Summary
Denne teknikken gir en metode for å høste, normalisere og kvantifisere intracellulær vekst av bakterier som er pre-dyrket i naturlige protozo vertsceller før infeksjoner av pattedyrceller. Denne metoden kan bli endret for å imøtekomme en rekke vertsceller for priming scenen samt målet celletyper.
Abstract
Mange intracellulære bakterier bruker ferskvann protozoer som en naturlig reservoar for spredning i miljøet. Legionella pneumophila, den forårsaker agent av Legionærsykdommen lungebetennelse, får en sykdomsfremkallende fordel over in vitro dyrkede bakterier når den først høstes fra protozo celler før infeksjon av pattedyr makrofager. Dette antyder at viktige virulensfaktorer kanskje ikke riktig uttrykt in vitro. Vi har utviklet en medgjørlig system for priming L. pneumophila gjennom sin naturlige protozo vert Acanthamoeba castellanii før pattedyrcelle infeksjon. Bidraget av enhver virulens faktor kan bli undersøkt ved å sammenligne intracellulær veksten av en mutant stamme til villtype bakterier etter protozoan grunning. GFP-uttrykke villtype og mutant L. pneumophila stammer er brukt til å infisere protozo monolag i en grunning trinn og tillates å nå sene stadier av intracellulær vekst. Fluorescerende bakterier blir deretter høstet fra disse infiserte celler og normalisert ved spektrofotometri for å generere sammenlignbare antall bakterier for en etterfølgende infeksjon inn mammalske makrofager. For kvantifisering er levende bakterier overvåkes etter smitte med fluorescens mikroskopi, flowcytometri, og ved kolonien platekledning. Denne teknikken fremhever og er avhengig av bidrag fra verten celle-avhengige genuttrykk ved å etterligne miljøet som ville bli møtt i en naturlig oppkjøp rute. Denne tilnærmingen kan endres for å imøtekomme enhver bakterie som bruker et mellomledd vert som et middel for å få en sykdomsfremkallende fordel.
Introduction
Mange bakterielle patogener har tilpasset generaliserte strategier for å utnytte vertsceller for overlevelse og replikering i en intracellulær kupé. I mange tilfeller sykdomsfremkallende mekanismer er lik mellom protozoan og metazoan celler. Men disse to microenvironments er svært forskjellige, og kan resultere i ulike uttrykk av virulensfaktorer 1-4. Den legionellose bakterien Legionella pneumophila er overalt forbundet med ferskvannsmiljøer verden 5. Viktigere, L. pneumophila dyrket i protozo celler før infeksjon av humane monocytter få en patogen fordel, noe som antyder at global genekspresjonsanalyse profiler av bakterien spennende en protozoan celle er annerledes enn den in vitro dyrket organisme 6-8. I naturen, ferskvann amøber gir næringsrike confines for rask forsterkning av en invaderende bakterier. Menneskelig oppkjøpet av L. pneumophILA er oftest knyttet til innånding av forurensede vanndråper som inneholder bakterien. Det er sannsynlig at disse dråpene havnen protozo celle-tilknyttede bakterier, hvor protozo celler er mer motstandsdyktig mot konvensjonelle vannbehandling praksis 9,10. Infeksjon av lunge alveolære makrofager frem på en måte nesten identisk med den intracellulære livssyklus av bakterien i protozo vertsceller 11-13.
For å overleve og replikere i eukaryote celler, L. pneumophila bruker en spesiell type IVb sekresjon system betegnet Dot / ICM å levere nesten 300 'effektor' proteiner i cytosol av vertscellen 14-16. Disse effektor proteiner kollektivt fungere å styrte cellulære prosesser for å generere en replikering ettergivende rom for bakterien 17,18. Slettinger i noen av de 26 genene som utgjør Dot / ICM transporter resultat i stammer defekte for intracellulær multiplication 19-23. Historisk, sletting av enkelte effektor koding gener sjelden resulterte i stammer svekkede for intracellulær vekst. Dette fenomenet har blitt tilskrevet flere hypoteser, inkludert overflødig funksjon og paralogous kopier av effektorer.
