Summary

Pós-incorporação de Etiquetagem immunogold de proteínas sinápticas em culturas de hipocampo

Published: April 03, 2013
doi:

Summary

A localização e distribuição das proteínas fornecem informações importantes para a compreensão de suas funções celulares. A resolução espacial superior, de microscopia electrónica (ME) pode ser usado para determinar a localização subcelular de um dado antigénio imuno sequência. Para tecidos do sistema nervoso central (SNC), preservando a integridade estrutural durante a antigenicidade manutenção tem sido particularmente difícil em estudos de EM. Aqui, adoptar um procedimento que tem sido utilizada para preservar as estruturas e os antigénios do SNC para estudar e caracterizar proteínas sinápticas no hipocampo de ratos neurónios CA1 piramidais.

Abstract

Imunomicroscopia é uma ferramenta poderosa para estudar moléculas biológicas em nível subcelular. Anticorpos acoplados a marcadores densos em electrões, tais como ouro coloidal podem revelar a localização e distribuição de antigénios específicos em diversos tecidos 1. As duas técnicas mais utilizadas são as técnicas de incorporação de pré-e pós-incorporação. Na incorporação de pré-imuno-microscopia eletrônica (ME) técnicas, o tecido deve ser permeabilizadas para permitir a penetração de anticorpos antes de ser incorporado. Estas técnicas são ideais para a preservação de estruturas, mas uma fraca penetração do anticorpo (geralmente apenas os primeiros poucos micrómetros) é um inconveniente considerável 2. Os métodos de pós-incorporação de rotulagem pode evitar este problema, porque rotulagem ocorre em seções de tecidos fixos onde os antígenos são mais facilmente acessíveis. Ao longo dos anos, um número de modificações têm melhorado os métodos de incorporação pós-para aumentar a imunorreactividade e para preservar a ultraestrutura <sup> 3-5.

Fixação do tecido é uma parte crucial de estudos EM. Fixadores quimicamente ligações cruzadas das macromoléculas para bloquear as estruturas de tecidos no seu lugar. A escolha de fixador afeta não só a preservação, mas também estrutural antigenicidade e contraste. Tetróxido de ósmio (OsO4), formaldeído, glutaraldeído e têm sido os fixadores padrão ao longo de décadas, incluindo para o sistema nervoso central (SNC), os tecidos que são especialmente propensas a danos estruturais durante processamento químico e físico. Infelizmente, OsO 4 é altamente reactivo e tem sido demonstrado que mascaram os antigénios 6, resultando na rotulagem pobre e insuficiente. Abordagens alternativas para evitar a fixação química incluem o congelamento dos tecidos. Mas estas técnicas são de difícil execução e exigem instrumentação dispendiosa. Para resolver alguns desses problemas e para melhorar a rotulagem SNC tecido, Phend et al. substituído OsO 4 com acetato de uranila (UA) e ACI tânicod (TA), e introduzidos com sucesso modificações adicionais para melhorar a sensibilidade da detecção de antigénio e preservação estrutural em tecidos cerebrais e da medula espinal 7. Adotamos este método ósmio livre de pós-incorporação ao tecido cerebral de ratos e otimizou a técnica de rotulagem immunogold para detectar e estudar proteínas sinápticas.

Apresentamos aqui um método para determinar a localização ultra-estrutural de proteínas sinápticas em ratos hipocampais CA1 neurônios piramidais. Utilizamos fatias organotípicas de hipocampo cultivadas. Estas fatias de manter o circuito trisynaptic do hipocampo, e, portanto, são especialmente úteis para o estudo da plasticidade sináptica, um mecanismo muito pensou ser a base de aprendizagem e memória. Organotípicas de fatias de hipocampo pós-natais dias 5 e 6 de ratinho / rato pups pode ser preparado como descrito anteriormente 8, e são especialmente úteis para agudamente knockdown ou superexpressam proteínas exógenas. Nós já usou este protocolo para characterize neurogranin (Ng), uma proteína específica para neurónios, com um papel crítico na regulação da função sináptica 8,9. Temos também utilizado para caracterizar a localização ultraestrutural da calmodulina (CaM), e Ca2 + / CaM proteína-quinase dependente de II (CaMKII) 10. Como ilustrado nos resultados, este protocolo permite a preservação ultraestrutural bom das espinhas dendríticas e rotulagem eficiente de Ng para ajudar a caracterizar a sua distribuição na coluna 8. Além disso, o procedimento aqui descrito pode ter uma ampla aplicabilidade no estudo de muitas outras proteínas envolvidas em funções neuronais.

Protocol

1. Fixação Fixadores são cancerígenas; usar luvas e lidar com os fixadores em uma coifa. Salvo indicação em contrário, todas as incubações são realizadas em gelo e todas as soluções devem ser filtrados antes da utilização. Use microscopia eletrônica de grau de reagentes. Dia 1 Após condições experimentais (por exemplo, injecção viral, o tratamento medicamentoso), colocar a membrana com organotípicas de fa…

Representative Results

A Figura 2B mostra um exemplo de distribuição de moléculas endógenas Ng nas espinhas dendríticas de CA1 do hipocampo neurónios piramidais. Grelhas de níquel com ultrafinas (60 nm) contendo tecidos CA1 região do hipocampo (como pode ser visto na Figura 2A) foram cobertos em 1% T / PB, 50 mM de glicina, e depois bloqueadas com BSA a 2,5% e 2,5% de soro, antes da incubação com anti Ng-anticorpo. Após a lavagem com T / PB, grelhas foram então cobertas com anticorpo anti-coelho s…

Discussion

Neste protocolo, adotamos o método Phend e Weinberg para o cérebro e nos tecidos da medula espinhal para estudar espinhas dendríticas em culturas de ratos hipocampo fatia. Espinhas dendríticas na área CA3-CA1 do hipocampo são delicadas estruturas que contêm uma grande variedade de proteínas que desempenham papéis importantes na regulação de funções neuronais. O método apresentado fornece uma abordagem equilibrada para alcançar antigenicidade melhorada, mantendo boa preservação ultraestrutural (F…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer a Matthew Florença para preparação das culturas de hipocampo. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional dos EUA sobre Envelhecimento e Associação de Alzheimer de NZG.

Materials

NAME OF REAGENT COMPANY CATALOG NUMBER
60 x 15 mm polystyrene Petri dish Falcon 351007
Disposable scalpel EXELINT 29552
Cell culture inserts Millipore PICM03050
10 nm Goat-anti-rabbit gold Electron Microscopy Sciences 25108
Anti-Neurogranin antibody Millipore AB5620
100% Picric acid Electron Microscopy Sciences 19550
96% Paraformaldehyde Acros Organics AC41678-0030
25% Glutaraldehyde (EM grade) Sigma G5882
Uranyl acetate Electron Microscopy Sciences 22400
p-Phenylenediamine Sigma P6001
Platinum (IV) chloride Sigma 379840
Tannic acid Electron Microscopy Sciences 21710

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Cite This Article
Zhong, L., Brown, J. C., Wells, C., Gerges, N. Z. Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures. J. Vis. Exp. (74), e50273, doi:10.3791/50273 (2013).

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