Lokalisering og fordeling av proteiner gir viktig informasjon for å forstå deres cellulære funksjoner. Den overlegne romlig oppløsning av elektronmikroskopi (EM) kan brukes til å bestemme den subcellulære lokalisering av en gitt antigen etter immunhistokjemi. For vev i sentralnervesystemet (CNS), bevare strukturell integritet samtidig opprettholde antigenisitet har vært spesielt vanskelig i EM studier. Her har vi adoptert en prosedyre som har blitt brukt til å bevare strukturer og antigener i CNS å studere og karakterisere synaptiske proteiner i rotte hippocampus CA1 pyramidale nevroner.
Immunoelectron mikroskopi er et kraftig verktøy for å studere biologiske molekyler på subcellulære nivå. Antistoffer koblet til elektron-tette markører som kolloidalt gull kan avsløre lokalisering og fordeling av spesifikke antigener i forskjellige vev 1. De to mest brukte teknikkene er pre-embedding og post-embedding teknikker. I pre-embedding immunogold-elektron mikroskopi (EM) teknikker, må vev permeabilized å tillate antistoff penetrasjon før det er innebygd. Disse teknikkene er ideelle for å bevare strukturer, men dårlig penetrasjon av antistoffet (ofte bare de første få mikrometer) er en betydelig ulempe 2. Post-innebygging merking metoder kan unngå dette problemet, fordi merking foregår på deler av faste vev der antigener er lettere tilgjengelig. Gjennom årene har en rekke modifikasjoner forbedret post-innebygging metoder for å forbedre immunoreaktivitet og for å bevare ultrastructure <sup> 3-5.
Tissue fiksering er en viktig del av EM studier. Fiksativer kjemisk tverrbinde de makromolekyler å låse vevsstrukturer på plass. Valget av bindemiddel påvirker ikke bare strukturelle bevaring, men også antigenisitet og kontrast. Osmiumtetroksyd (OSO 4), formaldehyd og glutaraldehyd har vært standard fiksativer i flere tiår, herunder for sentralnervesystemet (CNS) vev som er spesielt utsatt for strukturell skade under kjemiske og fysisk behandling. Dessverre er OSO 4 svært reaktiv og har vist seg å maskere antigener 6, som resulterer i dårlig og utilstrekkelig merking. Alternative tilnærminger for å unngå kjemisk fiksering inkluderer frysing av vev. Men disse teknikkene er vanskelig å utføre og krever kostbar instrumentering. Å ta opp noen av disse problemene og for å forbedre CNS vev merking, Phend et al. erstattet OSO 4 med uranyl acetate (UA) og tannic ACId (TA), og hell innført ytterligere modifikasjoner for å forbedre følsomheten av antigen deteksjon og strukturell bevaring i hjernen og ryggmargen vev 7. Vi har vedtatt dette osmium-free post-embedding metode for å rotte hjernevev og optimalisert immunogold merking teknikk for å oppdage og studere synaptiske proteiner.
Vi presenterer her en metode for å bestemme lokalisering av ultrastructural synaptiske proteiner i rotte hippocampus CA1 pyramidale neuroner. Vi bruker organotypic hippocampus dyrkede skiver. Disse skivene opprettholde trisynaptic krets av hippocampus, og således er spesielt nyttige for å studere synaptisk plastisitet, en mekanisme allment antatt å underlie læring og hukommelse. Organotypic hippocampus stykker fra postnatal dag 5 og 6 mus / rotteunger kan fremstilles som beskrevet tidligere 8, og er spesielt nyttige til akutt knockdown eller overuttrykker eksogene proteiner. Vi har tidligere brukt denne protokollen til characterize neurogranin (Ng), en neuron-spesifikk protein med en avgjørende rolle i å regulere synaptic funksjon 8,9. Vi har også brukt den til å karakterisere ultrastructural lokalisering av calmodulin (CAM) og Ca 2 + / CAM-avhengig protein kinase II (CaMKII) 10. Som illustrert i resultatene, tillater denne protokollen god ultrastructural bevaring av dendrittiske spines og effektiv merking av Ng som hjelper karakterisere sin fordeling i ryggraden 8. Videre kan fremgangsmåten som er beskrevet her har bred anvendelighet i å studere mange andre proteiner involvert i nevronale funksjoner.
I denne protokollen, har vi innført Phend og Weinberg metode for hjernen og ryggmargen vev for å studere dendrittiske spines i rotte hippocampus skive kulturer. Dendrittiske spines i hippocampus CA3-CA1 området er skjøre strukturer som inneholder et stort utvalg av proteiner som spiller viktige roller i å regulere nevrale funksjoner. Den presenterte fremgangsmåte gir et balansert tilnærming for å oppnå forbedret antigenisitet samtidig opprettholde god ultrastructural bevaring (figur 2A), som ti…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Matthew Florence for utarbeidelse av hippocampus skive kulturer. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra US National Institute on Aging og Alzheimers Association til NZG.
NAME OF REAGENT | COMPANY | CATALOG NUMBER | |
60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |