Se describen aquí los procedimientos para la extracción y purificación de ARNm y metabolitos de<em> Drosophila</em> Cabezas. Estamos aplicando estas técnicas para entender mejor las perturbaciones celulares subyacentes a la degeneración neuronal. Estas metodologías se puede escalar fácilmente y adaptarse a otros "ómicas" proyectos.
Durante la última década, hemos tratado de comprender los mecanismos moleculares y celulares de la degeneración neuronal utilizando Drosophila como organismo modelo. A pesar de moscas de la fruta proporcionan ventajas obvias de experimentación, la investigación sobre las enfermedades neurodegenerativas ha dependido en gran medida las técnicas tradicionales, incluyendo la interacción genética, histología, inmunofluorescencia, y la bioquímica de proteínas. Estas técnicas son efectivas para mecanicista, los estudios basados en hipótesis, que conducen a una comprensión detallada de la función de genes individuales en problemas bien definidos biológicos. Sin embargo, las enfermedades neurodegenerativas son muy complejas y afectan a múltiples orgánulos celulares y procesos en el tiempo. El advenimiento de las nuevas tecnologías y la edad ómicas ofrece una oportunidad única para comprender las perturbaciones globales celulares que subyacen a las enfermedades complejas. Organismos flexibles modelo como Drosophila son ideales para la adaptación de las nuevas tecnologías debido a su fuerte annotción y trazabilidad de altura. Uno de los problemas con estos pequeños animales, sin embargo, es la purificación de suficientes moléculas informativas (ADN, ARNm, proteínas, metabolitos) de tejidos altamente relevantes, tales como los cerebros de ventanas. Otros retos consisten en reunir un gran número de moscas para la replica experimental (crítico de robustez estadística) y la elaboración de procedimientos uniformes para la purificación de material de alta calidad biológica. A continuación, se describen los procedimientos para recoger miles de cabezas de moscas y la extracción de las transcripciones y los metabolitos de entender cómo los cambios globales en la expresión génica y el metabolismo contribuyen a las enfermedades neurodegenerativas. Estos procedimientos son fácilmente escalable y puede ser aplicado al estudio de las contribuciones proteómicos y epigenómicas a la enfermedad.
En el siglo pasado, Drosophila ha demostrado ser una herramienta muy valiosa para la investigación de laboratorio profundas cuestiones biológicas, sobre todo en el desarrollo, biología celular, genética, neurobiología y 1. Las razones para este éxito son que moscas de la fruta son fáciles de manipular, tiene una caja de herramientas en constante expansión 18, 21, 31, y poseen un genoma relativamente simple, con alta calidad de anotación 26. Estas ventajas técnicas, combinadas con el ingenio y la innovación constante en la comunidad mosca, han dado lugar a amplias aportaciones científicas, como lo demuestra la concesión de tres premios Nobel (1933, 1995, 2011). Más recientemente, Drosophila ha surgido como un modelo pertinente para el estudio de enfermedades humanas, trastornos del desarrollo, principalmente la inmunidad innata, cáncer, neurodegeneración y 2. Estamos particularmente interesados en el descubrimiento de las bases celulares y moleculares de las enfermedades neurodegenerativas. Estos co compleja y diversanditions están vinculados a los ensamblados, oligómeros solubles, posiblemente de proteínas anormalmente plegadas y están, por lo tanto, fáciles de modelar en las moscas. Todas las principales enfermedades neurodegenerativas, como el Alzheimer, el Parkinson y la enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, ataxias varios tauopatías, enfermedades priónicas, y otros trastornos raros, se han modelado en las moscas en los últimos quince años 23. Fly laboratorios han contribuido a la comprensión de estas enfermedades, principalmente mediante la explotación de las proezas de Drosophila genética para identificar nuevos genes implicados en la neurotoxicidad de las proteínas patógenas. Una vez que los nuevos genes pertinentes a la cascada neurotóxico se identifican, sus efectos se analizan típicamente por métodos tradicionales, incluyendo la histología para determinar los patrones de degeneración, inmunofluorescencia para determinar la distribución de proteínas y patología