Noen virulensfaktorer kun uttrykt i sammenheng med verten celle-assosiert intracellulær vekst 24. Vi rasjonaliserte at hvis en bestemt effektorfunksjon ble bare uttrykt i sammenheng med protozoan infeksjon, da bidraget fra den effektor ikke kunne sammenlignes med en vill-type stamme da begge ble dyrket in vitro. L. pneumophila overganger fra en replicative til en gjennomsiktig fase når den går inn stasjonær fase i kultur 25. Fasen switching fenotype representerer næringsstoff uttømming oppstod under intracellulær vekst og er eksemplifisert gjennom montering av flageller for motilitet 26. Fordi L. pneumophila er mer Invatende og virulente når høstet fra protozo celler, forsøkte vi å utvikle en metode som mer trofast representert sykdomsfremkallende tilstand av bakterien når det oppstått vert makrofager.
For dette formål, utviklet vi en allsidig protozo grunning analyse som kan romme noen egnet vert for både første (priming celle) og andre (målcellen) scenen infeksjoner. Infeksjonen prosessen er medgjørlig gjennom bruk av bakterier stabilt uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP). Infeksjonen modell for protozoan Acanthamoeba castellanii følger en metodikk mye brukt i feltet 27. For grunning trinn, L. pneumophila stammer dyrkes in vitro til stasjonær fase i flytende medier til å produsere merket "transmissive" bakterier (figur 1A). Bakterier er neste brukt til å infisere monolag til A. castellanii i 18 timer for å oppnå et sent stadium av det intracellulære livssyklus. Store vakuoler inneholdering bakterier kan visualiseres på dette tidspunkt med fluorescens mikroskopi (figur 1A). Protozo cellene blir deretter lysert og bakterier gjenvunnet fra lysatet blir målt for emisjon ved 512 nm ved hjelp av en fluorescens plateavleser. Fluorescens er korrelert med optisk tetthet for å beregne multiplisitet-of-infeksjon (MOI) for infeksjon av målceller (Figur 1, * Korrelasjon Curve). Etter invasjon (T 0) og 18 hr etter invasjon (T 18), blir målcellene kvantifisert for fluorescens, representerer intracellulære bakterier. Fluorescens kan overvåkes ved mikroskopi og strømningscytometri, og levedyktige tellinger kan måles gjennom koloni platekledning. Grunning analysen er alltid ledsaget av infeksjoner med villtype L. pneumophila og en belastning defekt i Dot / ICM type IV sekresjon system (Δ DotA) (figur 1A). Dette gir viktigere interne kontroller for direkte sammenligninger mellom villtype ennd eventuelle Isogene mutantstammer brukes i infeksjonsprosessen. Inkludering av avirulent Δ DotA belastning under priming scenen setter en grense for observasjon av svekkede vekst fenotyper forbundet med Isogene mutantstammer som blir dyrket in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Legionella pneumophila kulturer for Priming Stage Infeksjoner
- Transformere alle L. pneumophila stammer som brukes i analysen med plasmidet pAM239, som koder for en isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induseres grønt fluorescerende protein (GFP) 28. Strek de bakteriestammer bort på jern og cystein supplert N-(2-acetamido)-2-Aminoethanesulfonic acid (ACES) bufret trekull gjærekstrakt-agar (CYEA) inneholdende 6,25 ug / ml kloramfenikol (CM) (for plasmid vedlikehold) og inkuber i 72 time ved 37 ° C.
- Overføre et inokulum av bakteriestammen inn supplert ACES bufret gjærekstraktkraft (AYE) med 6,25 ug / ml CM og 1 mM IPTG og dyrke til stasjonær fase (O / N) på en orbital rister ved 37 ° C.
- Bekreft GFP uttrykk i in vitro kulturer med fluorescens mikroskopi. Overfør 10 pl kultur på en glass-slide under et dekselslip og bilde ved hjelp av en 60X objektiv med GFP eksitasjon / utslipp cube (AMG Evos fl).
- Fortynn en 100 pl alikvot av hver in vitro dyrking til 1:10 ved bruk av sterilt H 2 O. Lag en blank med 100 pl AYE media med 1 mM IPTG og 6,25 ug / ml cm og vann. Ta OD600 målinger av fortynninger med en spektrofotometer (Bio-Rad Smart Spec Plus). Beregn volumet nødvendig for å infisere en brønn ved en MOI = 20 for hver in vitro kultur: V = [(amøbe seeded) x MOI] / [OD 600 x (fortynningsfaktor) x (konstant)] = [(1 X 10 6 ) x (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. Konsentrasjonen av bakterier bestemmes som OD 600 = 1,0 = 1 x 10 9 CFU / ml.
2. Priming Stage Infeksjon Bruke Acanthamoeba castellanii
- Vedlikeholde og dyrke amøber i ATCC 712 PYG medium i 175 cm 2 kolber på RT.
- Erstatt medier i amøber culSkriftene 24 hr før de bakterielle flytende kulturer. På samme dag flytende bakteriekulturer er startet, samle og telle celler i et lysmikroskop med en hemocytometer.
- Fortynn amøber med ferske medier til en endelig konsentrasjon på 1 x 10 6 celler / ml. Seed 12-brønners cellekulturer plater med 1 ml alikvoter av amøber hjelp en gjenta pipetten og inkuber ved RT O / N.
- Etter inkubasjon vaskes brønnene til de 12-brønners cellekulturer plater 3x med 1 ml steril PBS ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette og en manuell pipette hjelpemiddel.
- Etter aspirasjon av PBS, legge 1ml av infeksjon medier (ATCC 712 PYG medier minus glukose, pepton, og gjærekstrakt) med 1 mM IPTG og 6,25 pg / ml cm til hver brønn. Inkuber platene ved RT i 1 time.
- Infisere brønner på en MOI = 20. Sentrifuger plate ved 400 xg i 5 minutter (Eppendorf 5810R) og flyter i en 37 ° C vannbad i 5 min. Overfører platene til en 37 ° C, 5% CO 2 inkubator i 18 timer.
- Bekreft infeksjoner med levende celle bildebehandling på en fluorescens mikroskop før vert cellelyse og høsting av bakterier.
3. Seeding THP-1 celler for Target Cell Stage Infeksjon
- (Begynn denne prosessen 24 timer før du sette opp væske bakteriekulturer). Dyrke THP-1-celler i en 75 cm 2 kultur kolber til nær-sammenflyting i RPMI 1640 media med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS).
- Telle suspensjon cellene ved hjelp av en hemocytometer, fortynne THP-1 celler i RPMI 1640 medium med 10% FBS og 100 ng / ml forbol-12-myristat-13-acetat (PMA) til en konsentrasjon av 1 x 10 6 celler / ml og plate i 1 ml alikvoter på 12-brønners cellekultur plater. Inkuber platene i 48 timer ved 37 ° C, 5% CO 2.
4. Behandling av bakterier for Target Cell Stage Infeksjon etter Priming Stage Infeksjon
- Aspirer media fra primet amøber.
- Lyse amoebae benytter 500 pl iskald, sterilt ultra-filtrert (UF) H 2 O og inkuber ved RT i 10 min.
- Bassenget lysater henhold anstrenge attraksjon og ta en E 512 nm måling for hver av de samlede lysater med en fluorescens plateavleser (Molecular Devices Spectramax Gemini EM).
- Beregn en OD 600 mål for de samlede lysates: calcOD 600 = 0,0008 (E 512 - lysate bakgrunn) + 0,0019. Formelen ble tidligere bestemt ved grafisk en direkte sammenligning av både OD 600 og e 512 nm målinger av fortynninger av L. pneumophila villtype uttrykke GFP fra stasjonær fase i vitro kultur (figur 1 *). De lysater av infisert amøbe, underlagt de samme eksperimentelle forhold som den infiserte amøbe, blir brukt som et tomt og gitt en korreksjon verdi (f.eks lysate bakgrunnen), som ble innlemmet i ligningen. Volumet nødvendig to infisere en brønn ved en MOI = 20 beregnes for hvert lysat basseng: V = [(THP-1 seeded) x MOI] / [calcOD 600 x (konstant)] = [(1 X 10 6) x (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20 / calcOD 600.
- Vask THP-1 celler 3x med PBS og tilsett 1 ml frisk RPMI 1640 (10% FBS) i hver brønn. Inkuber THP-1 celler i 1 time ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Infisere THP-1 celler med den beregnede MOI ved å bruke felles lysater. Tillat et sett av brønner å forbli uinfisert, tjener som en negativ kontroll for flowcytometrisk analyse. Behandling av priming scenen skal være ferdig i løpet av mindre enn 30 min. De lysates holdes på is for å begrense eventuelle endringer i bakteriell genuttrykk før infeksjon.
- Sentrifuger platen, flyte til heve temperaturen og inkuber som i grunning scenen.
- En time etter infeksjon, fjerner du mediet ved aspirasjon og vaske brønner 3x med PBS å fjerne ekstracellulære bakterier.
- Tilsett 1 ml fresh RPMI 1640 (10% FBS) til brønner og returnere platen til inkubatoren. Tiden umiddelbart etter media erstatning fungerer som tid null (T 0). Inkuber THP-1 celler for 14-16 timer ved 37 ° C, 5% CO 2.
5. Eksperimentell analyse
5.1 Levende celle bildebehandling
Bilde infiserte brønner ved hjelp av en fluorescens mikroskop (AMG Evos fl) på 10x eller 20x forstørrelse (Tall 1A-D). Bildene kan sammenlignes enten kvalitativt eller kvantitativt å bestemme nivåer av smitte i både grunning scenen og målcellen scenen infeksjoner.
5,2 Flowcytometri
- Utslippskravene topper av ulike infeksjoner kan sammenlignes med flowcytometri (BD FACS Calibur). Trypsinize de infiserte THP-1 celler og forsiktig vaske dem fra brønnene ved å blande i PBS med en pipette.
- Pool cellene ved belastning skriver inn 15 ml Falcon rør og pellet på 1800 xg for 2min i bordsentrifuge.
- Suspendere pellets i 1 ml PBS og overføre til 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Sentrifuger suspensjoner ved 1800 x g (Eppendorf 5424) og re-suspendere pellets i 1 ml PBS. Hvis de resulterende suspensjoner er meget grumset (OD 600 ≥ 1,0) de må fortynnes i ytterligere PBS (1:3) for å hindre tilstopping av linjene i strømningscytometer.
- Bruk sterilfiltrert PBS for ekvilibrering av strømningscytometer og for vasketrinnet mellom prøven injeksjoner. Plott forover / side scatter av infiserte målceller før injeksjon av målcellen infeksjon prøver.
- Samle 20000 totalt hendelser for hver tilstand ved hjelp av 488 nm laser eksitasjon og FL1-kanalen.
- Gate etter fangst cellepopulasjoner å ekskludere friske celler og tomten fluorescens intensitet i et histogram (FlowJo) (figur 1E).
5,3 CFU plating
- Undersøke effektiviteten of infeksjon av CFU plating av cellene høstes for strømningscytometri. Forbered serielle fortynninger av prøvene i ultra-filtrert H 2 O på 10 -1, 10 -2, og 10 -3.
- Plate 20 ul av hver fortynning på 1/3 av en CYEA plate med 6,25 ug / ml CM.
- Inkuber platene ved 37 ° C i 72 timer.
