ビデオトラッキングソフトウェアによって分析されるマウスの短期および長期の自発運動

Summary

自発運動（LMA）は、マウスにおける行動のシンプルかつ簡単に行う測定である。ビデオトラッキングソフトウェア（VTS）とLMAのカップリングはLMA分析のマニュアル、ライン交差法と比較する場合は特に、特異性と感度の向上を可能にします。さらにVTSは、マウスLMAの長期的な追跡を可能にします。

Abstract

自発運動（LMA）は、マウスや他のげっ歯類での行動のシンプルかつ簡単に行う測定である。ビデオトラッキングソフトウェア（VTS）の改善が手動スコアに沿って交差法と比較して劇的に特異性及び感度を向上させる、LMA試験に結合されることを可能にしている。また、VTSは、ハイスループットな実験が可能となる。オープンフィールド試験（OFT）に使用される自動化されたビデオトラッキングに似ているが、LMAテストでは、それが彼らのホームケージに残ってマウスを可能にし、明暗の活動期の間に明るい照明の不安惹起刺激を利用していないという点でユニークですサイクル。長い移動の研究（時間·日）が頻繁に使用送信機とバイオテレメトリーを注入しているが、伝統的に、LMAは、時間（分）の短い期間に使用されています。リアルタイムで追跡するオプションが、長、短期のLMA試験と同様に、現在ビデオ撮影を用いて行うことができる。長期LMAテストは専門が必要ですしかし、容易に構築、ケージので食料や水（通常はケージの上部に配置されている）ビデオ撮影を妨げない。重要なのは、ビデオ撮影とVTSは、線交差および/またはバイオテレメトリーで測定することは困難または不可能であるようなマウスの移動経路などのパラメータの定量化が可能になります。要するに、VTSに結合されたLMA試験は、マウスの動きのより完全な説明および長期間にわたって運動を検査する能力を与える。

Protocol

1。短期LMAセットセットアップおよびプロシージャ

1. 短期LMAケージセットアップ
   1. シングル収容されたマウスのホームケージ内で短期LMAをテストします。 VTS依存の画像解析を容易にするために、マウスの色（白と黒マウスマウスのための光の色の寝具のためのすなわち 、暗い色の寝具）と高コントラストで寝具を使用しています。
   2. 適切な換気をサポートするための直径の穴で11×¼とプレキシグラスで明確¼の短期LMA試験、カバーケージ中。
2. 短期LMAの試験室
   1. 彼らは、少なくとも24時間⁸用に順応されているクリーンな環境でマウスをテストします。
   2. テスト環境を照らすために、赤の電球（<125ルーメン）と育雛器クランプライトを使用。ビデオ撮影に先立ち、プレキシグラスケージトップからグレアや反射を除去するためにライトの角度や位置を調整します。
   3. 部屋のノイズを削除するか、避ける70デシベル上。断続的なバックグラウンドノイズは、マウステスト中に避けられない場合、ホワイトノイズ発生器を使用してください。
   4. ケージの床は、ビデオ撮影中に露出している場合にケージは、ケージの寝具に似た色の肉屋やラボベンチ紙で試験室に配置されている際に、試験表面を覆う。
3. 短期LMAビデオ撮影
   1. センターと試験室での記録領域上のメモリを少なくとも120 GBの天井取り付けナイトビジョン対応のビデオカメラを配置。ビデオカメラのビューフレーム（Noldus情報技術（リーズバーグVA） などによるEthovision XT 7同時に、リアルタイムで8匹のマウスを追跡することができます）内にあまりにも多くのケージを配置することによって、使用VTSの分解能を超えないようにしてください。
4. 短期的なLMAの試験手順
   1. ライトサイクルのアクティブ/暗期中短期LMAをテストします。ライトサイクルの相対時間は番目であることを確認してくださいLMAが暗いサイクル¹の初期とそれ以降の期間中多くの活動と、薄暮のパターンを次のようにすべてのグループで同じ電子、。最小化さLMAの時間的差異の潜在的な影響を確実にするために記録されたマウスの各グループ内の両方の実験群と対照被験者を含める。
   2. 個別に家と順応マウスLMA試験⁸の開始前に少なくとも24時間。
   3. 直接カメラの下にケージの仕切りとケージを（個々のマウスを含む）を配置します。これはマウスのビュー（ 例えば 、マウスバローズは/ネスティング材料を使用して自身をカバーしている場合）妨害とVTS精度を妨げる可能性があるので、ケージからすべてのネスト/濃縮物質を取り除きます。記録された各ケージに明確なプレキシガラスの蓋を置きます。
   4. 同時に複数のケージをvideoingとき、解像度が選択されたVTSとの互換性があることを確認してください。 VTS分析を容易にするために、（ すなわち右上）各圧器内同じケージを配置する。
   5. 録音を開始します。任意の追加の非ビデオドキュメンテーションの独立したビデオの適切な識別を確実にするために、関連するすべての実験情報を識別スレートと各ビデオを開始します。 LMA試験（5-10分）の期間を追跡するためにタイマーやストップウォッチを使用してください。タイミング情報が失われた場合、ビデオ記録から回復する。
   6. 短期LMA法を用いた反復測定の場合、マウスは非測定間隔中に食料と水へのアクセスを許可。
   7. テスト中に、マウスの視力のように外部の視覚的な手がかりとして機能するようにしない任意の実験者を締め出す。
   8. テストが完了したら、不安様行動⁸の開発の可能性を低減するために、置き換える/ネスティング/濃縮材料を返す。
5. 短期LMA分析
   1. テストセッションから使用VTSと互換アーカイブメディアにビデオ録画を保存します。 Ethovision XT 7、ハードドライブディスクの（HDD）に使用されます。
   2. リアルタイムで映像を分析、それに関連付けられたメディアプレーヤーを使ってVTSにビデオを再生します。 図1において、検出変数があった2センチメートル/秒の追跡を開始し、1.75センチメートル/秒停止のトラッキング。
   3. 当初は、トラッキングのための関心領域（ROI）として全体をケージの床を選択します。このような接触走性の評価などの高度な分析については、複数のイントラケージのROIを作成します。
   4. 高スループット研究のために、個々のすべてのケージ床のROIと同時にビデオ内のすべてのケージを分析。
   5. （センチメートル）移動速度（メートル/秒）と運動の持続時間（秒）移動した総距離を計算するためにVTSを使用しています。 Ethovision XT 7は、ストレージおよび追加の分析のためにMicrosoft Excelに生成されたデータをエクスポートします。

