Summary
Esta técnica proporciona un método para cosechar, normalizar y cuantificar el crecimiento intracelular de las bacterias patógenas que son pre-cultivadas en células naturales protozoos anfitrionas antes de las infecciones de las células de mamíferos. Este método puede ser modificado para acomodar una amplia variedad de células huésped para la fase de cebado así como los tipos de células diana.
Abstract
Muchos patógenos bacterianos intracelulares utilizar protozoos de agua dulce como un reservorio natural para la proliferación en el medio ambiente. Legionella pneumophila, el agente causante de la neumonía del legionario, gana una ventaja sobre patógena en bacterias cultivadas in vitro cuando primero cosechadas a partir de células de protozoos antes de la infección de los macrófagos de mamífero. Esto sugiere que los factores de virulencia importantes que no pueden ser adecuadamente expresada in vitro. Hemos desarrollado un sistema manejable para el cebado L. pneumophila a través de su huésped natural, protozoo Acanthamoeba castellanii antes de la infección de células de mamíferos. La contribución de cualquier factor de virulencia puede examinarse comparando el crecimiento intracelular de una cepa mutante de bacterias de tipo salvaje después de la imprimación protozoo. Que expresa GFP de tipo salvaje y mutante de L. cepas pneumophila se utilizan para infectar monocapas de protozoarios en una etapa de cebado y se dejó alcanzar las últimas etapas de crecimiento intracelular. Bacterias fluorescentes Después se recogen a partir de estas células infectadas y normalizado por espectrofotometría para generar números comparables de las bacterias para una posterior infección en macrófagos de mamífero. Para la cuantificación, bacterias vivas son monitoreados después de la infección mediante microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, y por chapado colonia. Esta técnica pone de relieve y se basa en la contribución de la expresión génica de la célula huésped dependiente imitando el medio ambiente que se encuentra en una ruta de adquisición natural. Este enfoque puede ser modificado para adaptarse a cualquier bacteria que utiliza un huésped intermediario como un medio para obtener una ventaja patógena.
Introduction
Numerosos patógenos bacterianos han adaptado estrategias generalizadas para explotar células huésped para la supervivencia y replicación en un compartimiento intracelular. En muchos casos, los mecanismos patogénicos son similares entre protozoos y metazoos células. Sin embargo, estos dos microambientes son muy diferentes y pueden resultar en la expresión diferencial de los factores de virulencia 1-4. La enfermedad del legionario bacteria Legionella pneumophila doquier se asocian con ambientes de agua dulce en todo el mundo 5. Es importante destacar que, L. pneumophila cultivada en células de protozoos antes de la infección de los monocitos humanos obtener una ventaja patógena, lo que sugiere que los perfiles de expresión génica global de la bacteria sale de una célula de protozoo son diferentes que la de la vitro en cultivo organismo 6-8. En la naturaleza, las amebas de agua dulce proporcionan nutrientes ricos confines de la rápida amplificación de una bacteria invasora. Adquisición humano de L. pneumophila es más a menudo atribuida a la inhalación de gotitas de agua contaminadas que contienen la bacteria. Es probable que estas gotitas puerto protozoarios asociados a las células bacterias; donde las células de protozoos son más resistentes a las prácticas convencionales de tratamiento de agua 9,10. La infección de macrófagos alveolares pulmonares procede de una manera casi idéntica a la del ciclo de vida intracelular de la bacteria en las células huésped de protozoos 11-13.
Con el fin de sobrevivir y replicarse en células eucariotas, L. pneumophila utiliza un tipo especializado sistema de secreción IVb denominado Dot / Icm llegar a casi el 300 'ejecutor' proteínas en el citosol de la célula huésped 14-16. Estas proteínas efectoras colectivamente funcionar para subvertir procesos celulares con el fin de generar un compartimiento de replicación permisiva para la bacteria 17,18. Las deleciones en cualquiera de los 26 genes que constituyen el resultado transportador Dot / Icm en cepas defectuosas para mult intracelulariplication 19-23. Históricamente, la deleción de genes individuales que codifican efectoras rara vez resultó en cepas atenuadas para el crecimiento intracelular. Este fenómeno se ha atribuido a varias hipótesis, incluida la función redundante y paralogous copias de efectores.
Algunos factores de virulencia se expresan únicamente en el contexto de la célula huésped asociada a crecimiento intracelular 24. Hemos racionalizado que si un efector particular, se expresa sólo en el contexto de la infección por protozoos, entonces la contribución del efector no podía ser comparada con una cepa de tipo salvaje cuando ambos se cultivaron in vitro. L. pneumophila transiciones desde un replicativa a una fase de transmisión a medida que entra en la fase estacionaria de cultivo de 25. El fenotipo de conmutación de fase representa el agotamiento de los nutrientes encontrados durante el crecimiento intracelular y se ejemplifica a través del conjunto de los flagelos para la movilidad 26. Debido a que L. pneumophila es más invasive y virulenta cuando se cosecha a partir de células de protozoos, hemos tratado de desarrollar un ensayo que más fielmente representa el estado patógeno de la bacteria cuando se encontró con los macrófagos de acogida.
Para este fin, hemos desarrollado un ensayo protozoo cebado versátil que puede adaptarse a cualquier huésped adecuado tanto para las infecciones de la primera etapa (cebado de células) y segundo (célula diana). El proceso de infección es tratable mediante el uso de bacterias que expresan establemente la proteína verde fluorescente (GFP). El modelo de la infección por el protozoo Acanthamoeba castellanii sigue una metodología ampliamente utilizado en el campo 27. Para la etapa de cebado, L. pneumophila cepas se cultivan in vitro hasta la fase estacionaria en medio líquido para producir la etiqueta 'transmisivo "bacterias (Figura 1A). Las bacterias se vuelva a utilizar para infectar monocapas de A. castellanii durante 18 horas para lograr una etapa tardía del ciclo de vida intracelular. Contienen grandes vacuolasbacterias ING puede ser visualizado en este punto de tiempo usando microscopía de fluorescencia (Figura 1A). Las células se lisan por protozoos y bacterias recuperadas a partir del lisado se miden para emisión a 512 nm utilizando un lector de placas de fluorescencia. La fluorescencia se correlaciona con la densidad óptica para calcular multiplicidad de infección (MOI) en la infección de células diana (Figura 1, Curva * Correlación). Después de la invasión h (T 0) y 18 post-invasión (T 18), las células diana se cuantifican por fluorescencia, en representación de las bacterias intracelulares. La fluorescencia puede ser monitoreada por microscopía y citometría de flujo, y el recuento de viables se puede medir a través de placas de colonias. El ensayo de cebado siempre se acompaña de infecciones por L. de tipo salvaje pneumophila y una cepa defectuosa en el sistema Dot / Icm de secreción de tipo IV (Δ dotA) (Figura 1A). Este importante proporciona controles internos para las comparaciones directas entre los de tipo salvaje unnd cualquier cepas isogénicas mutantes utilizados en el proceso de infección. La inclusión de la cepa no virulenta Δ dotA durante la fase de cebado establece un umbral para la observación de fenotipos de crecimiento atenuadas asociados con cepas mutantes isogénicas que se cultivan in vitro.
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Protocol
1. Preparación de Legionella pneumophila Culturas de Infecciones fase de cebado
- Transformar todo L. pneumophila cepas usadas en el ensayo con los plásmidos pAM239, que codifica una isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) inducible proteína verde fluorescente (GFP) 28. Inocular las cepas bacterianas en hierro y cisteína suplementado N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico (ACES) tamponada con carbón vegetal agar de extracto de levadura (CYEA) que contiene 6,25 mg / ml de cloranfenicol (CM) (para el mantenimiento del plásmido) y se incuba durante 72 hr a 37 ° C.
- Transferir un inóculo de la cepa bacteriana en ACES suplementadas tamponada caldo de extracto de levadura (AYE) con 6,25 g / ml CM y 1 mM de IPTG y cultivar a la fase estacionaria (O / N) en un agitador orbital a 37 ° C.
