आनुवंशिकी और प्रकाशिकी कि गठबंधन तंत्रिका विज्ञान उपकरणों की हाल ही में विकास, स्थानिक और अस्थायी समाधान का एक अभूतपूर्व स्तर के साथ तंत्रिका सर्किट गतिविधि पर नियंत्रण सक्षम बनाता है, "optogenetics" करार दिया. यहाँ हम प्रीफ्रंटल cortical और subicular पिरामिड न्यूरॉन्स की आनुवंशिक रूप से परिभाषित सबसेट के optogenetic हेरफेर के साथ विवो रिकॉर्डिंग में एकीकृत करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
Optogenetic तरीकों प्रजातियों में से एक विस्तृत रेंज में व्यवहार की एक विविध सेट अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट गतिविधि elucidating के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है. माइक्रोबियल मूल के optogenetic उपकरणों (जैसे, channelrhodopsin-2, ChR2) या चुप्पी (जैसे, halorhodopsin, NpHR) behaviorally प्रासंगिक timescales पर तंत्रिका गतिविधि ingenetically से परिभाषित प्रकार की कोशिकाओं को सक्रिय करने में सक्षम हैं कि प्रकाश के प्रति संवेदनशील झिल्ली प्रोटीन से मिलकर. हम पहले पृष्ठीय subiculum और चूहे में प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स के prelimbic क्षेत्र के लिए ChR2 और NpHR transgenes की एडिनो से जुड़े वायरस की मध्यस्थता वितरण के लिए एक सरल दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है. ChR2 और NpHR आनुवंशिक रूप से लक्षित होते हैं, क्योंकि हम उच्च अस्थायी परिशुद्धता के साथ विषम ऊतक में एम्बेडेड न्यूरॉन्स (यानी, पिरामिड न्यूरॉन्स) के विशिष्ट आबादी की बिजली की गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए इस प्रौद्योगिकी के उपयोग का वर्णन. हम साथ साथ हार्डवेयर, कस्टम सॉफ्टवेयर का वर्णनविवो तैयारी में एक anesthetized में transduced पिरामिड न्यूरॉन्स से एक साथ प्रकाश वितरण और बिजली की रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देते हैं कि यूजर इंटरफेस, और प्रक्रियाओं. ये प्रकाश संवेदनशील उपकरण सूचना संसाधन और व्यवहार करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के कारण योगदान की पहचान करने के लिए अवसर प्रदान करते हैं.
एक अस्थायी सटीक फैशन में एक तंत्रिका सर्किट के भीतर एक विशेष सेल प्रकार को सक्रिय या चुप्पी करने की क्षमता तंत्रिका सर्किट भावना और अनुभूति अंतर्निहित जानकारी के विभिन्न प्रकार की प्रक्रिया को समझने के लिये महत्वपूर्ण है. बरकरार तंत्रिका गतिविधि पर प्रायोगिक नियंत्रण प्रदान नहीं करते कि loss-/gain-of-function उपकरणों (जैसे, बिजली की उत्तेजना, औषधीय मॉडुलन, घाव) कार्यरत है या तो एक अस्थायी या स्थानिक स्तर पर, न्यूरॉन्स के विशिष्ट आबादी को नियंत्रित करने के लिए चुनिंदा जरूरी है. सीधे इन तकनीकी चुनौतियों को संबोधित करने, आनुवंशिक रूप से encodable प्रकाश के प्रति संवेदनशील उपकरणों के विकास और आवेदन अच्छी तरह से परिभाषित व्यवहार की घटनाओं के दौरान चुनिंदा प्रकार की कोशिकाओं की विद्युत गतिविधि को नियंत्रित करने के neuroscientists सक्षम है. इन प्रकाश के प्रति संवेदनशील प्रोटीन के कई प्रकाश gated कटियन चैनल, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, और प्रकाश संचालित क्लोराइड पंप, halorhodop साथ, माइक्रोबियल मूल के हैंपाप व्यापक उपयोग में (NpHR) 2,3,.