2。長期LMAの設定テストと手順

1. 長期LMA試験ケージ建設
   1. 短期端壁で5.5センチメートル直径穴をカット標準のマウスケージの。亜鉛メッキスチールメッシュで¼穴用カバーを作成します。食品へのマウスへのアクセスを許可するように開口部のいくつかの½の作成、メッシュをカットします。シャープなエッジを削除するには、任意のカットメッシュを磨く。
   2. 直接5.5センチメートルの開口部をカバーするために使用メッシュに接続された外部ホッパーを作成するために追加のメッシュを使用してください。穴をカバーするために使用されるメッシュにホッパーを接続し、アルミリベットを使用してケージにアセンブリを取り付けます。
   3. 標準50ミリリットルコニカル（コーニング）、無ドリップシッパーチューブの挿入（STA-ピュアシステム）を可能にするために、過剰掘削される1穴ゴム栓（フィッシャー）から水のボトルを構築します。ベルクロテープ（3M）でケージに水のボトルを固定し、メッシュカバー開口部を通してシッパーチューブを挿入します。
   4. 適切な換気をサポートするための直径の穴で11×¼とプレキシグラスで明確¼との長期的なLMA試験、カバーケージ中。
2. 長期LMAの試験室
   1. セットアップ長期LMAの試験室では、短期的なLMAと同じです。手順については、セクション1.2を参照してください。
3. 長期LMAビデオ撮影
   1. センターと直接試験室における記録領域上記PCにリンクされ、天井に取り付けられた赤外線、セキュリティ·スタイル、カメラを配置。のみ使用VTSの能力の範囲内で個々のケージ解像度における結果（ 例えば Ethovision XT 7が同時にリアルタイムで8匹のマウスを追跡することができる）ことを一度にケージの数を記録します。
4. 長期のLMAの試験手順
   1. ライトサイクルのアクティブ/暗期中に長期LMAをテストします。 LMAが暗いサイクル¹の初期とそれ以降の期間中、より活性の薄暮パターンを次のように光のサイクルからの相対時間は、すべてのグループで同じであることを確認してください。電位の最小化を確実にするために記録された各群のマウスにおける実験群と対照被験者の両方をテストLMAの時間的差異の影響。
   2. 個別に家と、少なくとも24時間のために修飾されたケージのテストマウス順応。
   3. 直接カメラの下にケージの仕切りとケージを（個々のマウスを含む）を配置します。マウスの視点遮るものを確保するためにケージからすべてのネスト/濃縮材料を取り除きます。営巣材に穴を掘るのマウスは、マウスを追跡するVTSの能力に干渉します。記録するケージのそれぞれに明確なプレキシガラスの蓋を置きます。
   4. 一度に複数のケージを記録する場合、解像度が選択されたVTSとの互換性があることを確認してください。各分周器内同一VTS分析、位置ケージを緩和する（ すなわち右上）。
   5. 長期的LMA試験は、一般に、リアルタイムで分析され、ビデオ記録は、通常、作成されない。ビデオ記録は、二次カメラを使用して、または主カメラに連結されたDVDレコーダを介して記録することができる。個々の詳細な記録を維持することを確認してくださいマウスおよびグループ情報。
   6. リアルタイム分析のためにVTSを設定します。全体のケージの床は、追跡のためにROIを包含する必要があります。記録されているすべてのケージのためのROIを設定します。 （センチメートル）移動速度（メートル/秒）と運動の持続時間（秒）移動した総距離を計算するためにVTSを使用しています。 図2では、検出変数があった2センチメートル/秒の追跡を開始し、1.75センチメートル/秒停止のトラッキング。
   7. マウス長期LMAの記録を開始。解析用コンピュータに関連付けられている時計を介して長期LMAテストの継続時間を監視します。
   8. テスト中に、マウスの視力のように外部の視覚的な手がかりとして機能するようにしないすべての実験を保つ。
   9. テストが完了したら、不安様行動⁸の開発の可能性を低減するために、置き換える/ネスティング/濃縮材料を返す。
5. 長期LMA分析
   1. 長期的LMA分析は、ビデオ記録が発生することなくリアルタイムで発生する。 Ethovision XT 7を使用している場合は、ストレージおよび分析のためのMicrosoft Excelにデータをエクスポートします。
   2. 長期LMA用ビデオ記録を生成するには、二次的なカメラを使用しています。セカンダリカメラが潜在的に長い記録（s）を格納するのに十分な十分なストレージ容量を持っていることを確認してください。