celular, y los análisis bioquímicos para evaluar la cantidad y el tipo de conformaciones de proteínas anormales . Por último, comportamientoanálisis conductual sirve como una lectura funcional de resultados de la enfermedad. Estas técnicas bien establecidas han sido explotados para examinar la contribución de uno o unos pocos genes candidatos para el proceso de la enfermedad, como el estrés oxidativo y la disfunción mitocondrial 13, disregulación transcripcional 9, 27, 30, transporte axonal anormal y la actividad sináptica 14 de ARN anormal biología 9, dysregulated señalización celular 29, dyshomeostasis ER 6, obstaculizado proteostasis celular 33, 23 y muchos otros. Sin embargo, no está claro cómo estas proteínas tóxicas pueden interferir simultáneamente con múltiples vías interconectadas, lo que es la secuencia temporal de estas alteraciones, y lo que es la contribución relativa de cada vía a la patogénesis. Décadas de investigación se centró en un solo gen, la hipótesis de enfoques basados en los seres humanos y modelos animales han dado lugar a una imagen incompleta, de desconcierto de los mecanismos celulares que causanneurodegeneración. La comprensión actual de los pobres mecanismos exactos por los que estos conjuntos de proteínas tóxicas causan neuropatología es una limitación clave para el desarrollo de las terapias modificadoras de la enfermedad.
Ahora estamos interesados en la aplicación de nuevos enfoques para la comprensión de cómo estas proteínas patógenas inducen perturbaciones globales celulares. El advenimiento de la era ómicas permite que el sondeo profundo de los complejos problemas biológicos usando sofisticadas tecnologías de alto rendimiento, que pueden conducir a tratamientos eficaces que en un futuro próximo. La expresión de genes (transcriptómica) estudios se establecieron después de la terminación de las secuencias del genoma múltiples puesto de alta calidad anotación puede predecir la mayoría de las transcripciones. La reciente aplicación de secuenciación de próxima generación para el análisis de transcripción (RNA-seq) ha proporcionado nuevas ventajas y oportunidades en comparación con los microarrays, incluyendo un enfoque imparcial, un mejor alcance cuantitativo y costo reducido 32.Queremos explotar las ventajas de RNA-seq para comprender mejor la forma más común de herencia dominante ataxia, ataxia espinocerebelosa tipo 3 (SCA3) o enfermedad de Machado-Joseph. SCA3 es una enfermedad monogénica, dominante con penetrancia completa, causada por una expansión CAG trinucleótido en el gen Ataxin3 (ATXN3) 16. Esta mutación da lugar a la producción de proteína con un Atxn3 largo poliglutamina (polyQ) pista que lo hace propenso a la agregación. Desde mutante Atxn3 es el agente neurotóxico en responsable de todas las perturbaciones relacionadas con la enfermedad SCA3, esta es una enfermedad ideal para la aplicación de estos enfoques ómicas nuevos. Además, SCA3 fue una de las primeras enfermedades neurodegenerativas modelados en moscas 34.
Al poner en marcha los procedimientos para recoger un gran número de cabezas de moscas de RNA-seq, nos dimos cuenta de que podíamos usar el mismo material para la realización de los estudios mundiales de otras moléculas informativas. Entre Discip otras economías emergenteslíneas, la proteómica, la metabolómica epigenómica y permitir el examen de la patología celular, a una profundidad que antes no alcanzados, aunque no sin dificultades. A diferencia de los ARNm, el catálogo de proteínas y metabolitos es bastante incompleta en este momento debido a la mayor dificultad en la predicción de todas las posibles variantes de empalme y el origen aún más enigmático de todos los metabolitos normal y patógena. Grandes esfuerzos se están realizando para catalogar las proteínas en muchos organismos y en condiciones de enfermedad. Para ello, hemos querido centrarse en la contribución de los metabolitos alterados para SCA3 patogénesis usando un simple organismo, tales como Drosophila. Este es un campo relativamente nuevo y prometedor, en particular con la reciente introducción de la resonancia magnética nuclear (RMN), que proporciona una alta reproducibilidad y no destruye las muestras 5, 24. Proponemos que el metabolito de perfiles pueden contribuir a la identificación de biomarcadores y mecanismos implicados en la enfermedad neurodegeneratisobre.