Optogenetics का एक बड़ा फायदा यह विषम मस्तिष्क क्षेत्रों में आनुवंशिक रूप से लक्ष्य विशिष्ट सेल आबादी करने की क्षमता है और तकनीक को सफलतापूर्वक मॉडल जीवों की संख्या (nonhuman primates को अकशेरुकी) 4-6 के लिए लागू किया गया है. कई optogenetic ट्रांसजेनिक जानवर उत्पन्न और 7,8 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, लेकिन स्थापना के ट्रांसजेनिक लाइनों श्रम गहन और लागत निषेधात्मक किया जा सकता है किया गया है. यहाँ हम एक पुनः संयोजक एडिनो से जुड़े वायरस (AAV) सदिश का उपयोग चूहा prelimbic प्रांतस्था और पृष्ठीय subiculum में CaMKIIα प्रमोटर के तहत ChR2 और NpHR जीन की virally की मध्यस्थता वितरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. अग्रमस्तिष्क के भीतर, CaMKIIα अभिव्यक्ति glutamatergic पिरामिड न्यूरॉन्स 9 के लिए विशेष है. AAV सामान्यतः के कारण उसके रिश्तेदार उत्पादन और pathogenicity की कमी की आसानी के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए बुनियादी अनुसंधान के लिए प्रयोग किया जाता है मजबूत और persiइन वैक्टर 10 से हासिल किया गया है कि स्टेंट transgene अभिव्यक्ति. इसके अलावा हम anesthetized सिर तय चूहों में एक साथ प्रकाश वितरण और रिकॉर्डिंग के लिए कदम और हार्डवेयर रूपरेखा.
तकनीक की एक विस्तृत सरणी कृन्तकों में असतत मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए माइक्रोबियल opsin जीन आनुवंशिक रूप से लक्षित करने के लिए उपलब्ध हैं. वायरल जीन वितरण सेल प्रकार विशिष्टता के साथ ChR2 और NpHR अभिव्यक्ति मध्यस्थता के लिए एक अपेक्षाकृत सस्ता और त्वरित तरीका प्रदान करता है. AAV वेक्टर सिस्टम भंडारण, pathogenicity की कमी, और लंबी अवधि के जीन अभिव्यक्ति 10 उत्पादन करने की क्षमता के दौरान स्थिर रहेगा कि उच्च उत्पादन titers के कारण optogenetic प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए एक आम पसंद हैं. सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों के साथ opsin निर्माणों में से कई ऐसे पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय (के रूप में वेक्टर कोर सुविधाओं से AAV सीरमप्रकारों की एक किस्म में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) या विश्वविद्यालय चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना ( http://genetherapy.unc.edu ). AAV प्रौद्योगिकी के लिए एक दोष यह हैसेल विशिष्ट लक्षित के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि transgene कैसेट आकार पर एक प्रतिबंध स्थानों जो सीमित पैकेजिंग क्षमता (~ 4.7 केबी),. एक विकल्प के रूप में, एक बड़े पैकेजिंग क्षमता है जो lentiviral वैक्टर,, बड़े प्रमोटर दृश्यों के नियंत्रण के तहत लक्षित कर opsin पूरा करने में सक्षम हैं.
एक optrode का उपयोग अस्थायी सटीक प्रकाश वितरण के साथ संयोजन में electrophysiological संकेतों के विश्वसनीय पता लगाने के लिए अनुमति देता है. ऊपर बताया गया है, हालांकि, पर्याप्त देखभाल इसके निर्माण में की जरूरत है. Cleaved ऑप्टिकल फाइबर नाजुक है, इसलिए भी कसकर सिवनी धागा बांधने फाइबर तोड़ने के लिए कारण हो सकता है. वितरित प्रकाश के इलेक्ट्रोड और गुणवत्ता के प्रतिबाधा नीचा दिखाना होगा क्योंकि optrode एकाधिक रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, भले ही इलेक्ट्रोड और ऑप्टिकल फाइबर से पहले प्रविष्टि को साफ किया (या मैन्युअल ऑप्टिकल फाइबर नंगे अंत के मामले में cleaved) होना चाहिए दोहराया उपयोग के साथ.