- Confirmar la expresión de GFP en los cultivos in vitro utilizando microscopía de fluorescencia. Transferir 10 l de cultivo en un portaobjetos de vidrio bajo una cubiertadeslizamiento y la imagen usando un objetivo de 60X con excitación GFP / cubo de emisión (AMG EVOS fl).
- Diluir una alícuota de 100 l de cada cultivo in vitro a 1:10 con H2O estéril El blanco con 100 l AYE medios de comunicación con IPTG 1 mM y 6,25 g / cm ml y agua. Tome OD600 mediciones de las diluciones utilizando un espectrofotómetro (Bio-Rad inteligente Spec Plus). Calcular el volumen necesario para infectar un pozo a una MOI = 20 para cada cultivo in vitro: V = [(ameba cabeza de serie) x MOI] / [OD 600 x (factor de dilución) x (constante)] = [(1 X 10 6 ) x (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. La concentración de bacterias se determinó como OD 600 = 1,0 = 1 x 10 9 UFC / ml.
2. Cebado de la infección por Acanthamoeba escenario mediante castellanii
- Mantener y cultivar las amebas en medio ATCC 712 PYG en 175 cm 2 frascos a temperatura ambiente.
- Vuelva a colocar los medios de comunicación en la cultura amebasras 24 h antes de iniciar los cultivos líquidos bacterianos. En el mismo día líquidos cultivos bacterianos se han iniciado, recoger y contar las células en un microscopio de luz usando un hemocitómetro.
- Diluir las amebas con medio fresco a una concentración final de 1 x 10 6 células / ml. Semilla 12-y placas de cultivo de células con 1 ml de alícuotas de las amebas utilizando una pipeta de repetición y se incuba a RT O / N.
- Después de la incubación, se lavan los pocillos de las placas de cultivo de 12-pocillos de células 3 veces con 1 ml de PBS estéril usando una pipeta serológica de 10 ml y una ayuda de pipeta manual.
- Después de la aspiración de PBS, añadir 1 ml de la infección por los medios de comunicación (ATCC 712 medios de comunicación PYG menos glucosa, peptona, y extracto de levadura) con IPTG 1 mM y 6,25 g / ml cm a cada pocillo. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 1 hr.
- Infect pocillos a una MOI = 20. Centrifugar la placa a 400 xg durante 5 min (Eppendorf 5810R) y flotar en un baño a 37 ° C durante 5 min. Colocar la placa en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 18 hr.
- Confirme las infecciones utilizando imágenes de células vivas en un microscopio de fluorescencia antes de la sede de la lisis celular y la cosecha de las bacterias.
3. Siembra de células THP-1 para la infección de las células diana Stage
- (Comience este proceso de 24 horas antes de la creación de cultivos bacterianos líquidos). Cultivar células THP-1 en un 75 matraces de cultivo de 2 cm a alrededor de-confluencia en medio RPMI 1640 con inactivado por calor al 10% de suero fetal bovino (FBS).
- Contar las células en suspensión utilizando un hemocitómetro, diluir las células THP-1 en medio RPMI 1640 con FBS al 10% y 100 ng / ml de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) a una concentración de 1 x 10 6 células / ml y la placa en alícuotas de 1 ml en placas de 12 pocillos de cultivo celular. Incubar las placas durante 48 horas a 37 ° C, 5% de CO 2.
4. Tratamiento para la infección de bacterias Etapa de células diana después de la infección fase de cebado
- Aspirar el medio de las amebas cebada.
- Lyse la unamoebae usando 500 l de hielo frío, estéril ultrafiltrada (UF) H 2 O y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min.
- Piscina Los lisados de acuerdo con la cepa de tipo E y tomar una medición de 512 nm para cada uno de los lisados combinados utilizando un lector de placas de fluorescencia (Molecular Devices Spectramax Gemini EM).
