Pós-incorporação de Etiquetagem immunogold de proteínas sinápticas em culturas de hipocampo
Summary
A localização e distribuição das proteínas fornecem informações importantes para a compreensão de suas funções celulares. A resolução espacial superior, de microscopia electrónica (ME) pode ser usado para determinar a localização subcelular de um dado antigénio imuno sequência. Para tecidos do sistema nervoso central (SNC), preservando a integridade estrutural durante a antigenicidade manutenção tem sido particularmente difícil em estudos de EM. Aqui, adoptar um procedimento que tem sido utilizada para preservar as estruturas e os antigénios do SNC para estudar e caracterizar proteínas sinápticas no hipocampo de ratos neurónios CA1 piramidais.
Abstract
Imunomicroscopia é uma ferramenta poderosa para estudar moléculas biológicas em nível subcelular. Anticorpos acoplados a marcadores densos em electrões, tais como ouro coloidal podem revelar a localização e distribuição de antigénios específicos em diversos tecidos 1. As duas técnicas mais utilizadas são as técnicas de incorporação de pré-e pós-incorporação. Na incorporação de pré-imuno-microscopia eletrônica (ME) técnicas, o tecido deve ser permeabilizadas para permitir a penetração de anticorpos antes de ser incorporado. Estas técnicas são ideais para a preservação de estruturas, mas uma fraca penetração do anticorpo (geralmente apenas os primeiros poucos micrómetros) é um inconveniente considerável 2. Os métodos de pós-incorporação de rotulagem pode evitar este problema, porque rotulagem ocorre em seções de tecidos fixos onde os antígenos são mais facilmente acessíveis. Ao longo dos anos, um número de modificações têm melhorado os métodos de incorporação pós-para aumentar a imunorreactividade e para preservar a ultraestrutura <sup> 3-5.
Fixação do tecido é uma parte crucial de estudos EM. Fixadores quimicamente ligações cruzadas das macromoléculas para bloquear as estruturas de tecidos no seu lugar. A escolha de fixador afeta não só a preservação, mas também estrutural antigenicidade e contraste. Tetróxido de ósmio (OsO4), formaldeído, glutaraldeído e têm sido os fixadores padrão ao longo de décadas, incluindo para o sistema nervoso central (SNC), os tecidos que são especialmente propensas a danos estruturais durante processamento químico e físico. Infelizmente, OsO 4 é altamente reactivo e tem sido demonstrado que mascaram os antigénios 6, resultando na rotulagem pobre e insuficiente. Abordagens alternativas para evitar a fixação química incluem o congelamento dos tecidos. Mas estas técnicas são de difícil execução e exigem instrumentação dispendiosa. Para resolver alguns desses problemas e para melhorar a rotulagem SNC tecido, Phend et al. substituído OsO 4 com acetato de uranila (UA) e ACI tânicod (TA), e introduzidos com sucesso modificações adicionais para melhorar a sensibilidade da detecção de antigénio e preservação estrutural em tecidos cerebrais e da medula espinal 7. Adotamos este método ósmio livre de pós-incorporação ao tecido cerebral de ratos e otimizou a técnica de rotulagem immunogold para detectar e estudar proteínas sinápticas.
Apresentamos aqui um método para determinar a localização ultra-estrutural de proteínas sinápticas em ratos hipocampais CA1 neurônios piramidais. Utilizamos fatias organotípicas de hipocampo cultivadas. Estas fatias de manter o circuito trisynaptic do hipocampo, e, portanto, são especialmente úteis para o estudo da plasticidade sináptica, um mecanismo muito pensou ser a base de aprendizagem e memória. Organotípicas de fatias de hipocampo pós-natais dias 5 e 6 de ratinho / rato pups pode ser preparado como descrito anteriormente 8, e são especialmente úteis para agudamente knockdown ou superexpressam proteínas exógenas. Nós já usou este protocolo para characterize neurogranin (Ng), uma proteína específica para neurónios, com um papel crítico na regulação da função sináptica 8,9. Temos também utilizado para caracterizar a localização ultraestrutural da calmodulina (CaM), e Ca2 + / CaM proteína-quinase dependente de II (CaMKII) 10. Como ilustrado nos resultados, este protocolo permite a preservação ultraestrutural bom das espinhas dendríticas e rotulagem eficiente de Ng para ajudar a caracterizar a sua distribuição na coluna 8. Além disso, o procedimento aqui descrito pode ter uma ampla aplicabilidade no estudo de muitas outras proteínas envolvidas em funções neuronais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, adotamos o método Phend e Weinberg para o cérebro e nos tecidos da medula espinhal para estudar espinhas dendríticas em culturas de ratos hipocampo fatia. Espinhas dendríticas na área CA3-CA1 do hipocampo são delicadas estruturas que contêm uma grande variedade de proteínas que desempenham papéis importantes na regulação de funções neuronais. O método apresentado fornece uma abordagem equilibrada para alcançar antigenicidade melhorada, mantendo boa preservação ultraestrutural (F…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Matthew Florença para preparação das culturas de hipocampo. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional dos EUA sobre Envelhecimento e Associação de Alzheimer de NZG.
Materials
| NAME OF REAGENT | COMPANY | CATALOG NUMBER | |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
References
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
- Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
- Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
- Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
- Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
- Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
- Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
- Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
- Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
- Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
- Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
- Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5′-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 .
- Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
- Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
- Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, (1992).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
- Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
- Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
- Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , 383-426 (1999).
