Summary
Deze techniek verschaft een werkwijze te oogsten, normaliseren en kwantificeren intracellulaire groei van bacteriële pathogenen die vooraf gekweekt in natuurlijke protozoa gastheercellen voor infecties van zoogdiercellen. Deze methode kan worden aangepast aan een grote verscheidenheid van gastheercellen voor de priming podium en doelcel types tegemoet.
Abstract
Vele intracellulaire bacteriële pathogenen gebruiken zoetwater protozoa als natuurlijke reservoir tot proliferatie in het milieu. Legionella pneumophila, de veroorzaker van de veteranenziekte longontsteking, krijgt een pathogeen ten opzichte van in vitro gekweekte bacteriën bij eerste geoogst protozoa cellen voor infectie van zoogdierlijke macrofagen. Dit suggereert dat belangrijke virulentiefactoren niet goed worden uitgedrukt in vitro. We hebben een handelbaar systeem voor priming L. pneumophila door haar natuurlijke protozoaire gastheer Acanthamoebacastellanii voorafgaand aan zoogdiercellen infectie. De bijdrage van elke virulentiefactor kan worden onderzocht door het vergelijken van intracellulaire groei van een mutant stam met wildtype bacteriën na priming protozoa. GFP-expressie wild-type en mutant L. pneumophila stammen worden gebruikt om protozoa monolagen infecteren in een priming stap en men late stadia van intracellulaire groei bereiken. Fluorescerende bacteriën worden geoogst van deze geïnfecteerde cellen en genormaliseerd door spectrofotometrie vergelijkbare aantallen bacteriën voor een volgende infectie in zoogdierlijke macrofagen genereren. Voor de kwantificering worden levende bacteriën gecontroleerd na infectie met fluorescentie microscopie, flowcytometrie en door kolonie plating. Deze techniek belicht en vertrouwt op de bijdrage van gastheercel-afhankelijke genexpressie door het nabootsen van de omgeving die zou worden aangetroffen in een natuurlijke acquisitie route. Deze benadering kan worden gewijzigd om een bacterie die een intermediaire gastheer gebruikt als een middel voor het verkrijgen van een pathogene voordeel bieden.
Introduction
Tal van bacteriële pathogenen hebben zich aangepast algemene strategieën om gastheercellen voor overleving en replicatie in een intracellulair compartiment te exploiteren. In veel gevallen pathogene mechanismen vergelijkbaar protozoaire en metazoïsche cellen. Deze twee micromilieus zeer verschillend en kunnen resulteren in differentiële expressie van virulentiefactoren 1-4. De veteranenziekte bacterie Legionella pneumophila is alomtegenwoordig geassocieerd met zoetwater omgevingen over de hele wereld 5. Belangrijker L. pneumophila gekweekt in protozoa cellen voor infectie van humane monocyten krijgen een pathogene voordeel suggereert dat globale genexpressie profielen van de bacterie verlaat een protozoa cel zijn anders dan die van de in vitro gekweekte organisme 6-8. In de natuur, zoetwater amoeben geven voedselrijk grenzen voor snelle amplificatie van een binnenvallende bacterie. Human overname van L. pneumophila wordt meestal toegeschreven aan inademing van besmet water druppels die de bacterie bevatten. Het is waarschijnlijk dat deze druppeltjes haven protozoa cel-geassocieerde bacteriën, protozoa, waar cellen meer resistent zijn voor conventionele waterbehandeling praktijken 9,10. Infectie van long alveolaire macrofagen verloopt op een wijze die nagenoeg identiek aan de intracellulaire levenscyclus van de bacterie in protozoa gastheercellen 11-13.