- Calcular un OD 600 de medición para los lisados agrupados: calcOD 600 = 0,0008 (E 512 - Fondo de lisado) + 0.0019. La fórmula se determinó previamente por gráfica una comparación directa de ambas la OD 600 y el E 512 nm mediciones de diluciones de L. pneumophila tipo salvaje GFP expresión de la fase estacionaria del cultivo in vitro (Figura 1 *). Los lisados de ameba no infectadas, sujetas a las mismas condiciones experimentales que la ameba infectada, se usa como blanco y proporcionó un valor de corrección (por ejemplo, lisado de fondo), que fue incorporado en la ecuación. El t volumen necesarioo infectar un pozo a una MOI = 20 se calcula para cada grupo de lisado: V = [(THP-1 sin semillas) x MOI] / [calcOD 600 x (constante)] = [(1 X 10 6) x (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20 / calcOD 600.
- Lavar las células THP-1 3x con PBS y añadir 1 ml de medio fresco RPMI 1640 (10% de FBS) a cada pocillo. Incubar las células THP-1 durante 1 hora a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Infectar las células THP-1 en la cantidad, calculada usando los lisados MOI agrupados. Permitir que un conjunto de pocillos para no infectarse, sirviendo como un control negativo para el análisis de citometría de flujo. Procesamiento de la fase de cebado debe ser completado en menos de 30 min. Los lisados se mantienen en hielo para limitar los cambios en la expresión génica antes de la infección bacteriana.
- Centrifugar la placa, flotar para elevar la temperatura, y se incuba como en la fase de cebado.
- Una hora después de la infección, retire el soporte mediante aspiración y lavar los pocillos 3 veces con PBS para eliminar las bacterias extracelulares.
- Añadir 1 ml freSH RPMI 1640 (10% de FBS) a los pocillos de la placa y volver a la incubadora. El tiempo inmediatamente después del reemplazo de los medios de comunicación sirve como tiempo cero (T 0). Se incuban las células THP-1 durante 14-16 horas a 37 ° C, 5% de CO 2.
5. Análisis Experimental
5,1 imágenes de células vivas
Imagen de los pozos infectados utilizando un microscopio de fluorescencia (AMG EVOS fl) a 10X o 20X de aumento (Figuras 1A-D). Las imágenes se pueden comparar de manera cualitativa o cuantitativamente para determinar los niveles de infección, tanto en la fase de cebado y las infecciones de células diana etapa.
5,2 de citometría de flujo
- Los picos de emisión de diferentes infecciones pueden ser comparados por citometría de flujo (BD FACS Calibur). Tripsinizar las infectadas células THP-1 y suavemente de lavado de los pozos mediante la mezcla en PBS con una pipeta.
- Piscina las células por tipo de cepa en tubos de 15 ml Falcon y el sedimento a 1.800 xg durante 2min en la centrífuga de mesa.
- Suspender los gránulos en 1 ml de PBS y transferir a tubos de 1,5 ml de microcentrífuga.
- Centrifugar la suspensión a 1.800 x g (Eppendorf 5424) y volver a suspender los gránulos en 1 ml de PBS. Si las suspensiones resultantes son muy turbia (OD 600 ≥ 1,0) que debe ser diluido en PBS adicional (1:3) para prevenir la obstrucción de las líneas en el citómetro de flujo.
- Use filtrada estéril PBS para el equilibrado del citómetro de flujo y para los pasos de lavado entre inyecciones de muestra. Trazar la dispersión frontal / lateral de las células diana infectadas antes de la inyección de muestras objetivo infección celular.
- Recoge 20.000 eventos totales para cada condición de uso de 488 nm láser de excitación y el canal FL1.
- Puerta de captura de post-poblaciones de células para excluir las células no infectadas y la intensidad de fluorescencia de trama en un histograma (FlowJo) (Figura 1E).
5,3 CFU plating
- Examinar la eficacia of infección por chapado UFC de las células cosechadas por citometría de flujo. Preparar diluciones seriadas de las muestras en ultrafiltrada O H 2 a 10 -1, 10 -2, y -3 10.
