯМР от мух, которые мы используем, чтобы составить каталог метаболитов у дрозофилы. Эта информация будет иметь решающее значение для определения того, как выражение патогенного гена изменяет нормальный обмен веществ, открытие нового окна для дальнейшего понимания клеточных механизмов, лежащих в основе нейродегенеративных заболеваний.
Вновь возникающие ЭКОНОМИЧЕСКОЕ технологии предлагают лучшие возможности для изучения нейродегенеративных заболеваний на уровне детализации, которые ранее не были достигнуты. Возможно, самым большим препятствием на пути преодоления этих высокой пропускной исследований является верным коллекции воспроизводимые образцы, которые могут быть проанализированы с высокочувствительными методами. Процедуры представленные здесь предоставляют способ для достижения этой последовательности, и приведет к результатам, которые можно легко сравнить между наборами данных. Хотя наша основная научных интересов участвующих изучения изменений гена экспрессионов и метаболитов, мухи генерируется также может быть подвергнут протеомных или эпигеномном анализа. Proteomic и эпигеномном изменения, происходящие во время нейродегенерации также, вероятно, имеет первостепенное значение для процесса болезни. Когда научное сообщество в конечном счете, определяет полный спектр молекулярных изменений, влияющих на процесс болезни, истинный уровень систем понимания болезни будет невозможно. На этом уровне, иммуномодулирующим терапии, наконец, превратиться в реальность.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны Дженис Сантьяго, Габриэль Фигероа, и Хосе Эррера для оказания технической помощи и Блумингтон дрозофилы со центра при Университете Индианы на лету запасы. DH и CW были поддержаны за счет средств NSF-IOS-1051890. PF-F и БПРМ были поддержаны фондом возможностях семенной из Университета Флориды.
Reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Jazz mix Drosophila food | Fisher Scientific | AS-153 | |
Cryogenic Vials | Corning, Inc. | 430658 | |
Microtubes | Axygen | MCT-175-C-S | |
RNaseZap | Ambion | AM9786 | Treat all surfaces |
5/32″ grinding balls, stainless steel | OPS Diagnostics | GSS 156-5000-01 | |
TRIzol | Ambion | 15596018 | |
1-bromo-3-chloropropane | Sigma | B9673-200ML | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416-500 | |
DEPC-treated water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
DNase I | Promega | M6101 | |
RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Dynabeads mRNA Purification kit | Invitrogen | 610-06 | |
Conical Screw Cap Tubes | Fisher Scientific | 02-681-344 | |
Screw Caps w/O-Rings | Fisher Scientific | 02-681-364 | |
2.0 mm Zirconia beads | BioSpec Products | 11079124zx | |
Methanol, HPLC-grade | Fisher Scientific | A4524 | |
Chloroform, HPLC-grade | Acros organics | AC39076 | |
Drosophila Stocks | |||
da-Gal4 | Bloomington Stock Center | 5460 | |
Gal80[ts] | Bloomington Stock Center | 7108 | |
UAS-MJD-27Q | Bloomington Stock Center | 8149 | |
UAS-MJD-78Q | Bloomington Stock Center | 8150 | |
UAS-LacZ | Bloomington Stock Center | 8529 | |
Equipment | |||
Inject+Matic Sleeper | INJECT+MATIC | ||
Microsieve Set | Fisher Scientific | 3410531 | Use two largest meshes |
Geno/Grinder 2000 | SPEX Sample Prep | SP2100-115 | |
Sorvall Legend Microcentrifuge | ThermoScientific | 75002436 | |
FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System | LabConco | 7670041 | |
BioAnalyzer v. 2.6 | Agilent | 2100 | |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 123-21D | |
NanoDrop spectrophotometer | ThermoScientific | ||
Fast Prep bead-beater | ThermoScientific | FP120 | |
Centrivap Vacufuge Plus | Labconco | 022820001 |