Om te overleven en repliceren in eukaryotische cellen, L. pneumophila gebruikt een speciaal type IVb secretiesysteem genoemd Dot / Icm tot bijna 300 'effector' eiwitten te leveren in het cytosol van de gastheercel 14-16. Deze effector eiwitten collectief functioneren om cellulaire processen ondermijnen om een replicatie permissieve compartiment voor de bacterie 17,18 genereren. Deleties in elk van de 26 genen die de Dot / Icm transporter resultaat stammen gebrekkig intracellulaire mult omvatteniplication 19-23. Historisch deletie van afzonderlijke effector coderende genen zelden geleid stammen verzwakt voor intracellulaire groei. Dit fenomeen wordt toegeschreven aan verschillende hypothesen waaronder redundante functie en paraloge kopieën van effectoren.
Sommige virulentiefactoren alleen uitgedrukt in de context van gastheercel-geassocieerde intracellulaire groei 24. We gerationaliseerd dat indien een bepaalde effector werd enkel in de context van protozoaire infectie dan de bijdrage van de effector kan worden vergeleken met een wild-type stam wanneer beide werden gekweekt in vitro. L. pneumophila overgangen van een replicatieve een doorlatende fase komt deze stationaire fase in cultuur 25. De fase-draaing fenotype vertegenwoordigt de tekort aan nutriënten die tijdens intracellulaire groei en wordt geïllustreerd door middel van montage van flagella voor motiliteit 26. Omdat L. pneumophila is meer invasiesieve en virulente wanneer geoogst van protozoaire cellen, zochten we naar een test waarmee meer getrouw de pathogene toestand van de bacterie vertegenwoordigde toen het geconfronteerd gastheer macrofagen ontwikkelen.
Hiervoor hebben we een veelzijdige protozoa priming assay dat geschikte gastheer voor zowel de eerste (priming cel) en tweede (doelcel) fase infecties geschikt. De infectie proces tractable door gebruik van bacteriën die stabiel green fluorescent protein (GFP). De infectie model voor de protozoaire Acanthamoebacastellanii volgt een methode op grote schaal gebruikt op het gebied 27. De aanzuiging stap L. pneumophila stammen worden gekweekt in vitro naar stationaire fase in vloeibare media als 'doorlatende' bacteriën (Figuur 1A) produceren. Bacteriën worden vervolgens gebruikt om monolagen van A. infecteren castellanii gedurende 18 uur op een laat stadium van de intracellulaire levenscyclus te bereiken. Grote vacuolen bevattenbacteriën te kunnen gevisualiseerd op dit tijdstip met fluorescentiemicroscopie (Figuur 1A). Protozoa cellen worden daarna gelyseerd en bacteriën gewonnen uit het lysaat worden gemeten emissie bij 512 nm met een fluorescentie-plaatlezer. Fluorescentie wordt gecorreleerd met optische dichtheid veelvoud-van-infectie (MOI) te berekenen voor de infectie van doelcellen (figuur 1 * Correlatie Curve). Na invasie (T 0) en 18 uur post-invasie (T 18), zijn doelcellen gekwantificeerd voor fluorescentie, wat neerkomt op intracellulaire bacteriën. Fluorescentie kan worden gevolgd door microscopie en flowcytometrie, en levensvatbare tellingen kan worden gemeten door kolonie plating. De priming test wordt altijd begeleid door infecties met wild-type L. pneumophila en een stam defect in de Dot / Icm type IV secretiesysteem (Δ DOTA) (Figuur 1A). Dit biedt vooral interne controles voor directe vergelijkingen tussen wild-type eennd elke mutant isogene stammen die in het infectieproces. De opname van de avirulente stam Δ DOTA tijdens het vullen decors een drempelwaarde voor waarneming van verzwakte groei fenotypen geassocieerd met isogene mutanten die worden gekweekt in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Legionella pneumophila Cultures for Priming Stage Infecties
- Transformeer alle L. pneumophila stammen die in de bepaling met het plasmide pAM239, codeert voor een isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induceerbare green fluorescent protein (GFP) 28. Streak de bacteriestammen op ijzer en cysteine aangevuld N-(2-acetamido)-2-aminoethaansulfonzuur (ACES) gebufferde kool gistextractagar (CYEA) met 6,25 pg / ml chlooramfenicol (CM) (voor plasmide onderhoud) en incubeer gedurende 72 uur bij 37 ° C.
