Summary

الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

Published: June 01, 2014
doi:

Summary

نقدم طريقة الفحص السريع وغير مكلفة لتحديد المنظمين النسخي باستخدام عالية الإنتاجية transfections الروبوتية ومحلية الصنع مزدوج توهج luciferase الفحص. هذا البروتوكول يولد بسرعة البيانات المباشرة وظيفية جنبا إلى جنب منذ آلاف الجينات وقابل للتعديل بسهولة لاستهداف أي الجينات في المصالح.

Abstract

نقدم بروتوكول الفرز الفائق الإنتاجية السريع وغير مكلفة لتحديد المنظمين النسخي ألفا synuclein، جين يرتبط مرض باركنسون. و transfected الخلايا 293T عابر مع البلازميدات من مكتبة التعبير ORF المحتشدة، جنبا إلى جنب مع البلازميدات مراسل luciferase، في شكل صفيحة ميكروسكوبية-جين واحد لكل جيدا. ويعاير يراعة luciferase النشاط بعد 48 ساعة لتحديد الآثار المترتبة على كل الجينات مكتبة على النسخ ألفا synuclein، تطبيع في التعبير من بناء الرقابة الداخلية (مروج HCMV توجيه Renilla luciferase المراسل). ومما يسهل هذا البروتوكول من قبل الروبوت مقعد بين كبار المغلقة في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، الذي يؤدي التعامل مع السائل العقيم في شكل 96 جيدا. لدينا بروتوكول ترنسفكأيشن الآلي هو قابلية للتكيف مع الإنتاجية العالية الإنتاج المكتبة lentiviral أو غيرها من بروتوكولات الفحص وظيفية تتطلب transfections من ثلاث أعداد كبيرة من البلازميدات مكتبة فريدة من نوعها في conjunction مع مجموعة مشتركة من البلازميدات المساعد. كما نقدم بديل رخيص الثمن وإجازة المتاحة تجاريا، مزدوج الكواشف luciferase المراسل الذي يعمل PTC124، EDTA، وبيروفسفات لقمع النشاط يراعة luciferase قبل قياس Renilla luciferase المراسل. باستخدام هذه الأساليب، ونحن فحص 7،670 الجينات البشرية، وحددت 68 من المنظمين ألفا synuclein. هذا البروتوكول هو قابل للتعديل بسهولة لاستهداف الجينات الأخرى ذات الاهتمام.

Introduction

القدرة على تحديد العناصر التنظيمية الوراثية الرئيسية والعوامل التي تعمل عليها أمر أساسي لاستكشاف العديد من العمليات البيولوجية. ومع ذلك، وتحديد العوامل التي تنظم التعبير عن الجينات في أنواع الخلايا نادرة، مثل السكان العصبية محددة، يمكن أن يكون تحديا. هنا، نقدم بروتوكول لتحديد المنظمين النسخي رواية ألفا synuclein (SNCA)، جين يرتبط مرض باركنسون وأعرب في الخلايا العصبية الدوبامين في substantianigra بارس المنطقة المكتنزة من الدماغ المتوسط. علينا أن ننجز هذا باستخدام عالية الإنتاجية، ثنائي luciferase المراسل، في المختبر شاشة مراسل لتفكيك ألفا synuclein التعبير في الخلايا 293T. يتم استنساخ المروج ألفا synuclein لأول مرة في البلازميد مراسل تحتوي على الجين يراعة luciferase. A البلازميد المتاحة تجاريا تحتوي على luciferase المراسل Renilla تحت سيطرة المروج النشط جوهري بمثابة الرقابة الداخلية. تساويبني مراسل ه شارك transfected-293T إلى خلايا في microplates مع البلازميدات من مكتبة الحمض النووي التعبير، مثل أن كل بئر يتم transfected مع البلازميد مكتبة واحدة. بعد 48 ساعة يتم قياس، luciferase النشاط لكل مراسل بالتتابع باستخدام الفحص المزدوج توهج. يستدل التعبير النسبية ألفا synuclein ردا على كل الجينات المكتبة عن طريق نسبة من يراعة: Renilla luciferase النشاط في كل بئر (F: نسبة R) بعد التطبيع القائم على طبق من ذهب.