- Placa de 20 l de cada dilución en el 1/3 de una placa de CYEA con 6,25 g / ml CM.
- Incubar las placas a 37 ° C durante 72 hr.
- Contar las colonias utilizando un palillo de dientes y contador de células.
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Representative Results
Un resultado típico para el proceso de infección completo se describe en la Figura 1. Vivo micrografías de fluorescencia de células que representan monocapas de A.castellanii infectadas con el tipo salvaje L. pneumophila durante la fase de cebado se muestra en la Figura 1A. Una medida de éxito de la etapa de cebado daría lugar a una población de aproximadamente 90% de las células huésped que contienen grandes vacuolas pobladas con bacterias GFP etiquetados en este MOI. En 18 horas después de la infección, la mayor parte A. castellanii células han alcanzado máximas cargas bacterianas todavía lisis de la población es mínima. Bajo microscopía de luz, una infección cebado éxito revelará amebas redondeadas y separadas. Gentamicina [25 g / ml] se puede añadir al medio de cultivo 30 min a 1 h después de la infección para eliminar la contribución de las bacterias extracelulares. El Δ dotA cepa mutante, que no puede soportar Dot / Icm mediada por la translocación de los efectores, no debe crecer enA. castellanii y aunque el cultivo in vitro debe fluorescencia, así como la cepa de tipo salvaje, la fluorescencia mínima debe ser detectado con esta cepa a 18 h después de la infección. Las amebas se vea plana y la monocapa deben estar intactos.
Total lisados albergan L. pneumophila y restos de células huésped se somete inmediatamente a análisis espectrofotométrico con el fin de calcular la concentración de bacterias en la muestra. MOI se puede calcular utilizando la curva de correlación (Figura 1 *). Las células diana deben estar preparados para la infección de manera que las bacterias imprimadas se utilizan menos de 30 min después de la lisis de preservar la integridad de los perfiles de expresión génica. Una vez infectadas, las células diana se incuban durante 14-18 h antes de ser procesados. Micrografías de fluorescencia en la Figura 1B demostrar la ventaja adquirida por protozoo patógeno-priming de tipo salvaje L. pneumophila en infecciones diana etapa de célula de A. castellanii en comparación con la misma cepa que estaba limitado a cultivo in vitro antes de la infección. Blanco de infecciones etapa de célula son menos robustos que la fase de cebado debido a la inclusión de una etapa de lavado 1-2 horas después de la infección (células diana-dependiente). Este paso elimina el reemplazo de medios bacterias no invasivas, la sincronización de la infección y la reducción de la fluorescencia de fondo en posteriores aplicaciones. Figuras 1C-D muestran micrografías de fluorescencia de un típico tipo silvestre L. pneumophila en dos etapas infección escenario, donde las bacterias son los primeros preparado por infección de A. castellanii, cosechadas a partir de células lisadas por protozoos, cuantificado usando la curva de correlación y usado para infectar macrófagos THP-1 durante 14 horas.
Después de microscopía, las células se trataron con tripsina para citometría de flujo (BD FACS Calibur). Las células no infectadas se utilizan para calibrar la máquina para adelante y dispersión lateral. Las infecciones con cada cepa son procesosed con 20.000 eventos registrados. FlowJo 7.6.1 software se utiliza para analizar los datos en bruto. Típicamente, la fluorescencia (488 nm de excitación) primero se representa en contra de dispersión lateral para identificar la fluorescencia de fondo de la población de células no infectadas. Las parcelas son gated para excluir esta población y re-trazado como un histograma de los recuentos totales frente a la intensidad de fluorescencia. Debido a que cada célula bacteriana representa una unidad de fluorescencia, la intensidad de la señal proporciona una representación de la carga vacuolar en cada célula infectada. Un diagrama típico de una infección de tipo salvaje se muestra en la Figura 1E. En general, el número relativo de células infectadas detectadas por el citómetro de flujo es inferior a la prevista cuando se comparan con los datos de microscopía. Citometría de flujo de células en vivo es lo suficientemente sensible para detectar variaciones sin embargo cepa.