Una consideración importante con estos proyectos ómicas es que requieren muestras grandes y uniformes (200 cabezas de mosca) así como las técnicas de purificación precisas para minimizar la variación experimental. Empezamos a recoger las moscas siguiendo los procedimientos que habían usado previamente para microarrays y también utilizado recientemente para RNA-seq 12. Pero pronto se encontró con una serie de problemas relacionados con los misexpressing SCA3 construcciones. En primer lugar, tuvimos que seleccionar un controlador de Gal4 para estos 4 experimentos, donde el tejido diana para el análisis fue el cerebro. La opción obvia sería un conductor pan-neuronal desde SCA3 es una enfermedad cerebral. Sin embargo, ya tenemos la intención de recoger mRNA y los metabolitos de las cabezas enteras, esta opción podría producir material mezclado de los tejidos que expresan y no expresar-las construcciones. Para generar muestras homogéneas donde todas las células expresan las construcciones, se decidió utilizar una línea de conductor, pero débil en todas partes, daughterless (da)-Gal4. Intereshormigueo, muchos de los genes implicados en las enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la ATXN3 20, tienen una amplia distribución, por lo que la elección de la expresión ubicua apropiado. Entonces, nos encontramos con un segundo problema: la expresión ubicua de patógenos Atxn3-78Q provocado muerte durante el desarrollo. Para pasar por alto esta letalidad, incorporamos GAL80 ts para controlar la activación temporal de Gal4 19. Esto nos permitió recoger las moscas experimentales, la edad durante un máximo de 20 días, congelar y procesar sus cabezas liofilizados, ya sea ARN (TRIzol) o metabolito (metanol-cloroformo) extracción (Figura 1). Ya hemos usado este protocolo para la obtención de muestras para análisis transcriptomic y metabolómica, pero hay otras aplicaciones obvias para esta técnica (por ejemplo, proteómica o análisis peptidomic neuro-).
Experimental visión general: El objetivo general de estos protocolos es apoyar la recogida de consimuestras de stent de cabezas de moscas para la extracción de las transcripciones y metabolitos. La meta específica de estos procedimientos es la adquisición de las moscas que expresan Atxn3-27Q y 78Q Atxn3-(no patógenas y patógenas de las construcciones experimentales), así como LacZ (control constructo), donde una sola muestra se compone de 200 cabezas de moscas. Aunque la tecnología actual permite el análisis de muestras muy pequeñas, como las células individuales 28, se combinaron 200 cabezas para eliminar la variación experimental, biológicos y técnicos, lo que nos permite identificar los cambios celulares asociados con el proceso de la enfermedad con alta confianza estadística. Este enfoque está diseñado para detectar sólo los cambios en la expresión de genes que son consistentes en la población, dirigiéndonos hacia las vías más críticos que impulsan la degeneración. Dado que estamos interesados en dependientes de la edad cambios en las cabezas de estas moscas, cada genotipo se obtuvo a 1, 10, y 20 días de edad.
Un aspecto fundamental de estosanálisis globales es la producción de réplicas biológicas que el apoyo de un análisis estadístico robusto. Nuestra experiencia anterior con micromatrices y ARN SEQ-sugiere que el análisis de muestras biológicas en triplicado proporcionar fuerte significación estadística de los datos 11, 12. Se describe en la sección 1) cómo generar un solo replicar biológica (Rep 1) para cada punto genotipo y el tiempo. Estos procedimientos pueden repetirse para generar Reps 2 y 3, o realizarse en paralelo, siempre y cuando cada Rep está debidamente identificado. Aunque tres Reps es el objetivo, el establecimiento de un cuarto (o quinto) Rep es muy recomendable para tratar cuestiones relacionadas con el bajo rendimiento, pérdida de moscas durante el envejecimiento o la pérdida accidental de material (moscas, cabezas, o ARN) en uno o más muestras.