- Telle koloniene ved hjelp av en tannpirker og celleteller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et typisk resultat for hele infeksjonsprosessen er skissert i Figur 1. Lever celle fluorescens mikrografer skildrer monolayers av A.castellanii infisert med vill-type L. pneumophila under fyllingen stadiet vist i figur 1A. En vellykket mål på grunning skritt vil føre til en befolkning på ca 90% av vertsceller inneholder store vakuoler befolket med GFP merkede bakterier på dette MOI. Ved 18 timers post-infeksjon, mest A. castellanii celler har oppnådd maksimal bakterielle laster ennå lysis av befolkningen er minimal. Under lysmikroskopi, vil en vellykket priming infeksjon avsløre avrundet og frittliggende amøber. Gentamycin [25 ug / ml] kan tilsettes til kulturmediet 30 min til 1 time etter infeksjon for å eliminere bidraget av ekstracellulære bakterier. Den Δ DotA mutant belastningen, som ikke kan støtte Dot / ICM-mediert translokasjon av effektorer, bør ikke vokse iA. castellanii og selv om in vitro kultur bør fluoresce samt villtype stamme, bør minimal fluorescens påvises med denne stamme ved 18 hr etter infeksjon. Amøber vises flat og monolayer skal være intakt.
Totalt lysates skjuler L. pneumophila og vert celleavfall umiddelbart underkastet spektrofotometrisk analyse for å beregne konsentrasjonen av bakterier i prøven. MOI kan beregnes ved hjelp av korrelasjon kurven (figur 1 *). Målcellene må være forberedt på infeksjon slik at primet bakterier brukes mindre enn 30 minutter etter lysis å bevare integriteten av genuttrykk profiler. Når smittet, er målceller inkubert i 14-18 timer før de blir behandlet. Fluorescens mikrografer i figur 1B demonstrere sykdomsfremkallende fordel kjøpt av protozo-primet villtype L. pneumophila i målcellen scenen infeksjoner av A. castellanii når sammenlignet med identisk stamme som var begrenset til in vitro dyrking før infeksjon. Målcellen scenen infeksjoner er mindre robust enn grunning scenen på grunn av inkludering av en vasketrinn 1-2 hr post-infeksjon (målcellen-avhengige). Dette mediet erstatning trinnet fjerner ikke-invasive bakterier, synkronisering infeksjonen og redusere bakgrunnsfluorescens ved senere søknader. Tall 1C-D demonstrere fluorescens mikrografer av en typisk villtype L. pneumophila totrinns infeksjon scenario, der bakterier er første primet gjennom smitte av A. castellanii, høstet fra lyserte protozo celler, kvantifiseres ved korrelasjonen kurve og brukt til å infisere THP-1 makrofager i 14 timer.
Etter mikroskopi, er celler trypsinert for flowcytometri (BD FACS Calibur). Infiserte celler brukes til å kalibrere maskinen for forover og sidespredning. Infeksjoner med hver stamme er prosessened med 20.000 registrerte hendelser. FlowJo 7.6.1-programvaren brukes til å analysere rådata. Vanligvis er fluorescens (488 nm eksitasjon) første plottet mot sidespredning å identifisere bakgrunnsfluorescens av infisert cellepopulasjon. Tomter er gated å utelukke denne pasientgruppen og re-plottet som et histogram av totalt teller versus fluorescens intensitet. Fordi hver bakteriecelle representerer en enhet av fluorescens, intensiteten av signalet gir en representasjon av vacuolar lasten i hver infiserte celle. En typisk plott av en vill-type infeksjon er vist i figur 1E. Totalt sett er det relative antall infiserte celler oppdages av strømningscytometeret lavere enn forventet når man sammenligner med mikroskopi data. Levende celle flowcytometri er følsom nok imidlertid å oppdage belastningsskader avvik.
Kvantifisering av total CFU er i prøvene utføres ved å generere serielle fortynninger av cellene preparert for strømningscytometri og påfølgende platingpå CYEA media. Etter 72 timer ved 37 ° C, enkelt kolonier bør være tydelig og sparsom nok for telling.