La cuantificación del total de CFU en las muestras se realiza mediante la generación de diluciones seriadas de las células preparadas para citometría de flujo y extensión subsiguienteCYEA en los medios de comunicación. Después de 72 horas a 37 ° C, las colonias individuales debe ser evidente y dispersa suficiente para el recuento.
Figura 1. Protozoarios cebado y de destino infecciones etapa celulares usando Legionella pneumophila. A. Wild-tipo o secreción tipo IV deficiente (Δ dotA) L. cepas pneumophila fueron inducidas para expresar GFP mediante cultivo in vitro (marcos pequeños) y usado para infectar A. castellanii monocapas de 18 horas a MOI = 20. Micrografías de fluorescencia de las infecciones con cada L. pneumophila cepa se muestran (marcos grandes) como una mezcla de contraste de fase y E 512 nm imágenes de fluorescencia con un objetivo 20X en un microscopio de fluorescencia (AMG EVOS fl). Medias lunas verdes son representativos de intracelular vacuolesharboring L. pneumophila. B. La fluorescencia de GFP micrografías de 18 infección objetivo hr etapa de células de A. castellanii con el tipo salvaje L. pneumophila cosechado de la infección cebado etapa protozoario (parte superior) o en cultivos in vitro (parte inferior), donde la MOI = 10 para cada uno se calculó utilizando la ecuación derivada de la curva de correlación muestra (azul *). La curva se produjo usando diluciones en serie de tipo silvestre L. pneumophila expresando GFP a partir de un 18 hr de cultivo in vitro. C. Fluorescencia micrografía de una infección fase de cebado de A. castellanii con el tipo salvaje L. pneumophila como en (A). D. micrografía de fluorescencia de una infección de 14 h de destino etapa de célula de PMA diferenciadas THP-1 macrófagos con el tipo silvestre L. pneumophila cosechado de la infección de protozoos en fase de cebado (C). El MOI = 20 se calculó usando la ecuación derivada de la corcurva de relación se muestra (* azul). El marco que se muestra es una mezcla de contraste de fase y E512 nm imágenes de fluorescencia como en (A). Histograma E. de datos de citometría de flujo comparando no infectados THP-1 macrófagos (rojo) y células infectadas con el protozoo imprimación de tipo salvaje L. pneumophila (verde). Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ampliar la figura.
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Discussion
La expresión génica bacteriana está estrechamente controlada a través de una combinación de la progresión del ciclo de vida y la respuesta a las señales en el microambiente circundante. Patógenos vacuolar tales como L. pneumophila responder a una multitud de receptores de células derivadas de las señales cuando compartimentada en un fagosoma. Como resultado colectivo de agotamiento de nutrientes en la célula huésped, la bacteria compensa mediante la expresión de factores requeridos para la difusión éxito a una célula huésped posterior 25. L. pneumophila adaptado para parasitar eficientemente una amplia variedad de células de protozoarios y por lo tanto alberga un amplio catálogo de proteínas efectoras para conducir este proceso. Estas proteínas efectoras son trasladadas directamente en el citoplasma huésped durante la infección por el sistema Dot / Icm de secreción tipo IV ter 16. Translocación de proteínas efectoras se requiere, como mutaciones que resultan en un transportador defectuoso abrogar completamente el crecimiento intracelular en cualquier tipo de célula huésped. Curiosidadusly, deleciones individuales en particular proteínas efectoras rara vez resultó en una atenuación del crecimiento intracelular. Cerca de 300 proteínas efectoras, o casi el 10% del genoma que codifica la proteína se han validado como Dot / Icm sustratos 14,15. Varias hipótesis han surgido para explicar la falta de fenotipos observables para deleciones efectoras, incluyendo la presencia de paralogous copias o la adquisición horizontal de enzimas ortólogos que resulta de la amplia gama de hospedantes de L. pneumophila.