Se encontró que diez cruces (botellas identificadas por letras AJ) producido progenie suficiente para obtener 200 cabezas / genotipo / hora punta. El cuidado extremo debe ser aplicado para evitar la confusión, ya que un gran número de botellasre necesario para obtener un Rep (10 botellas x 3 x 3 genotipos puntos de tiempo = 90 botellas). Para ello, hemos designado cada botella con el genotipo, punto en el tiempo, y la letra de la botella. Por ejemplo, SCA3-27Q 20E se refiere a la quinta botella (de diez) de las moscas que expresan Atxn3-27Q envejecido durante 20 días. Una vez que el eclose progenie, las moscas se mantuvieron en viales separados marcados con el identificador único.
Hemos mantenido el número de moscas obtenidos para cada muestra, botella, y el punto de recogida (mañana y tarde) en una hoja de cálculo Excel. Hemos revisado el número de moscas por vial antes de congelar para tener en cuenta la letalidad y fugitivos. De esos recuentos finales, los viales añadiendo 200 moscas pueden ser fácilmente localizado antes de abrir el congelador, contribuyendo así a la conservación de las muestras. Puesto que las moscas recogidas de una botella sólo se puede utilizar en una Rep, que maximiza su contribución por réplica biológica, aunque todos los representantes contenida moscas de múltiples botellas. Nos reservamoslas moscas de las botellas no utilizados en su Rep programado para Reps otros, como muestras de recambio, o para otros experimentos relacionados (western blot, qPCR).
Basándonos en nuestra experiencia previa en transcriptómica 11, 12, 15 metabolismo y las enfermedades neurodegenerativas 6, 8, presentamos aquí un nuevo protocolo para la recogida de miles de cabezas de moscas adultas con la expresión específica de genes patógenos, y purificar mRNA y los metabolitos de ARN- SEC y espectroscopía de RMN, respectivamente. La naturaleza de estos experimentos requiere la incorporación de una serie de innovaciones anteriores a la recogida mosca, incluyendo la selección de un ubicuo Gal4 línea y el uso de la regulación temporal de la expresión génica. En cuanto a la expresión de Gal4, ubicuo de los transgenes fue crucial por dos razones. En primer lugar, un gran número de genes implicados en enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la ATXN3, huntingtina, proteína precursora de amiloide, y la superóxido dismutasa 1, entre otros, son ampliamente expresado en las células neuronales y gliales, así como en otros tipos de células fuera del sistema nervioso. Quisimosmodelar correctamente este aspecto de la biología de estos genes patógenos mediante el análisis de las consecuencias de la expresión ubicua en lugar de centrarse únicamente en la expresión neural. En segundo lugar, no es posible recoger los cerebros de mosca en gran número, pero podemos hacerlo con cabezas de moscas (más de 200 por triplicado por condición) 11, 12. Dado que la homogeneización de cabezas enteras se mezcla tejidos neurales y no neurales, la expresión del transgen en todas partes se vuelve crítica para la obtención de RNA uniformes y metabolitos a partir de poblaciones de células que expresan los transgenes mismos. Es importante observar que da-Gal4 fue elegido por su distribución bastante uniforme no, debido a su alto nivel de expresión, aunque un informe reciente sugiere que da-Gal4 puede no ser totalmente ubicua 25. Nos habíamos considerado anteriormente otros ubicuos Gal4 líneas, incluyendo el brazo, Bañera, y Act-GA4, pero todos mostraron patrones complejos de expresión en el SNC adulto y los músculos, haciéndolos menos unadequate para este estudio. De hecho, la inmunofluorescencia en cerebros adultos mostró que da-Gal4 induce la expresión generalizada pero débil, que sólo acumulado a altos niveles en los centros del cerebro que comprenden de unos pocos miles de axones y en unos pocos grandes neuronas (Figura 2). Aunque los niveles de expresión de los constructos fueron bajos, estas condiciones reduce drásticamente la supervivencia de una manera dependiente de polyQ. Esta dinámica de la expresión cubrió nuestras necesidades, manteniendo bajos niveles de expresión, lo cual era importante para la observación de las alteraciones lentas y progresivas celulares inducidos por las proteínas neurotóxicas.