- Breng een inoculum van de bacteriestam in aangevuld ACES gebufferde gistextract bouillon (AYE) met 6,25 ug / ml CM en 1 mM IPTG en cultiveren stationaire fase (O / N) in een orbitale schudder bij 37 ° C.
- Bevestigen GFP expressie in de in vitro kweken met fluorescentiemicroscopie. Breng 10 ul van cultuur op een glasplaatje onder een afdekkingslip en beeld met behulp van een 60X objectief met GFP excitatie / emissie cube (AMG EVOS fl).
- Verdun een 100 pi aliquot van elke in vitro kweek tot 1:10 met steriel H2O Een blanco met 100 pi AYE media met 1 mM IPTG en 6,25 ug / ml en cm water. Neem OD600 metingen van de verdunningen met een spectrofotometer (Bio-Rad Smart Spec Plus). Bereken het volume nodig om een goed infecteren met een MOI = 20 voor elke in vitro culture: V = [(amoebe gezaaid) x MOI] / [OD 600 x (verdunningsfactor) x (constant)] = [(1 x 10 6 ) x (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. Bacterieconcentratie bepaald als OD 600 = 1.0 = 1 x 10 9 CFU / ml.
2. Priming Stage infectie met behulp van Acanthamoebacastellanii
- Onderhouden en cultiveren de amoeben in ATCC 712 PYG medium in 175 cm 2 flessen bij kamertemperatuur.
- Vervang media in amoeben culren 24 uur voordat de bacteriële vloeibare kweken. Op dezelfde dag vloeibare bacterieculturen worden gestart, te verzamelen en te tellen cellen op een microscoop met een hemocytometer.
- Verdun het amoeben met vers medium tot een eindconcentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. Seed 12-well celkweek-platen met 1 ml van de amoeben met een pipet repeat en incubeer bij kamertemperatuur O / N.
- Na incubatie was de putjes van de 12-well platen celkweek 3x met 1 ml steriele PBS met een 10 ml pipet en een serologische pipet handmatige hulp.
- Na aspiratie van PBS, voeg 1 ml media infecties (ATCC 712 PYG media minus glucose, pepton en gistextract) met 1 mM IPTG en 6,25 ug / ml cm in elk putje. Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Infect putjes bij een MOI = 20. Centrifugeer de plaat bij 400 xg gedurende 5 min (Eppendorf 5810R) en drijven in een 37 ° C waterbad gedurende 5 minuten. Breng de plaat op een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 18 uur.
- Bevestig de infecties met behulp van live cell imaging op een fluorescentiemicroscoop voorafgaand aan cellysis en oogst van bacteriën te hosten.
3. Zaaien THP-1-cellen voor Target Cell Stage Infectie
- (Begin dit proces 24 uur voorafgaand aan het opzetten van vloeibare bacteriële culturen). Cultiveren THP-1-cellen in een 75 cm2 cultuur flessen tot bijna confluentie in RPMI 1640 medium met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS).
- Tel de suspensiecellen met een hemocytometer verdunnen THP-1 cellen in RPMI 1640 medium met 10% FBS en 100 ng / ml forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA) tot een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml en plaat in 1 ml aliquots van 12-well platen celkweek. Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
4. Verwerking van bacteriën voor Target Cell Stage Infectie na de Priming Stage Infectie
- Zuig het materiaal uit de primer amoeben.
- Lyse de amoebae met 500 pl ijskoud steriel ultra gefiltreerde (UF) H 2 O en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Pool de lysaten volgens type stam en een E 512 nm gemeten voor elk van de gepoolde lysaten met fluorescentie plaatlezer (Molecular Devices SpectraMax Gemini EM) nemen.