يوفر هذا البروتوكول القدرة على فحص عدد كبير من الجينات (~ 2،500 في الأسبوع) لقدرتها على transactivate الجين مراسل باستخدام الحد الأدنى من القوة العاملة (1-2 أشخاص) والحد الأدنى من التكلفة (حوالي 3 دولار تكلفة كاشف لكل صفيحة ميكروسكوبية مقايسة). المنظمين النسخي الجينات العصبية (على سبيل المثال، ألفا synuclein)، والتي هي صعبة للدراسة في الخلايا العصبية مثقف الحرارية للتلاعب الجيني، يمكن مقارنة جنبا إلى جنب في هذا الاختبار وظيفية مباشرة. ندرج في منطقتنابروتوكول طريقة مفصلة لالاستنساخ ونمو البلازميدات تحتوي على مروج ألفا synuclein، منذ وجدنا أن البلازميدات تحتوي على هذه المنطقة غير مستقرة عندما نمت مع الإجراءات التقليدية (انظر المناقشة). نحن تشمل أيضا بديل غير مكلفة لمتاحة تجاريا الكواشف المزدوجة luciferase المراسل لفحوصات عالية الإنتاجية. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لاستهداف العناصر التنظيمية الأخرى ذات الاهتمام، أو إلى أي عملية تتطلب الإنتاجية العالية transfections عابرة.

Protocol

لمحة عامة التجريبية، انظر الشكل 1. 1. إعداد البلازميدات مراسل احتواء ألفا Synuclein المروج العناصر التنظيمية للجين ألفا synuclein (الشكل 2) تمتد ما يقرب من 10 كيلو بايت، من المنبع NACP (غير…

Representative Results

القيم النموذجية luciferase المراسل، F: وتظهر نسب القيم والحث R لفترة واحدة نصف لوحة في الشكل (4) لاحظ جيدا في ضرب H2، وهو محفز 32 أضعاف. سوف الجينات المسببة للسمية المفرطة (على سبيل المثال، وأيضا E3)، أو الآبار التي و transfected سيئة، وإنتاج القيم المنخفضة لكلا اليراع وluciferas…

Discussion

وقد تورط ألفا synuclein في مرض باركنسون (PD) كمكون من الهيئات ليوي الادراج داخل الخلايا تعتبر اصم لهذا المرض. وربطت العديد من الدراسات رابطة الجينوم على نطاق تعدد الأشكال النوكليوتيدات واحد في ألفا synuclein مع خطر متزايد لالمتفرقة PD 5،6،7. على الرغم من أن أقل شيوع?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر جون دارغا من MGH الحمض النووي الأساسية لإعداد مكتبة فحص الحمض النووي. قدم كريستوفر Chigas من بيركن إلمر دعما لا يقدر بثمن لدينا Wallac 1420 luminometer. قدم ستيفن Ciacco ومارتن Thomae من اجيلنت الدعم للروبوت برافو. نشكر رون جونسون وستيف تيتوس في المعاهد الوطنية للصحة لتوفير بسخاء المزدوج توهج بروتوكول luciferase الفحص الخاصة بهم.

Materials

Material
QIAQuick PCR Purification Kit Qiagen 28106
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K2100-12
PureLink PCR Micro Kit Invitrogen K310250
PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit Invitrogen K2100-03
PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K2100-07
Bravo Robot Agilent
Robot Pipet Tips with Filter Agilent 19477-022
Robot Pipet Tips without Filter Agilent 19477-002
Clear-bottomed 96-well Plates Corning 3610
Reservoirs Axygen RES-SW96-HP-SI
Polystyrene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651101
Polypropylene V-bottomed 96-well Plate Greiner 651201
Adhesive Plate Covers CryoStuff #FS100
Reagent
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
BAC 2002-D6 Invitrogen 2002-D6
Calf Intestine Alkaline Phosphatase Roche 10713023001
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
pGL4.10 Promega E6651
pGL4.74 Promega E6931
ElectroMAX Stbl4 Competent Cells Invitrogen 11635-018
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265-017
DMEM without Phenol Red Invitrogen 31053-028
Optifect Invitrogen 12579017
Ciprofloxacin CellGro 61-277-RF
Tris-Hydrochloride Powder Sigma 93287
Tris-Base Powder Sigma 93286
Triton X-100 Pure Liquid Fisher BP151-100
DTT Invitrogen 15508-013
Coenzyme A Nanolight 309
ATP Sigma A6419
Luciferin Invitrogen L2912
h-CTZ Nanolight 301
PTC124 SelleckBiochemicals S6003

References

  1. Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
  2. Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113 (5), 426-431 (2003).
  3. Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson’s disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).
  4. Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
  5. Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson’s disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).
  6. Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
  7. Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
  8. Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).
  9. Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).
  10. Chartier-Harlin, M. -. C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).
  11. Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson’s disease. Science. 302 (5646), 841 (2003).
  12. Ahn, T. -. B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).
  13. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
  14. Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
  15. Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).
  16. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
  17. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  18. Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
  19. Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).
  20. Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).
  21. Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).
  22. Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).

Play Video

Cite This Article
Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay. J. Vis. Exp. (88), e50282, doi:10.3791/50282 (2014).

View Video