Summary
Denna teknik ger en metod för att skörda, normalisera och kvantifiera intracellulär tillväxt av bakteriella patogener som är förinställda odlas i naturliga celler protozo värdceller före infektioner av däggdjursceller. Denna metod kan modifieras för att rymma en mängd olika värdceller för den primande etappen liksom mål celltyper.
Abstract
Många intracellulära bakteriella patogener använder sötvatten protozoer som en naturlig reservoar för spridning i miljön. Legionella pneumophila, det orsakande medlet av legionärssjuka lunginflammation, får en patogen fördel över in vitro odlade bakterier när de först skördade från protozoiska celler före infektion av däggdjur makrofager. Detta tyder på att viktiga virulensfaktorer inte riktigt uttryckas in vitro. Vi har utvecklat en lätthanterlig för grundning L. pneumophila genom sin naturliga värd protozo Acanthamoeba castellanii före däggdjursceller infektion. Bidraget från varje virulensfaktorn kan undersökas genom att jämföra intracellulär tillväxt av en mutant stam av vildtyp bakterier efter protozo grundning. GFP-uttryckande vildtyp och mutant L. pneumophila stammar används för att infektera monoskikt protozoiska i en primande steg och får uppnå sena stadier av intracellulär tillväxt. Fluorescerande bakterier skördas sedan från dessa infekterade celler och normaliserades genom spektrofotometri för att generera motsvarande antal bakterier för en efterföljande infektion i däggdjur makrofager. För kvantifiering, är levande bakterier övervakas efter infektion med användning av fluorescensmikroskopi, flödescytometri, och koloni plätering. Denna teknik belyser och förlitar sig på bidrag värdcellen-beroende genuttryck genom att härma miljön som skulle uppstå i en naturlig förvärv rutt. Detta tillvägagångssätt kan modifieras för att rymma varje bakterie som använder en mellanhand värd som ett medel för att få en patogen fördel.
Introduction
Talrika bakteriella patogener har anpassat generaliserade strategier för att utnyttja värdceller för överlevnad och replikering i en intracellulär avdelning. I många fall, patogena mekanismer lika mellan protozoer och metazoiska celler. Dessa två mikromiljöer är mycket olika och kan resultera i differentiellt uttryck av virulensfaktorer 1-4. Den legionärssjuka bakterien Legionella pneumophila är överallt förknippad med sötvattensmiljöer över hela världen 5. Viktigt är L. pneumophila odlades i protozoiska celler före infektion av humana monocyter få en patogen fördel, antyder att globala genuttrycksprofilerna av bakterien lämnar en protozo-cell är annorlunda än den hos in vitro odlade organismen 6-8. I naturen, sötvatten amöbor ger näringsrika gränserna för snabb förstärkning av en invaderande bakterien. Mänskliga förvärv av L. pneumophila oftast tillskrivs inandning av förorenade vattendroppar som innehåller bakterien. Det är troligt att dessa droppar harbor protozo cellassocierade bakterier, där protozoiska celler är mer resistenta mot konventionella metoder vattenrening 9,10. Infektion av lung alveolära makrofager fortskrider på ett sätt som nästan identisk med den intracellulära livscykel bakterien i protozo värdceller 11-13.
För att överleva och replikera i eukaryota celler, L. pneumophila använder en specialiserad typ IVb sekretionssystem benämnd Dot / ICM att leverera nästan 300 'effektor "proteiner in i cytosolen hos värdcellen 14-16. Dessa effektor proteiner fungerar tillsammans för att undergräva cellulära processer för att generera en replikering tillåtande fack för bakterien 17,18. Deletioner i någon av de 26 gener som utgör Dot / ICM transportör resultat i stammar defekta för intracellulär multiplication 19-23. Historiskt, resulterade deletion av enskilda effektor kodande gener sällan i stammar försvagade för intracellulär tillväxt. Detta fenomen har tillskrivits flera hypoteser, inklusive överflödig funktion och paraloga kopior av effektorer.
Vissa virulensfaktorer endast uttrycks i samband med värdcell-associerad intracellulär tillväxt 24. Vi rationaliseras att om en viss effektor uttrycktes endast i samband med protozo-infektion, då bidraget av effektorn inte kunde jämföras med en vildtyp stam när båda odlades in vitro. L. pneumophila övergångar från ett replikativt till en transmissiv fas när den kommer in stationär fas i kultur 25. Fasen byta fenotyp representerar näringsämnen utarmning påträffas under intracellulär tillväxt och exemplifieras genom montering av flageller för motilitet 26. Eftersom L. pneumophila är mer invasionenomfattande och virulenta när skördats från protozoer celler, försökte vi utveckla en analys som mer troget representerade patogena tillstånd av bakterien när den möter värd makrofager.
I detta syfte har vi utvecklat en mångsidig analys protozo grundning som kan rymma något lämpligt värd för både de första (priming-cell) och andra (målcellen) steg infektioner. Infektionsprocessen är lätthanterligt genom användning av bakterier som stabilt uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP). Infektionen modell för protozo Acanthamoeba castellanii följer en metod används ofta i fältet 27. För grundning steget, L. pneumophila stammar odlas in vitro till stationär fas i flytande media för att producera märkta "genomskinliga" bakterier (Figur 1A). Bakterier nästa för att infektera monoskikt av A. castellanii under 18 timmar för att uppnå ett sent skede av den intracellulära livscykeln. Stora vakuoler innehållerning bakterier kan visualiseras vid denna tidpunkt med fluorescensmikroskopi (figur 1A). Protozoiska celler lyseras sedan och bakterier som återvunnits från lysatet mäts för emission vid 512 nm med användning av en fluorescens-plattläsare. Fluorescens är korrelerad med optisk densitet för att beräkna mångfald-av-infektion (MOI) för infektion av målceller (Figur 1, * Korrelation Kurva). Efter invasionen (T 0) och 18 timmar efter invasionen (T 18), är målceller kvantifieras för fluorescens, representerande intracellulära bakterier. Fluorescens kan övervakas genom mikroskopi och flödescytometri, och bakterieräkning kan mätas genom koloni plätering. Den priming Analysen åtföljs alltid av infektioner med vildtyp L. pneumophila och en stam defekt i Dot / ICM typ IV sekretionssystem (Δ DOTA) (figur 1A). Detta ger allt den interna kontrollen för direkta jämförelser mellan vildtyp ennd eventuella isogena mutantstammar användes i infektionsprocessen. Införandet av avirulenta Δ DOTA stam under priming steget fastställer en tröskel för observation av försvagade tillväxten fenotyper associerade med isogena mutantstammar som odlas in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Legionella pneumophila kulturer för infektioner Priming Stage
- Förvandla alla L. pneumophila stammar som användes i analysen med plasmiden pAM239, som kodar för en isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) inducerbara grönt fluorescerande protein (GFP) 28. Strimma bakteriestammarna PÅ järn och cystein kompletterat N-(2-acetamido)-2-aminoetansulfonsyra (ACES) buffrad träkol jästextraktagar (CYEA) innehållande 6,25 ug / ml kloramfenikol (CM) (för plasmid-underhåll) och inkubera under 72 h vid 37 ° C.
- Överför ett inokulum av bakteriestammen i kompletterade ACES buffrad buljong jästextrakt (AYE) med 6,25 ug / CM ml och 1 mM IPTG och odla till stationär fas (O / N) på en orbital skakanordning vid 37 ° C.
- Bekräfta GFP-uttryck i in vitro-kulturer med fluorescensmikroskopi. Överför 10 pl av kultur på ett objektglas under en luckaslip och bild med en 60X mål med GFP excitation / emission kub (AMG EVOS fl).
- Späd en 100 pl alikvot av varje odling in vitro till 1:10 med sterilt H 2 O Gör en tom med användning av 100 | il AYE medium med 1 mM IPTG och 6,25 pg / ml cm och vatten. Ta OD600 mätningar av spädningar med användning av en spektrofotometer (Bio-Rad Smart Spec Plus). Beräkna den volym som behövs för att infektera en brunn vid ett MOI = 20 för varje in vitro-odling: V = [(amöba ympad) x MOI] / [OD 600 x (utspädningsfaktor) x (konstant)] = [(1 X 10 6 ) x (20)] / [OD 600 X (10) X (1 x 10 6)] = 2/OD 600. Koncentration av bakterier bestäms som OD 600 = 1,0 = 1 x 10 9 CFU / ml.
2. Priming Stage Infektion Använda Acanthamoeba castellanii
- Underhålla och odla amöbor i ATCC 712 PYG medium i 175 cm 2 flaskor vid RT.
- Byt media i amöbor kulturTures 24 tim innan de bakteriella flytande kulturer. På samma dag flytande bakteriekulturer startas, samla och räkna celler på ett ljusmikroskop med användning av en hemocytometer.
- Späd amöbor med färskt medium till en slutlig koncentration av 1 x 10 6 celler / ml. Seed 12-brunnars cellodlingsplattor plattor med 1 ml alikvoter av amöbor med en repetitionspipetten och inkubera vid RT O / N.
- Efter inkubation tvättas brunnarna i 12-brunnars cellodlingsplattor 3x med 1 ml steril PBS med användning av en 10 ml serologisk pipett och en manuell pipett stöd.
- Efter aspiration av PBS, tillsätt 1 ml av infektion medier (ATCC 712 PYG medier minus glukos, pepton, och jästextrakt) med 1 mM IPTG och 6,25 pg / ml cm till varje brunn. Inkubera plattorna vid RT under 1 timme.
- Infect brunnar vid ett MOI = 20. Centrifugera plattan vid 400 xg under 5 minuter (Eppendorf 5810R) och flyta i en 37 ° C vattenbad under 5 min. Överför plattan till en 37 ° C, 5% CO-2-inkubator under 18 timmar.
- Bekräfta infektioner med levande cell imaging på ett fluorescensmikroskop före värdcellens lys och skörd av bakterier.
3. Ympning THP-1-celler för Målcell Stage Infektion
- (Börja denna process 24 h före inrätta flytande bakteriekulturer). Cultivate THP-1-celler i en 75 cm 2 odlingskolvar till nära-konfluens i RPMI 1640 medium med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS).
- Räkna suspensionsceller användning av en hemocytometer, späd THP-1-celler i RPMI 1640 medium med 10% FBS och 100 ng / ml forbol-12-myristat-13-acetat (PMA) till en koncentration av 1 x 10 6 celler / ml , och plattan i 1 ml alikvoter i 12-brunnars cellodlingsplattor. Inkubera plattorna under 48 timmar vid 37 ° C, 5% CO 2.
4. Behandling av bakterier för Målcell Stage Infektion efter Priming Stage Infektion
- Sug media från primade amöbor.
- Lysera enmoebae använda 500 | il iskall, steril ultrafiltrerad (UF) H 2 O och inkubera vid rumstemperatur under 10 minuter.
- Pool lysaten enligt anstränga typ och ta ett E 512 nm mätning för varje poolade lysaten med en fluorescens plattläsare (Molecular Devices Spectramax Gemini EM).
- Beräkna en OD 600 mätning för de sammanslagna lysaten: calcOD 600 = 0,0008 (E 512 - lysat bakgrund) + 0,0019. Formeln har tidigare bestämts genom grafiska en direkt jämförelse av både OD 600 och E 512 mätningar Nm utspädningar av L. pneumophila vildtyp uttryckande GFP från stationär fas odling in vitro (figur 1 *). De lysat av oinfekterade amöba, omfattas av samma experimentella villkor som den smittade amöban, används som en blank och gav en korrigering värde (t.ex. lysat bakgrund), som införlivades i ekvationen. Den volym som behövs to infektera en brunn vid en MOI = 20 beräknas för varje lysat pool: V = [(THP-1 seedade) x MOI] / [calcOD 600 x (konstant)] = [(1 X 10 6) X (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20 / calcOD 600.
- Tvätta THP-1-celler 3x med PBS och tillsätt 1 ml färskt RPMI 1640 (10% FBS) till varje brunn. Inkubera THP-1-celler under 1 timme vid 37 ° C, 5% CO 2.
- Infect THP-1 celler vid MOI beräknade med de poolade lysat. Låt en uppsättning brunnar att vara infekterade, som fungerar som en negativ kontroll för flödescytometrisk analys. Behandling av priming steget bör slutföras inom mindre än 30 minuter. Lysaten hålls på is för att begränsa eventuella förändringar i bakteriell genexpression före infektion.
- Centrifugera plattan, flyta att höja temperaturen, och inkubera som i den primande stadiet.
- En timme efter infektion, ta bort media genom aspiration och tvätta brunnar 3x med PBS för att avlägsna extracellulära bakterier.
- Tillsätt 1 ml fresh RPMI 1640 (10% FBS) till brunnarna och återföra plattan till inkubatorn. Tiden omedelbart efter media byte fungerar som tiden noll (T 0). Inkubera THP-1-celler under 14-16 timmar vid 37 ° C, 5% CO 2.
5. Experimentell analys
5,1 levande cell imaging
Image de infekterade brunnarna med en fluorescensmikroskop (AMG EVOS fl) vid 10X eller 20X förstoring (figurerna 1A-D). Bilderna kan jämföras antingen kvalitativt eller kvantitativt bestämma halterna av infektion i både priming scenen och målcell infektioner skede.
5,2 Flödescytometri
- De utsläpp toppar olika infektioner kan jämföras med flödescytometri (BD FACS Calibur). Trypsinisera de infekterade THP-1-celler och försiktigt tvätta dem från brunnarna genom blandning i PBS med en pipett.
- Pool cellerna genom stam typ i 15 ml Falcon-rör och pelleten vid 1.800 xg under 2min i bordscentrifug.
- Suspendera pellets i 1 ml PBS och överför till 1,5 ml mikrorör.
- Centrifugera suspensioner vid 1.800 x g (Eppendorf 5424) och återsuspendera pellets i 1 ml PBS. Om de resulterande suspensionerna är mycket grumligt (OD 600 ≥ 1,0) måste de spädas med ytterligare PBS (1:3) för att förhindra igensättning av ledningarna i flödescytometern.
- Använd sterilfiltreras PBS för utjämning av flödescytometern och tvättsteg mellan prov injektioner. Plotta den främre / sidospridning av oinfekterade målceller före injektion av infektion mål cellprover.
- Samla 20.000 totalt händelser för varje tillstånd med 488 excitation nm laser och FL1-kanalen.
- Gate efter capture cellpopulationer att utesluta oinfekterade celler och tomt fluorescens intensitet i ett histogram (FlowJo) (Figur 1E).
5,3 CFU plätering
- Undersök effektiviteten of infektion genom CFU plätering av cellerna skördats för flödescytometri. Bered seriespädningar av proven i ultrafiltrerad H 2 O vid 10 -1, 10 -2, och 10 -3.
- Platta 20 pl av varje spädning på 1/3 av en CYEA platta med 6,25 pg / ml CM.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C under 72 timmar.
- Räknas kolonierna med en tandpetare och cellräknare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett typiskt resultat för hela infektionen är beskriven i figur 1. Levande celler mikrofotografier fluorescens skildrar monoskikt av A.castellanii infekterade med vildtyp L. pneumophila under den primande steg visas i figur 1A. En framgångsrik mått på priming steget skulle leda till en befolkning på cirka 90% av värdcellerna innehåller stora vakuoler befolkade med GFP-märkta bakterier på detta MOI. Vid 18 timmar efter infektion, de flesta A. castellanii celler har uppnått maximalt bakteriella belastningar ännu lys av befolkningen är minimal. Under ljusmikroskop kommer en framgångsrik priming infektion avslöjar rundade och fristående amöbor. Gentamycin [25 | ig / ml] kan sättas till odlingsmediet 30 minuter till 1 timme efter infektion för att eliminera bidraget av extracellulära bakterier. Den Δ dota mutantstammen, vilket inte kan stödja Dot / ICM-medierad förflyttning av effektorer bör inte växa iA. castellanii och även in vitro kultur bör fluorescera liksom vildtypstammen, bör minimal fluorescens detekteras med denna stam vid 18 h efter infektion. Amöbor visas platt och monoskiktet vara intakt.
Totalt lysat hyser L. pneumophila och värdcell skräp omedelbart föremål för spektrofotometrisk analys för att beräkna koncentrationen av bakterier i provet. MOI kan beräknas med hjälp av sambandet kurvan (figur 1 *). Målceller måste vara beredda på infektion så att primade bakterier används mindre än 30 minuter efter lys för att bevara integriteten för genuttrycksprofilerna. När smittade, är målceller inkuberas 14-18 timmar innan de behandlas. Fluorescens mikrografer i figur 1B visar patogena fördel som protozo primade-vildtyp L. pneumophila i steg målcell infektioner av A. castellanii jämfört med identisk stam som var begränsad till in vitro-odling före infektion. Target cellstadiet infektioner är mindre robusta än den primande stadium på grund av införandet av ett tvättsteg 1-2 h efter infektion (målcell-beroende). Denna media ersättning avlägsnar icke-invasiva bakterier, synkronisering infektionen och minska bakgrundsfluorescens i efterföljande program. Siffror 1C-D visar fluorescens mikrofotografier av en typisk vildtyp L. pneumophila två steg infektion scenariot där bakterier först primas genom infektion av A. castellanii, skördas från lyserade protozoiska celler, kvantifieras med användning av korrelationen kurvan och användes för att infektera THP-1 makrofager under 14 timmar.
Efter mikroskopi, cellerna trypsiniseras för flödescytometri (BD FACS Calibur). Oinfekterade celler användes för att kalibrera maskinen för framåt och sidospridning. Infektioner med varje stam är processened med 20.000 registrerade händelser. FlowJo 7.6.1 mjukvara används för att analysera rådata. Typiskt fluorescens (488 nm excitation) först avsatt mot sidospridning att identifiera bakgrundsfluorescensen av infekterade cellpopulationen. Tomter grindas att utesluta denna population och åter ritas som ett histogram av totala räkningar kontra fluorescensintensitet. Eftersom varje bakteriecell representerar en enhet av fluorescens, intensiteten av signalen ger en representation av vakuolär belastningen i varje infekterad cell. En typisk kurva för en vild-typ infektion visas i Figur 1E. Sammantaget är det relativa antalet infekterade celler upptäckts av flödescytometern lägre än förväntat när man jämför med mikroskopi data. Levande celler flödescytometri är känslig nog dock att upptäcka stam variationer.
Kvantifiering av total CFU i proverna utförs genom att generera seriella utspädningar av celler framställda för flödescytometri och efterföljande pläteringpå CYEA medier. Efter 72 h vid 37 ° C, enstaka kolonier bör vara uppenbart och glesa nog för räkning.
Figur 1. Protozo grundning och målcell infektioner scenen med Legionella pneumophila. A. vildtyp eller typ IV sekretion bristfällig (Δ DOTA) L. pneumophila stammar inducerades att uttrycka GFP genom odling in vitro (små ramar) och användes för att infektera A. castellanii monoskikt för 18 timmar vid MOI = 20. Fluorescens mikrofotografier av infektioner med varje L. pneumophila stammen visas (stora bilder) som en sammanslagning av faskontrast och E 512 nm fluorescens bilder med en 20X objektiv på ett fluorescensmikroskop (AMG EVOS fl). Gröna halvmånar är representativa för intracellulära vacuolesharboring L. pneumophila. B. GFP fluorescens mikrografer av 18 h målcell stadiet infektion av A. castellanii med vildtyp L. pneumophila skördas från protozo priming steget infektion (överst) eller in vitro odlade (botten), där ifrågavarande MOI = 10 för varje beräknades med användning av ekvationen härledd från den visade korrelationen kurvan (blå *). Kurvan framställdes med användning serieutspädningar av vildtyp L. pneumophila uttryckande GFP från en 18 h odling in vitro. C. fluorescensmikrofoto av en primande steg infektion av A. castellanii med vildtyp L. pneumophila som i (A). D fluorescensmikrofoto av en 14 timmar målcell stadiet infektion av PMA differentierade THP-1 makrofager med vildtyp L. pneumophila skördas från protozo primande steget infektion i (C). MOI = 20 beräknades med hjälp av ekvation härrör från motsvarandeförhållande kurva visas (blå *). Ramen som visas är en sammanslagning av faskontrast och E512 nm fluorescens bilder som i (A). E. Histogram diagram över data flödescytometriinstrument jämför oinfekterade THP-1 makrofager (röd) och celler infekterade med protozoer primade vildtyp L. pneumophila (grön). Skala bar = 100 nm. Klicka här för att se större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriell genuttryck tätt kontrolleras genom en kombination av livscykeln progression och gensvar på signaler i den omgivande mikromiljön. Vakuolär patogener såsom L. pneumophila svarar på en mängd värd-cell-härledda signaler när uppdelade i en fagosomen. Som en kollektiv resultat av näringsämnen utmattning i värdcellen, kompenserar bakterien genom att uttrycka faktorer som krävs för en lyckad spridning till en efterföljande värdcell 25. L. pneumophila anpassade att effektivt parasiterar en mängd olika protozoiska celler och därför hyser en omfattande katalog av effektor-proteiner för att driva denna process. Dessa effektor proteiner translokeras direkt i den mottagande cytoplasman under infektion av Dot / ICM typ IVb sekretionssystemet 16. Effektorprotein translokering erfordras, såsom mutationer som resulterar i en defekt transportör helt upphäver intracellulär tillväxt i varje mottagande celltyp. Kuriosausly resulterade enskilda strykningar i synnerhet effektor proteiner sällan i intracellulär tillväxt dämpning. Nästan 300 effektorceller proteiner, eller nästan 10% av proteinet kodning genomet har validerats som Dot / ICM substrat 14,15. Flera hypoteser har framkommit att förklara bristen på observerbara fenotyper för effektor deletioner, inklusive förekomsten av paraloga kopior eller den horisontella förvärv av ortologa enzymer till följd av stora värdområde av L. pneumophila.