Una consecuencia previsible de inducir la expresión ubicua de las proteínas neurotóxicas era que provocó letalidad antes de la eclosión de los adultos. Afortunadamente, esta complicación fue puenteado con el uso de GAL80 ts. Como se discutió anteriormente, la expresión génica alcanzado niveles máximos de aproximadamente 48 horas después del cambio de temperatura, que se ajusta bien con el tiempo frame del experimento. Una ventaja adicional del uso de GAL80 ts fue que, en contraste con los experimentos en los que las proteínas se expresan constitutivamente neurotóxicos pan-neuralmente, no había expresión durante el desarrollo del sistema nervioso. Así, el uso de GAL80 ts creado una "limpia" fondo donde el sistema nervioso no fue expuesto a las actividades tóxicas de estas proteínas neurotóxicas durante fases sensibles del desarrollo. En nuestra opinión, la activación de la expresión génica en adultos como resultado un modelo mejor para esta clase de patologías de inicio adulto. Sin embargo, GAL80 ts también presentó algunas complicaciones asociadas con los cambios de temperatura. Una era que las moscas de crecimiento a baja temperatura (18-20 ° C) con retraso del ciclo de vida, por lo que los experimentos significativamente más larga. Además, es bien sabido que las moscas en crecimiento a altas temperaturas (29-31 ° C) acelera su metabolismo, como se ilustra por la menor esperanza de vida en comparación con las moscas envejecidos a 25 ° C. Sina vez que los estudios de la transcripción y metabólico se realiza en las moscas envejecidas a temperatura elevada, se puede esperar para ver cambios importantes en vías de estrés celular y el metabolismo de la energía. Esto es por qué es tan importante para introducir dos controles para el experimento, uno de los no patógenos Atnx3-27Q y un control sin relación expresa LacZ. Estos controles se proporcionan una base para la expresión de genes y cambios metabólicos asociados a la temperatura elevada de manera que se pueden identificar esos cambios directamente vinculada a la expresión de Atxn3 tóxicos. En general, se han introducido varias modificaciones en la colección de moscas que proporcionan numerosas ventajas – y algunas desventajas (problemas con la temperatura y el párrafo siguiente) – para estudiar inicio adulto, enfermedades progresivas.
Aunque la regulación temporal con GAL80 ts fue una adición útil, también introdujo una complicación inesperada. Mientras que la generación de las moscas que llevan tanto GAL80 ts unnd da-Gal4 construcciones en una población estable, notamos que vuela por partida doble homocigotos para ambas construcciones son viables pero estéril. Desde homocigotos GAL80 y cepas ts-da Gal4 fueron viables y fértiles, por sí mismas, no está claro por qué la combinación muestra baja fertilidad. Se ha sabido por algún tiempo que Gal4 es ligeramente tóxico para Drosophila tejidos 22. Es posible, entonces, que la expresión heteróloga de la levadura GAL80 represor transcripcional contribuido a la toxicidad de Gal4 al interferir, potencialmente, con la maquinaria transcripcional endógeno. Esta toxicidad puede ser exacerbada por la distribución ubicua de Gal4 bajo el control del da, un gen que juega un papel clave en el desarrollo temprano y determinación sexual. Independientemente de las causas subyacentes de la esterilidad, ampliamos la ts GAL80, da-Gal4 moscas mediante el mantenimiento de un cromosoma equilibrador sobre da-Gal4, manteniendo el homozygosity para GAL80 t s, lo que sugiere que Gal4 es un contribuidor más crítico para la esterilidad. Esta solución era clave porque se utilizó cientos de estos machos cada dos semanas para cruzar con cada uno de los transgenes UAS. Sin embargo, cruza la realización de un equilibrador creado un trabajo adicional durante la selección de la progenie apropiada. Sólo un cuarto (25%) de la progenie se recogió (hembras, no equilibrador), lo que añade tiempo de selección, reducido el rendimiento por botella, y aumentó el número de botellas necesarias para obtener al menos 200 moscas por genotipo / repetición / tiempo punto. En general, aunque la colección de moscas se convirtió en mucho tiempo debido a los grandes conjuntos necesarios, estamos seguros de que el estudio de los cambios celulares sólo unas pocas horas después de encender la expresión de genes patógenos ubicuamente identificará procesos novedosas e interesantes implicados en la pérdida neuronal progresiva.