Figur 1. Protozoan grunning og målcellen scenen infeksjoner ved hjelp Legionella pneumophila. A. Wild-type eller type IV sekresjon mangelfull (Δ DotA) L. pneumophila stammer overtalt til å uttrykke GFP gjennom in vitro kultur (små rammer) og brukes til å infisere A. castellanii monolayers for 18 timer på MOI = 20. Fluorescens mikrografer av infeksjoner med hver L. pneumophila stamme vises (store bilder) som en sammenslåing av fase kontrast og E 512 nm fluorescens bilder med en 20X objektiv på en fluorescens mikroskop (AMG Evos fl). Grønne halvmåner er representative for intracellulær vacuolesharboring L. pneumophila. B. GFP fluorescens mikrografer av 18 timer målcellen scenen infeksjon av A. castellanii med vill-type L. pneumophila høstes fra protozoan priming scenen infeksjon (øverst) eller in vitro dyrkede (nederst), hvor MOI = 10 for hver ble beregnet ved hjelp av ligningen avledet fra korrelasjonen kurve vist (blå *). Kurven ble produsert med serielle fortynninger av vill-type L. pneumophila uttrykke GFP fra en 18 timers in vitro kultur. C. Fluorescens mikrografi av en grunning stadium infeksjon av A. castellanii med vill-type L. pneumophila som i (A). D. Fluorescence mikrografi av en 14 timers målcellen stadium infeksjon av PMA differensiert THP-1 makrofager med villtype L. pneumophila høstes fra protozoan priming scenen infeksjon i (C). MOI = 20 ble beregnet ved hjelp av ligningen avledet fra correlasjon kurve vist (blå *). Rammen som vises er en sammenslåing av fase kontrast og E512 nm fluorescens bilder som i (A). E. Histogram tomt på flowcytometri data sammenligne friske THP-1 makrofager (rød) og celler infisert med protozo grunnet villtype L. pneumophila (grønn). Målestokk = 100 mikrometer. Klikk her for å se større figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakteriell genekspresjon strengt kontrollert gjennom en kombinasjon av livssyklus progresjon og som reaksjon på signaler i den omkringliggende mikromiljøet. Vacuolar patogener som L. pneumophila svare på en rekke vert celle-avledet signaler når compartmentalized i en phagosome. Som en kollektiv resultat av næringsstoff konsumpsjon i vertscellen, kompenserer bakterien ved å uttrykke faktorer som kreves for vellykket formidling til en etterfølgende vertscelle 25. L. pneumophila innrettet til effektivt parasitter et bredt utvalg av protozo celler og derfor havner en omfattende katalog av effektor proteiner å drive denne prosess. Disse proteiner er effektor translocated direkte i verten cytoplasma under infeksjonen av DOT / ICM attraksjon IVb sekresjon system 16. Effektor protein translokasjon kreves, som mutasjoner som resulterer i en defekt transportør helt oppheve intracellulær vekst i noen vert celletype. Curiously, individuelle slettinger spesielt effektor proteiner resulterte sjelden i intracellulær vekst demping. Nesten 300 effektor proteiner, eller nesten 10% av proteinet koding genomet har blitt validert som Dot / ICM underlag 14,15. Flere hypoteser har kommet for å forklare mangelen på observerbare fenotyper for effektor slettinger, inkludert tilstedeværelsen av paralogous kopier eller den horisontale kjøp av orthologous enzymer følge fra bredt vertsområde av L. pneumophila.