Representative Results

反復測定の結果の一例を、短期的なLMA試験は、図1に示されている。この図は、リポポリサッカライド（LPS）投与後、マウスが速く、周囲の環境ケージング^（AEC）6に収容されたマウスよりも短期的な運動活性を回復個別換気ケージ（IVC）に収容されていることを示しています。自発運動の初期損失はLPS注入群間で類似していますが、基礎LMAに回復がIVC-収容されたマウスにおけるより急速では、移動速度（ 図1b）や動き（ 図1c）の期間であった。この短期LMA試験と反復測定モデルの使用は、異なるグループ間で時間をかけて観察し、回復の比較を可能にする。

長期のLMA試験例を図2に示されている。この図は、2つの独立したが、連続した日間毎日検査の12時間の間に、マウスの移動を示しています。有意のdiffeん距離のrenceます（ 図2a）、移動、移動速度（図2b）、または運動の持続時間は（ 図2c）は、これらの2日間（未発表パイロットデータ）との間で発見された。小さなサンプルサイズに起因する誤差の有意な量があるが、これらの結果は、長期的な運動研究のための電位が移植を必要とせずに行うことができるように、一貫した反復可能なデータが連続日にわたって発生させることができることを示すトランスミッタとバイオテレメトリー。力不足が、距離の2日差対1日は運動の時間（ 図2c）ではなく速度の差（ 図2b）に相違が原因で表示されます（ 図2a）に移動。

PG "/>
図1。周囲環境のケージ（AEC）、個別換気ケージ（IVC）に収容されたマウスにおける自発運動のLPS誘導損失。AECまたはIVC住宅のいずれかから、グループに収容されたマウス（ケージあたり4）は、単独で短期LMAの開始前に収容されたテスト。マウスを、LPS（100μgの/ kg）及び移動の（a）は、距離（センチメートル）移動し、（b）は速度（メートル/秒）を注射し、（c）に移動（複数可）の持続時間が示さ時点で評価した。結果はパーセントベースライン（プリLPS）LMAとして表され、±SEM、N = 6が意味しています。距離は、主効果移動：時間（F（3,77）= 13.08、P <0.01）、住宅のタイプ（F（1,77）= 3.69、P = 0.06）、時間をX住宅型相互作用（F（3,77） = 3.31、P = 0.02）。移動速度主効果：時間（F（3,77）= 13.08、P <0.01）、住宅のタイプ（F（1,77）= 3.69、P = 0.06）、時間Xハウジングるタイプの相互作用（F（3,77）= 3.31、P = 0.0243）。運動の期間は、主効果：時間（F（3,77）= 12.92、P <0.01）、住宅のタイプ（F（1,77）= 0.69、P = 0.41）、時間X住宅型相互作用（F（3,77 ）= 3.26、P = 0.03）。共通の上付き文字なしで個々の時点内にバーが（P <0.05）が有意に異なっています。 脳BEHAV：＃より転載。そして3269。、26（6）、ヨーク、JM ら 、個別換気ケージはエルゼビアの許可を得て、血液学的および行動慢性低品位低酸素影響マウス、951から958まで、著作権2012を引き起こす。 より大きい数字を表示するにはここをクリック 。

load/50252/50252fig2.jpg "/>
図2。マウス長期LMA。グループ収容さマウス（ケージあたり4）は、単独で長期LMA試験の開始前に飼育した。マウスLMAは、12時間（1日目）のためにリアルタイムで分析し、同マウスでは1日後（2日目）であった。結果は、動き（A）の合計距離（センチメートル×1,000）を移動させ、（b）は速度（メートル/秒）及び（c）移動の持続時間（秒×1,000）の平均±SEM、n = 4で（有意差として表される0〜24時間）の間に（未発表パイロットデータ）。