Debido a que L. pneumophila gana una ventaja patógeno cuando pre-cultivadas en células de protozoos (Figuras 1A-B), que razonó que en las bacterias cultivadas in vitro, no se mostrará el perfil de expresión génica en bacterias mismo evidente que salen del anfitrión protozoario. Por lo tanto, la expresión de determinadas proteínas efectoras sólo puede ser inducido en el contexto del crecimiento intracelular en las células de protozoos. Si un concreto efector no fue inducida por correoxpression durante el cultivo in vitro, que la contribución de la efector eliminado no puede ser efectivamente evaluada en un escenario infección tradicional. Fenotipos de factores de virulencia importantes para el establecimiento de la infección o la difusión sólo se detectaría en las infecciones prolongadas que permitieron la propagación célula a célula. Por lo tanto, tratado de desarrollar un ensayo que puede medir la contribución de los factores de virulencia potenciales en el contexto de una infección secuencial. En el caso de L. naturales pneumophila adquisición, es probable que un huésped humano se encontraría con una bacteria que había sido preparado para la infección en una célula de protozoo; donde protozoos pueden ser más resistentes a las prácticas tradicionales municipales de tratamiento de agua 10.
Con el fin de optimizar la purificación parcial de una cantidad suficiente de bacterias cebados, se estableció por primera vez una cepa de L. visualmente tratable pneumophila mediante IPTG inducible buenas prácticas agrarias ucantar plásmido copias transmitidas por el locus de buenas prácticas agrarias. También generó una inserción única copia cromosómica inducible de IPTG GFP en el genoma de tipo salvaje. Aunque ambas cepas de fluorescencia in vitro y durante la infección, el mayor número de copias del plásmido GFP transmitidas por producida de señal suficiente para las aplicaciones posteriores en el ensayo. Hemos establecido que el uso de caldo de cultivo L. pneumophila a una MOI = 20 era suficiente para infectar fuertemente A. castellanii monocapas. Dieciocho horas de incubación se determinó como óptimo para visualizar grandes vacuolas fluorescentes sin llegar a una etapa de lisis de la célula huésped (Figura 1A). Monocapas Protozoarios no se cumplen los plásticos de cultivo celular, y por tanto se altera fácilmente con los pasos de lavado. 12-y placas de cultivo de células produce las monocapas más estables en comparación con otros recipientes (6 o bien 24, 10 cm plato). Debido a que L. pneumophila no pueden crecer en el medio de infección utilizado en thpaso e imprimación, se optó por abandonar cualquier etapa de lavado para eliminar las bacterias extracelulares. Esto mejora enormemente el rendimiento de ameba infectada en la monocapa. Gentamicina se utiliza a menudo para matar las bacterias extracelulares. Se observaron efectos de toxicidad por protozoos en concentraciones superiores a 25 mg / ml, y no se encontraron diferencias en el número total de bacterias recuperadas de la infección fase de cebado en 18 horas. La lisis de la monocapa de células protozoario se realizó con hielo frío ultrafiltrada H 2 O, un disolvente que osmóticamente compromete la célula huésped sin dañar L. pneumophila. Si adaptado para su uso con agentes patógenos que no son estables en H 2 O, 0,1% de Triton X-100 en PBS se puede utilizar para lisar las amebas con resultados similares.
Con el fin de comparar directamente una cepa a diferencias en posteriores infecciones de células diana, una ecuación fue generado para correlacionar densidad óptica de las bacterias a 600 nm con la emisión de fluorescencia de GFP a 512 nm (Figure 1 *). Hemos elegido utilizar emisión de fluorescencia como un medio para la cuantificación, debido a la gran contribución de los residuos de la célula huésped en la OD 600 mediciones a partir de lisados de células eucariotas. Este fondo de alto contraste con los valores observados insignificantes para la emisión de 512 nm de los mismos lisados. Los valores de OD 600 = 1,0 = 1x10 9 UFC / ml fueron predeterminados por L. pneumophila, lo que permite el cálculo de la concentración bacteriana en un amplio intervalo de valores de fluorescencia. Muchos organismos han establecido valores de UFC para OD 600 = 1,0, lo que permitiría la aplicación de esta técnica a cualquier otro patógeno a través de la generación de una curva de correlación basándose en la emisión de fluorescencia. Hemos elegido para evitar una etapa de purificación bacteriana durante la lisis de las células de protozoos con el fin de 1) maximizar el rendimiento de las bacterias cebados disponible para la infección de la célula diana y 2) minimizar el tiempo entre la cosecha y la posterior infección de preservar p global de la expresión génicaatterns.