Eftersom L. pneumophila får en patogen fördel när pre-odlade i protozoer celler (Figurerna 1A-B), resonerade vi att in vitro odlade bakterier inte skulle visa samma genuttryck profil framgår i bakterier som lämnar Protozosjukdom värden. Därför kan uttryck av särskilda effektor proteiner endast induceras i samband med intracellulära tillväxt protozoiska celler. Om en viss effektor inte inducerades för eXpression under in vitro-odling, än bidraget från den deleterade effektorn kunde inte effektivt utvärderas i en traditionell infektion scenario. Fenotyper för virulensfaktorer viktiga för att fastställa infektion eller spridning skulle bara detekteras i förlängda infektioner som tillät cell till cell sprids. Vi försökte därför att utveckla en analys som kunde mäta bidraget av potentiella virulensfaktorer i samband med en sekventiell infektion. I fallet naturliga L. pneumophila förvärvet är det troligt att en mänsklig värd skulle möta en bakterie som hade grundats för infektion i en protozo cell, där protozoer kan vara mer motståndskraftiga mot traditionella kommunala metoder vattenrening 10.
För att optimera den partiella reningen av tillräckliga mängder av primade bakterier har vi etablerat först en visuellt lätthanterlig stam av L. pneumophila med användning av IPTG inducerbar GFP usjunga plasmidburen kopior av GFP lokuset. Vi genererade också en enda kopia kromosomal insättning av IPTG inducerbar GFP på vildtyp genomet. Även båda stammarna fluorescerar in vitro och under infektion, producerade högre kopietalet av plasmidburen GFP tillräcklig signal för efterföljande tillämpningar i analysen. Vi konstaterade att använda buljong odlade L. pneumophila vid ett MOI = 20 var tillräckligt för att kraftigt infektera A. castellanii monoskikt. Arton timmars inkubation bestämdes som optimalt att visualisera stora fluorescerande vakuoler utan att nå ett stadium av värdcell lys (Figur 1A). Protozoiska monolager inte följs plast cellodling, och är därför lätt att störd med tvättsteg. 12-brunnars cellodlingsplattor plattor producerade de mest stabila monoskikten jämfört med andra fartyg (6 eller 24 väl, 10 cm skål). Eftersom L. pneumophila kan inte växa i infektionen mediet som används i the grundning steg valde vi att överge alla tvätt för att avlägsna extracellulära bakterier. Detta förbättrar avsevärt utbytet av infekterade amöba i monolagret. Gentamycin är också ofta används för att döda extracellulära bakterier. Vi hittade protozo toxiska effekter vid koncentrationer över 25 ng / ml, och fann inga skillnader i det totala antalet bakterier återvunna från priming scenen infektion 18 timmar. Lys av protozo cellmonoskiktet utfördes med iskall ultrafiltrerad H 2 O, ett lösningsmedel som osmotiskt äventyrar värdcellen utan att skada L. pneumophila. Om anpassad för användning med patogener som inte är stabila i H 2 O, Triton X-100 i PBS 0,1% kan användas för att lysera amöbor med liknande resultat.