Fordi L. pneumophila får en patogen fordel når pre-dyrket i protozo celler (figurene 1A-B), begrunnet vi at in vitro dyrkede bakterier ikke ville vise samme gene expression profilen tilsynelatende i bakterier avslutter protozoan verten. Derfor, kunne uttrykket av bestemte effektor proteiner kun induseres i sammenheng av intracellulær vekst i protozo celler. Hvis en bestemt effektorfunksjon ikke ble indusert for eXpression under in vitro kultur, enn bidraget av den slettede effektor kunne ikke bli effektivt evaluert i en tradisjonell infeksjon scenario. Fenotyper for virulens faktorer som er viktige for etablering av infeksjon eller spredning ville bare bli oppdaget i lengre infeksjoner som er tillatt for celle til celle spredning. Vi derfor søkt å utvikle en metode som kunne måle bidraget av potensielle virulensfaktorer i sammenheng av en sekvensiell infeksjon. I tilfelle av naturlig L. pneumophila kjøpet, er det sannsynlig at en menneskelig vert ville møte en bakterie som hadde blitt primet for infeksjon i en protozoan celle, hvor protozoer kan være mer motstandsdyktig mot tradisjonelle kommunale vannbehandling praksis 10.
For å optimalisere den delvise rensning av tilstrekkelige mengder primet bakterier, vi først etablert en visuelt medgjørlig stamme av L. pneumophila hjelp IPTG induserbar GFP usynge plasmid borne kopier av GFP locus. Vi har også generert en enkelt kopi kromosomalt innsetting av IPTG induserbar GFP på villtype genom. Selv begge stammer fluoresce in vitro og under infeksjonen produserte høyere kopitall av plasmidet-borne GFP tilstrekkelig signal for nedstrøms applikasjoner i analysen. Vi etablert at bruk av kjøttkraft kultivert L. pneumophila ved en MOI = 20 var tilstrekkelig til tungt infisere A. castellanii monolayers. Atten timer inkubasjon ble bestemt som optimalt å visualisere store fluorescerende vakuoler uten å nå et stadium av vert cellelyse (figur 1A). Protozo monolayers er ikke overholdt cellekultur plast, og er derfor lett forstyrret med vasketrinnene. 12-brønners cellekulturer plater produserte de mest stabile monolag sammenlignet med andre fartøy (6 eller 24 godt, 10 cm parabol). Fordi L. pneumophila kan ikke vokse i infeksjonen mediet som brukes i the grunning trinn, valgte vi å forlate noen vask trinn for å fjerne ekstracellulære bakterier. Dette forbedrer utbyttet av infiserte amøbe i monolayer. Gentamycin er også ofte brukt til å drepe ekstracellulære bakterier. Vi fant protozo giftvirkninger ved konsentrasjoner over 25 pg / ml, og fant ingen forskjeller i det totale antall bakterier gjenvunnet fra grunning scenen infeksjonen i 18 timer. Lyse av protozoan cellen monolayer ble utført med iskald ultra-filtrert H 2 O, et løsningsmiddel som osmotisk kompromitterer vertscellen uten å skade L. pneumophila. Hvis tilpasset for bruk med patogener som ikke stabil i H 2 O, 0,1% Triton X-100 i PBS kan brukes for å lysere amøber med lignende resultater.
For å direkte sammenligne belastningen anstrenge forskjeller i påfølgende målcellen infeksjoner, ble en ligning generert å korrelere optisk tetthet av bakterier på 600 nm med fluorescens utslipp av GFP på 512 nm (Figure 1 *). Vi valgte å bruke fluorescensemisjon som et middel for kvantifisering grunnet store bidrag vertscelle rusk i OD 600 målinger fra eukaryotiske cellelysater. Denne høye bakgrunn kontrastert med neglisjerbare verdier observert for utslipp på 512 nm fra samme lysates. Verdier av OD 600 = 1,0 = 1x10 9 CFU / ml ble forhåndsbestemt for L. pneumophila, slik at for beregning av bakteriell konsentrasjon over et bredt spekter av fluorescence verdier. Mange organismer har etablert CFU verdier for OD 600 = 1,0, som ville tillate bruk av denne teknikken til andre patogen gjennom generering av en korrelasjon kurve basert på fluorescensemisjonen. Vi valgte å unngå en bakteriell rensetrinn under lyse av de protozo celler for å 1) maksimere utbyttet av primet bakterier tilgjengelige for målcellen infeksjon og 2) minimere tiden mellom innhøsting og påfølgende infeksjon å bevare global genekspresjonsanalyse patterns.