In vitro culto de tipo salvaje L. pneumophila se indujo a expresar GFP durante 18 h con IPTG 1 mM. Las diluciones en serie de este cultivo se utiliza para las mediciones espectrofotométricas. Usando la ecuación derivada, infecciones de células diana se realizaron de forma rutinaria en la variable MOI con una producción consistente. Una MOI de 10 produjeron aproximadamente 1/2 del número total de células infectadas, en comparación con las infecciones que recibieron una MOI de 20 (figuras 1A-B). Hemos probado tres ejércitos de células diana con este ensayo, A. castellanii, murinos J774 macrófagos y humanos PMA-diferenciadas macrófagos THP-1. En cada caso, la infección resultante no era tan fuerte como la infección de cebado al mismo MOI (figuras 1C-D). Se determinó que la que una etapa adicional de lavado durante la infección de células diana etapa, que se realiza para sincronizar tanto la infección de las células diana y reducir las bacterias extracelulares, es responsible para esta observación. Sin embargo, es crucial que el experimento se controla internamente con una cepa de tipo salvaje, tanto para el cebado de células diana y las infecciones de la etapa. Cantidades de bacterias recuperadas en la etapa de cebado es bastante limitante para las infecciones posteriores, por lo tanto, sólo un único tipo celular diana debe ser utilizado por experimento.
La cuantificación de la infección de las células diana se logró usando tres métodos en este ensayo. Microscopía de fluorescencia se utiliza con un objetivo 20X. Imágenes de vacuolas que albergan L. pneumophila se contaron manualmente desde varios campos para cada cepa ensayada. Análisis de citometría de flujo proporciona una medida sensible de las diferencias en el total de células infectadas, así como una aproximación de la carga vacuolar; donde una mayor señal de fluorescencia se correlaciona con la contribución de la señal de GFP a partir de un número creciente de L. pneumophila células. Dilución en placas de serie proporcionado valores cuantitativos para el número totalde volumen por CFU en las muestras celulares recogidas por citometría de flujo. Colectivamente, estos métodos permiten obtener resultados completamente manejables y cuantificable en un escenario de la infección secuencial.
El ensayo de cebado es muy versátil y es ideal para la adaptación a cualquier patógeno bacteriano que utiliza protozoos de agua dulce como un intermedio 29,3 ambiental. La elección de la célula diana puede ser independiente para adaptarse a la vía de infección natural por el patógeno en particular. Es importante destacar que un modelo de infección secuencial puede ser usado para examinar las cepas mutantes que no presentan un fenotipo de crecimiento en un modelo de infección tradicional usando en bacterias cultivadas in vitro. Transcripcional de perfiles en las bacterias cultivadas in vitro de factores de virulencia presuntos podría revelar diferencias importantes en el perfil de expresión en el hospedador intermediario infectado. Esto podría abrir una nueva línea de investigación para la función de las proteínas no y su contribución a los recursos naturalesvías de infección.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Craig Roy y el Dr. Dario Zamboni para proporcionar una plantilla para las infecciones por protozoos celulares. Agradecemos al Dr. Jagdeep Obhrai, Dr. Georgiana Purdy, el Dr. Fred Heffron y Todd Wisner para el equipo y los reactivos, el Dr. Lulu Cambronne para la revisión crítica del manuscrito. La citometría de flujo se realizó en las instalaciones de flujo OHSU Recursos Citometría compartido. Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de la Fundación de Investigación Médica de Oregon y un NIH subvención R21 AI088275 (EDC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
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