För att direkt jämföra stam till stam skillnader i efterföljande infektioner målceller, har en ekvation genereras för att korrelera optisk densitet av bakterier vid 600 nm med fluorescensemission av GFP vid 512 nm (Figure 1 *). Vi valde att använda fluorescensemission som ett medel för kvantifiering på grund av den stora bidrag av värdcell skräp i OD 600 mätningar från eukaryota cellysat. Denna hög bakgrund i kontrast till försumbara värden som observerats för emission vid 512 nm från samma lysat. Värden på OD 600 = 1,0 = 1x10 9 CFU / ml förutbestämda för L. pneumophila, vilket möjliggör beräkning av bakteriell koncentration över ett brett spektrum av fluorescensvärden. Många organismer har etablerat CFU-värden för OD 600 = 1,0, vilket skulle möjliggöra tillämpning av denna teknik till någon annan patogen genom generering av en korrelation kurva baserad på fluorescensemission. Vi valde att undvika en bakteriell reningssteg under lys av de protozoiska celler för att 1) maximera utbytet av primade bakterier tillgängliga för målcellen infektion och 2) minimera tiden mellan skörd och efterföljande infektion för att bevara den globala p genuttryckatterns.
In vitro odlade vildtyp L. pneumophila inducerades att uttrycka GFP i 18 timmar med 1 mM IPTG. Seriella spädningar av denna kultur användes för de spektrofotometriska mätningarna. Med hjälp av härledda ekvationen, var målceller infektioner rutinmässigt vid variabel MOI med konsekvent produktion. En MOI av 10 producerade ungefär 1/2 det totala antalet infekterade celler jämfört med infektioner som fått ett MOI av 20 (figurerna 1A-B). Vi har testat tre värdarna målcell med denna analys: A. castellanii, murina J774 makrofager och humana PMA-differentierade THP-1 makrofager. I varje fall var det resulterande infektion aldrig lika robust som priming infektion samtidigt MOI (figur 1C-D). Vi bestämde att det ett ytterligare tvättsteg under målcellen steget infektion, som utförs för att både synkronisera infektionen målcellen och minska extracellulära bakterier, är responsible för denna observation. Det är dock viktigt att experimentet internt styrs med en vildtyp stam för både grund-och målcell infektioner skede. Bakteriella mängder återvinns i priming steget är ganska begränsande för efterföljande infektioner därför endast ett enda mål celltyp bör användas per experiment.
Kvantifiering av målcellen infektion uppnåddes med tre metoder i denna analys. Fluorescensmikroskopi användes med en 20X objektiv. Bilder av vakuoler härbärgerar L. pneumophila var manuellt räknat från flera fält för varje testad stam. Flödescytometrisk analys gav en känslig åtgärd för skillnader infekterade totalt celler, liksom en tillnärmning av vakuolär last, där en högre fluorescenssignal korrelerade med bidrag från GFP-signal från allt fler L. pneumophila celler. Serieutspädning plätering som kvantitativa värden för totalt antalav CFU per volym i cellproverna som insamlats för flödescytometri. Tillsammans står dessa metoder möjliggör helt lätthanterlig och kvantifierbara resultat i en sekventiell infektion scenario.
Den priming-analysen är ganska mångsidig och passar för anpassning till varje bakteriell patogen som använder sötvatten protozoer som miljö intermediär 29,3. Valet av målcell kan tillgodoses för att passa den naturliga infektionen rutten för den speciella patogenen. Viktigt, kan en sekventiell infektion modell användas för att undersöka mutanta stammar som inte har lagt fram med en tillväxt fenotyp i en traditionell infektion modell med in vitro odlade bakterier. Transkriptionell profilering in vitro odlade bakterier för förmodade virulensfaktorer kan avslöja viktiga skillnader i profilen uttryck i den infekterade mellanliggande värden. Detta skulle kunna öppna en ny linje av utredning för funktion okarakteriserade proteiner och deras bidrag till naturligasmittvägar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Craig Roy och Dr Dario Zamboni för att ge en mall för protozo cell infektioner. Vi tackar Dr Jagdeep Obhrai, Dr Georgiana Purdy, Dr Fred Heffron och Todd Wisner för utrustning och reagenser, Dr Lulu Cambronne för kritisk granskning av manuskriptet. Flödescytometri utfördes på OHSU flödescytometri delad resurs anläggning. Detta arbete stöddes delvis av ett anslag från medicinsk forskning Stiftelsen Oregon och en NIH bidrag R21 AI088275 (EDC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
- Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
- Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
- Fields, B. S.
- Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
- Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
- Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
- King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
- Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
- Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
- Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 Forthcoming.
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
- Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
- Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
- Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
- Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).