हाथी के दौरानctrophysiological रिकॉर्डिंग यह optrode धीरे से उन्नत किया है कि महत्वपूर्ण है. यहां इस्तेमाल optrode लगभग 350 माइक्रोन मोटाई है (टंगस्टन इलेक्ट्रोड: 125 मीटर, ऑप्टिक फाइबर की कोर: 200 माइक्रोन) और तेजी से इसे कम मस्तिष्क के ऊतकों के आंदोलन का नेतृत्व कर सकेगी. प्रकाश प्रेरित कलाकृतियों को भी विशेष रूप से रिकॉर्डिंग और प्रकाश वितरण सेट अप 11-12 के साथ विचार किया जा सकता है. हम अपने प्रयोगात्मक हालत में कोई प्रकाश प्रेरित विरूपण साक्ष्य पाया है, transduced मस्तिष्क क्षेत्र के बाहर रिकॉर्डिंग संभावित प्रकाश कलाकृतियों के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के दौरान एक और विचार विशेष रूप से लंबी अवधि रिकॉर्डिंग के लिए, ChR2 या NpHR व्यक्त न्यूरॉन्स में परिवर्तन के अवलोकन के लिए आवश्यक प्रकाश की तीव्रता है. मजबूत लेजर तीव्रता और लंबे लेजर रोशनी ऊतकों को नुकसान और / या बाद में वितरित प्रकाश 12-13 के लिए एक कम प्रतिक्रिया हो सकती थी. व्यवहार प्रयोग के लिए एक नियंत्रण वायरल सदिश का उपयोग eliminatin के लिए आवश्यक हैग्राम फाइबर से बचाया गर्मी की वजह से किसी भी प्रभाव. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध optogenetic निर्माणों से कई के लिए opsin जीन अनुक्रम हटा दिया गया है जिसमें पूरक नियंत्रण निर्माणों रहे हैं.
यह ChR2 कुछ प्रयोगात्मक प्रश्नों 14-15 के लिए बेहतर अनुकूल हो सकता है कि अन्य मुंह बंद opsins के साथ विकसित किया गया है सुधार गुण और कैनेटीक्स साथ वेरिएंट इंजीनियर ध्यान दिया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, लक्षित mutagenesis के माध्यम से स्थापित एक नया ChR2 संस्करण, "ChETA", मूल ChR2 14 के ऊपर है कि (कम से कम 200 हर्ट्ज तक) आवृत्तियों पर उच्च निष्ठा neuronal spiking ड्राइव कर सकते हैं करार दिया.
vivo में प्रकाश वितरण और neuronal प्रतिक्रियाओं के एक साथ रिकॉर्डिंग के संयोजन आनुवंशिक रूप से लक्षित सेल आबादी और इसी समय बंद व्यवहार की घटनाओं में नमूनों गतिविधि के बीच अनौपचारिक सम्बन्ध स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण कदम है. प्रक्रियाओं और हायहाँ रेखांकित rdware कृन्तकों में vivo सिर तय की रिकॉर्डिंग के लिए optogenetics को लागू करने के लिए एक स्पष्ट दृष्टिकोण प्रदान करते हैं.
The authors have nothing to disclose.
इस काम नशीली दवाओं के सेवन (NIDA) अनुदान R01 DA24040 (डीसीसी), विश्वविद्यालय कोलोराडो के अभिनव बीज अनुदान (डीसीसी), और Nida प्रशिक्षण अनुदान T32 DA017637 (MVB) पर राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl |
Removable Needle | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, beveled tip |
Microinjector Pump | World Precision Instruments | UMP3 | |
Pump Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
Silicone Oil | Alfa Aesar | A12728 | |
Laser Protective Eyeware | Kentek | KMT-4501 | |
Multimode Optical Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm diameter core, 0.37 NA |
Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T12S21 | for 200 μm diameter core multimode fiber |
Optical Power Meter | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
Photodetector | Newport | 818-SL/DB | |
Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | Lumitrode |
Glass Capillary Tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MO-22 | |
Amplifier | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
Rodent Head Restraint for Recording | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
Small Animal Stereotaxic Unit | David Kopf Instruments | Model 963 |