Discussion

マウスでの病気の症状は無気力、社会的、環境的な環境への関心の喪失、倦怠感や食欲不振^2-3が含まれ^ています。マウスおよび他のげっ歯類においては、LMAは、免疫活性化後の^4-5病気を評価するために使用することができる。さらに、長期的LMAは概日行動や睡眠/覚醒パターンの乱れで治療誘発性の変化の分析を可能にし、24時間（またはそれ以上）にわたって動きを追跡する機能を提供しています。それは非侵襲的であるため、LMAは簡単に反復測定または連続法として行われ、最小限交絡で、病気のために他の試験に比べていくつかの利点を提供しています。複数のケージを同時に記録/分析することができるので、他の方法およびシステム（ 例えば Phenotyper、Intellecage、photobeamシステム）、VTSとLMA分析と比べて比較的安価である。ここで利用されていないが、飼育およびクライミングのようなLMA活動のさらなる分析は、の使用によって達成することができるサイドマウントカメラ。 VTSで、LMAは、適応高スループットである。 VTSは、また時間、距離、速度、および路⁵の決定を含む運動のより徹底的な検査を可能にします。それが不安行動の基礎となるので、パス追跡は特に強力です。

その多くの利点にもかかわらず、VTSとLMAへの潜在的な落とし穴固有のは、最大の分離/マウスの単一のハウジング（そしておそらく超過）24時間である。社会的孤立は、ストレス応答と侵略長引く^11を誘導することができる。調べでは、この制限を認識し、適切な実験制御、結果の解釈を確保するための措置をとるべきである。

マウスLMAを含むすべての行動試験の間、プレ実験的配慮に細心の注意では、一貫した結果を達成するために重要です。試験室とテストケージ環境への順応が不可欠である。異常な騒音、光と音、特にinterfeです彼らは^7-8驚愕反応、および/ ​​または不安の挙動を引き起こす可能性があるリング。理想的には、LMA試験は、悪臭（特に天敵の臭い）を無料で温度と湿度管理された環境で発生する必要があります。時間（日）の長時間動物の収容が可能に固定された行動テストスイートが望ましい。繰り返されるテストが老化や慢性疾患の研究に非常に有用であるため、動物のケア施設にマウスを返す能力が有利である。

ほとんどすべてのそのような試験は、マウスの動きを必要とするため、最終的に、LMAテストは、他のほぼすべての行動試験と併せて行われるべきである。認知のためのLMAの影響試験（バーンズ迷路、Y迷路、T迷路、小説物体認識）、不安様行動（ゼロ迷路、オープンフィールド）、快楽を求める（ホイールが動作して）、うつ病のような行動を（ショ糖/サッカリン嗜好摂動）や病気（引きこもりと穴を掘る^）8-9。短期およびlをテストしオング長期LMA、マウスのサブ系統間の表現型の違い¹⁰かなりその後の行動テストに影響を与えないが、遺伝子型と疾患/介入モデルが急速に評価することができます。重要な動きの違いが識別された場合さらに、適切な措置は、それらが誘発する固有の交絡によって制限され、より複雑な行動テストの制定に先立って撮影することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Sony	HDR-XR500V	Other, similar video cameras may work as well. The file storage format (codec/container) must be compatible with the VTS used. It is recommended when initially establishing a VTS to choose the VTS first and work with the vendor in choosing an appropriate camera, especially with respects to file format and video resolution compatibility.
Opaque cage dividers			Custom fabricated based on specific cage dimensions. To facilitate image analysis, dividers should be of a similar color to the cage bedding. Structurally fixed dividers are preferrable because they speed setup between multi-mice experiments, such as those involving repeated measurements. Sturdy transportable cage dividers can be constructed of 1/2 inch opaque plastic and joined via a series of cross laps.
Light or Dark bedding (opposite of mouse coat color)			Available from several laboratory animal supply distributors, depending on location.
Clear Plexiglas cage tops			Custom fabricated based on cage dimensions.
Automated video tracking software (EthoVision XT 7)	Noldus Information Technology		A variety of VTS manufacturers exist, use of other software may suffice.
PC	Dell Inc.		See VTS software providers minimum PC .requirements
White noise generator	Dohm	DS	A variety of white noise generators are available, depending on need.
Brooder clamp lights with red light bulbs			Several sizes and styles available. Number required depends on room size/lighting needs. Do not exceed 125 lumens in the testing room.
Lab bench or butcher paper			Paper should match or be very similar in color to the cage bedding.