- Bereken een OD 600 meting voor de gepoolde lysaten: calcOD 600 = 0.0008 (E 512 - lysaat achtergrond) + 0,0019. De formule is eerder bepaald door een directe vergelijking grafieken van zowel de OD 600 en E 512 nm metingen van verdunningen van L. pneumophila wild-type GFP expressie van stationaire fase in vitro kweek (Figuur 1 *). De lysaten van geïnfecteerde amoebe, onder dezelfde experimentele omstandigheden als de geïnfecteerde amoebe, worden gebruikt als blanco en voorzien van een correctiewaarde (bijv. lysaat achtergrond), dat is opgenomen in de vergelijking. De omvang die nodig to een goed infecteren met een MOI = 20 wordt berekend voor elk lysaat pool: V = [(THP-1 geplaatste) x MOI] / [calcOD 600 x (constant)] = [(1 X 10 6) x (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20 / calcOD 600.
- Was de THP-1 cellen 3x met PBS en voeg 1 ml vers RPMI 1640 (10% FBS) in elk putje. Incubate THP-1-cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
- Infect de THP-1 cellen in de berekende MOI met de gepoolde lysaten. Laat een reeks kommetjes blijven geïnfecteerde, die als een negatieve controle voor flowcytometrische analyse. Verwerking van de priming fase moet worden afgerond in minder dan 30 minuten. De lysaten worden op ijs bewaard om veranderingen in bacteriële genexpressie beperkt vóór infectie.
- Centrifugeer de plaat, zweven om de temperatuur te verhogen, en incubeer als in de priming stadium.
- Een uur na de infectie, verwijdert u de media door aspiratie en wassen putten 3x met PBS om extracellulaire bacteriën te verwijderen.
- Fre Voeg 1 mlsh RPMI 1640 (10% FBS) in de putjes en de plaat terug in de incubator. De tijd onmiddellijk na de media vervangen dient als tijdstip nul (T 0). Incubeer de THP-1-cellen 14-16 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
5. Experimental Analysis
5,1 live cell imaging
Beeld de geïnfecteerde wells met een fluorescentiemicroscoop (AMG EVOS fl) bij 10X en 20X vergroting (Figuren 1A-D). De beelden kunnen worden vergeleken ofwel kwalitatief of kwantitatief niveaus van infectie in zowel de priming fase en doelcel fase infecties bepalen.
5,2 Flowcytometrie
- De emissiepieken van verschillende infecties kunnen worden vergeleken door middel van flowcytometrie (BD FACS Calibur). Trypsinize de THP-1 geïnfecteerde cellen en voorzichtig te wassen van de putjes door het mengen in PBS met een pipet.
- Verzamel de cellen door stamtype in 15 ml Falcon buizen en pellet bij 1800 xg gedurende 2min in het tafelblad centrifuge.
- Suspendeer de pellets in 1 ml PBS en over te brengen naar 1,5 ml microcentrifugebuisjes.
- Centrifugeer de schorsingen bij 1.800 x g (Eppendorf 5424) en resuspendeer de pellets in 1 ml PBS. Als de resulterende suspensies zijn zeer troebel (OD 600 ≥ 1,0) moeten worden verdund in PBS extra (1:3) om verstopping van de lijnen in de flowcytometer voorkomen.
- Steriel gefiltreerd PBS voor equilibratie van de stromingscytometer en wasstappen tussen sample injecties. Zet de vooruit / zijwaartse verstrooiing van niet-geïnfecteerde doelcellen voorafgaand aan de injectie van doelcel infectie monsters.
- Verzamel 20.000 totale evenementen voor elke conditie met behulp van 488 nm laser excitatie en de FL1 kanaal.
- Gate post-capture celpopulaties bij niet-geïnfecteerde cellen en plot fluorescentie-intensiteit in een histogram (FlowJo) (figuur 1E) uit te sluiten.
5,3 CFU plating
- Onderzoek de efficiency of infectie door CFU plateren van de cellen geoogst voor flowcytometrie. Bereid seriële verdunningen van de monsters in ultra gefiltreerde H 2 O bij 10 -1, 10 -2 en 10 -3.
- Plaat 20 pi van elke verdunning op 1/3 van een CYEA plaat met 6,25 ug / ml CM.
- Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 72 uur.