Una vez que el diseño genético estaba en su lugar, se prestó especial atención a lamanipulaciones experimentales que podrían introducir variabilidad biológica. En primer lugar, sólo se recogen las hembras vírgenes para garantizar la homogeneidad de las muestras, aunque esto significaba tirar machos y comprobación para la progenie de dos veces al día. Durante el envejecimiento, no más de 12 moscas se mantuvieron en el mismo vial para evitar el hacinamiento y estrés. También, antes de la congelación, las moscas se transfirieron a crioviales sin anestesia y se les permitió recuperarse de la transferencia durante 30 min. Estos factores aparentemente triviales pueden influir en la expresión génica y el metabolismo, la introducción de la variabilidad en el análisis final que no sería relevante para el experimento.
Para garantizar la calidad de los materiales congelados (cabezas, ARN, y metabolitos), se prestó especial atención a cada detalle que puede contribuir a la degradación del tejido. Dado que las moscas se transfieren a crioviales en pequeñas cantidades (hasta 12 moscas por vial), teníamos que recuperar muchos frascos para la recogida de 200 cabezas. Estas manipulaciones eran duno con un cuidado extremo en una habitación fría con hielo seco y nitrógeno líquido. La colección de moscas, la separación de las cabezas, y la purificación de moléculas informativas consume demasiado tiempo para descubrir que el material se degradó al final de este largo proceso. Además de asegurar que el material mantiene su calidad, este protocolo se describen varios pasos que maximizan el rendimiento de ARN y metabolitos, incluyendo el secado por congelación y el golpeo de bolas. Estos pasos no son necesarios para las extracciones normal para RT-PCR o PCR cuantitativa a partir de moscas enteras, pero son críticos para la purificación consistente de muestras pequeñas tales como cabezas de moscas. Se determinó que otros pasos afectar el rendimiento de ARN. Por ejemplo, los mayores moscas producen RNA significativamente menos que los más jóvenes moscas, independientemente del genotipo. Esta observación sugiere que el envejecimiento a alta temperatura induce cambios dramáticos. Además, la extracción de RNA a partir de 100 cabezas era en realidad más eficiente que la de 200 cabezas, por lo que se procedió a purificar en dos batches de 100 por muestra, sólo para combinarlos después de la verificación de la calidad con el Bioanalyzer. Además, las columnas de purificación de ARNm parecía saturar fácilmente, por lo que la cantidad de RNA total utilizado por columna tiene que ser optimizado.
Los metabolitos son una mezcla diversa de moléculas pequeñas, por lo que el control de calidad es más difícil que con el ADN, ARN o proteínas. Desafortunadamente, no existe un catálogo completo de metabolitos para cualquier modelo animal en ese momento, algo que podría cambiar en los próximos años gracias a la aplicación de algunas de las diversas innovaciones tecnológicas, como la espectroscopía de RMN y la ampliación del uso de la cromatografía líquida – espectrometría de masas ( LC-MS). Aunque la RMN es menos sensible que la MS, que muestra muchas ventajas prometedoras, incluyendo sin destrucción de las muestras, no hay procedimientos analíticos que introducen sesgo (LC), y alta reproducibilidad que permite la comparación estadística de repeticiones y de varias condiciones experimentales 24. Así, la muestra puede serensayarse para verificar las observaciones o re-analizaron por LC-MS para validar los datos de RMN. A continuación, mostramos los datos preliminares de RMN de moscas que estamos utilizando para compilar un catálogo de metabolitos en Drosophila. Esta información será fundamental para determinar cómo la expresión de los genes de patógenos altera el metabolismo normal, se abre una nueva ventana para promover la comprensión de los mecanismos celulares que subyacen a las enfermedades neurodegenerativas.