In vitro dyrkede villtype L. pneumophila ble indusert til å uttrykke GFP i 18 timer med 1 mM IPTG. Seriefortynninger av denne kulturen ble brukt for de spektrofotometriske målinger. Bruke avledet ligningen ble målcellen infeksjoner rutinemessig utført ved variabel MOI-tallet med konsekvent utgang. En MOI av 10 produsert ca 1/2 antall totale infiserte celler når sammenlignet med infeksjoner som mottok en MOI på 20 (figurene 1A-B). Vi har testet tre målcellen verter med denne analysen, A. castellanii, murine J774 makrofager og menneskelige PMA-differensiert THP-1 makrofager. I hvert tilfelle, ble det resulterende infeksjon aldri så robuste som priming infeksjon samtidig MOI (Tall 1C-D). Vi fastslått at at et ytterligere vasketrinn under målcellen stadium infeksjon, som er utført til både synkronisere målcellen infeksjon og redusere ekstracellulære bakterier, er responsible for denne observasjonen. Likevel er det avgjørende at forsøket er internt kontrollert med en vill-type belastning for både grunning og målcellen scenen infeksjoner. Bakterielle mengdene i priming trinnet ganske begrensende for etterfølgende infeksjoner, derfor bare et enkelt mål celletype bør brukes per eksperiment.
Kvantifisering av målcellen infeksjon ble oppnådd ved hjelp av tre metoder i denne analysen. Fluorescensmikroskopi ble brukt med en 20X objektiv. Bilder av vakuoler skjuler L. pneumophila ble manuelt telles fra flere felt for hver stamme testet. Flowcytometrisk analyse tilgjengelig en følsom tiltak for forskjeller i totale celler infisert, samt en tilnærming til vacuolar last, hvor en høyere fluorescens signal ble korrelert med bidrag av GFP signal fra økende antall L. pneumophila celler. Seriefortynning plating gitt kvantitative verdier for totalt antallav CFU er per volum i cellen prøver samlet for flowcytometri. Sammen er disse metodene tillater fullt medgjørlig og kvantifiserbare resultater i en sekvensiell infeksjon scenario.
Grunningen analysen er ganske allsidig, og er egnet for tilpasning til ethvert bakteriell patogen som bruker ferskvann protozoer som en miljømessig mellomprodukt 29,3. Valg av målcellen kan arrangeres til å passe den naturlige smitteveien for bestemt patogen. Viktigere, kan en sekvensiell infeksjon modellen brukes for å undersøke mutantstammer som ikke tilstede med en vekst fenotype i en tradisjonell infeksjon modell ved hjelp in vitro dyrkede bakterier. Transcriptional profilering i vitro dyrkede bakterier av antatte virulensfaktorer kunne avsløre viktige forskjeller i profilen til uttrykket i den infiserte mellomvert. Dette kunne åpne en ny linje av etterforskning for funksjonen av uncharacterized proteiner og deres bidrag til naturligsmitteveier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Craig Roy og Dr. Dario Zamboni for å gi en mal for protozo celle infeksjoner. Vi takker Dr. Jagdeep Obhrai, Dr. Georgiana Purdy, Dr. Fred Heffron og Todd Wisner for utstyr og reagenser, Dr. Lulu Cambronne for kritisk gjennomgang av manuskriptet. Flowcytometri ble utført ved OHSU flowcytometri delt ressurs anlegget. Dette arbeidet ble støttet delvis av en bevilgning fra Medical Research Foundation of Oregon og en NIH stipend R21 AI088275 (EDC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
- Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
- Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
- Fields, B. S.
- Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
- Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
- Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
- King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
- Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
- Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
- Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 Forthcoming.
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
- Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
- Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
- Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
- Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).