Recientemente las nuevas tecnologías ómicas ofrecen la mejor oportunidad para estudiar las enfermedades neurodegenerativas en un nivel de detalle no alcanzado anteriormente. Tal vez el mayor obstáculo a superar en estos estudios de alto rendimiento es la colección de muestras reproducibles fieles que pueden ser analizados con métodos altamente sensibles. Los procedimientos presentados aquí proporcionan una manera de lograr esta coherencia, y dará lugar a resultados que pueden ser fácilmente comparados a través de conjuntos de datos. Aunque nuestros intereses de investigación principales involucrados que examinan los cambios del gen expressiones y metabolitos, las moscas generados también podría ser sometido a análisis proteómico o epigenómico. Cambios proteómicos y epigenómico que ocurren durante la neurodegeneración también es probable que sea de suma importancia para el proceso de la enfermedad. Cuando la comunidad científica en última instancia identifica el espectro completo de los cambios moleculares que afectan al proceso de la enfermedad, una comprensión de los sistemas cierto nivel de la enfermedad será posible. En este nivel, la modificación de la enfermedad terapias finalmente emerger como una realidad.
The authors have nothing to disclose.
Estamos agradecidos a Janice Santiago, Gabriel Figueroa y José Herrera para la asistencia técnica y el Bloomington Drosophila Stock Center en la Universidad de Indiana para las poblaciones de moscas. DH y CW con el apoyo de fondos de la NSF-IOS-1.051.890. PF-F y LMM el apoyo de un Fondo Semilla de Oportunidades de la Universidad de Florida.
Reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Jazz mix Drosophila food | Fisher Scientific | AS-153 | |
Cryogenic Vials | Corning, Inc. | 430658 | |
Microtubes | Axygen | MCT-175-C-S | |
RNaseZap | Ambion | AM9786 | Treat all surfaces |
5/32″ grinding balls, stainless steel | OPS Diagnostics | GSS 156-5000-01 | |
TRIzol | Ambion | 15596018 | |
1-bromo-3-chloropropane | Sigma | B9673-200ML | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416-500 | |
DEPC-treated water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
DNase I | Promega | M6101 | |
RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Dynabeads mRNA Purification kit | Invitrogen | 610-06 | |
Conical Screw Cap Tubes | Fisher Scientific | 02-681-344 | |
Screw Caps w/O-Rings | Fisher Scientific | 02-681-364 | |
2.0 mm Zirconia beads | BioSpec Products | 11079124zx | |
Methanol, HPLC-grade | Fisher Scientific | A4524 | |
Chloroform, HPLC-grade | Acros organics | AC39076 | |
Drosophila Stocks | |||
da-Gal4 | Bloomington Stock Center | 5460 | |
Gal80[ts] | Bloomington Stock Center | 7108 | |
UAS-MJD-27Q | Bloomington Stock Center | 8149 | |
UAS-MJD-78Q | Bloomington Stock Center | 8150 | |
UAS-LacZ | Bloomington Stock Center | 8529 | |
Equipment | |||
Inject+Matic Sleeper | INJECT+MATIC | ||
Microsieve Set | Fisher Scientific | 3410531 | Use two largest meshes |
Geno/Grinder 2000 | SPEX Sample Prep | SP2100-115 | |
Sorvall Legend Microcentrifuge | ThermoScientific | 75002436 | |
FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System | LabConco | 7670041 | |
BioAnalyzer v. 2.6 | Agilent | 2100 | |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 123-21D | |
NanoDrop spectrophotometer | ThermoScientific | ||
Fast Prep bead-beater | ThermoScientific | FP120 | |
Centrivap Vacufuge Plus | Labconco | 022820001 |