- Tel de kolonies met behulp van een tandenstoker en celteller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een typisch resultaat voor het gehele infectie wordt beschreven in figuur 1. Live cell fluorescentie microfoto beeltenis van monolagen van A.castellanii geïnfecteerd met wild-type L. pneumophila tijdens het vullen fase is weergegeven in figuur 1A. Een succesvolle maatregel van de priming stap leidt tot een populatie van ongeveer 90% van de gastheercellen die grote vacuolen gevuld met GFP gemerkte bacteriën bij deze MOI. Op 18 uur na infectie meeste A. castellanii cellen bereikt maximum bacteriële belasting nog lysis van de bevolking is minimaal. Onder lichtmicroscopie, zal een succesvolle priming infectie bestaat afgerond en vrijstaande amoeben. Gentamycin [25 ug / ml] kan worden toegevoegd aan het kweekmedium 30 min tot 1 uur na infectie van de bijdrage van extracellulaire bacteriën te elimineren. De Δ DOTA mutante stam, die niet ondersteund Dot / Icm-gemedieerde translocatie van effectoren, niet groeienA. castellanii en hoewel de in vitro cultuur moet evenals de wild-type stam fluoresceren, moet een minimale fluorescentie worden gedetecteerd met deze stam op 18 uur na infectie. Amoeben verschijnt vlak en de monolaag dient intact.
Totaal lysaten herbergen L. pneumophila en gastheercel vuil onmiddellijk onderworpen aan spectrofotometrische analyse om concentratie van bacteriën in het monster te berekenen. MOI kan worden berekend met de correlatie curve (figuur 1 *). Doelcellen worden voorbereid infectie, die geprimed bacteriën minder dan 30 min gebruikt na lysis de integriteit van genexpressieprofielen behouden. Eenmaal besmet, worden doelcellen geïncubeerd voor 14-18 uur voordat ze worden verwerkt. Fluorescentie microscopie in figuur 1B tonen de pathogene verkregen voorsprong van protozoaire-geprimed wild-type L. pneumophila in doelcel stadium infecties van A. castellanii vergeleken met de identieke soort die beperkt zullen in vitro kweken voorafgaand aan infectie. Doelcel stadium infecties zijn minder robuust dan de priming stadium te wijten aan de opname van een wasstap 1-2 uur na infectie (doelcel-afhankelijk). Deze media vervanging stap verwijdert niet-invasieve bacteriën, het synchroniseren van de infectie en het verminderen van achtergrond fluorescentie in latere toepassingen. Figuren 1C-D tonen fluorescentie microfoto van een typische wild-type L. pneumophila tweetraps infectie scenario, waar bacteriën eerst worden voorbereid door infectie van A. castellanii, geoogst uit gelyseerde cellen protozoa, gekwantificeerd met behulp van de correlatie curve en gebruikt om THP-1 macrofagen infecteren gedurende 14 uur.
Na microscopie worden cellen getrypsineerd voor flowcytometrie (BD FACS Calibur). Geïnfecteerde cellen worden gebruikt om de machine kalibreren voorwaartse en zijwaartse verstrooiing. Infecties met elke stam zijn procesed met 20.000 geregistreerde events. FlowJo 7.6.1 software wordt gebruikt om de ruwe data te analyseren. Typisch wordt de fluorescentie (488 nm excitatie) Eerst uitgezet tegen zijwaartse verstrooiing de achtergrond fluorescentie van de geïnfecteerde celpopulatie te identificeren. Plots zijn gated om deze populatie en opnieuw uitgezet als een histogram van het totaal telt versus fluorescentie-intensiteit uit te sluiten. Omdat elke bacteriecel is een maat van fluorescentie intensiteit van het signaal geeft een voorstelling van de vacuolaire belasting in elke geïnfecteerde cel. Een typische grafiek van een wildtype infectie figuur 1E. Algemeen het relatieve aantal geïnfecteerde cellen gedetecteerd door de flow cytometer lager dan verwacht bij vergelijking met microscopie data. Levende cel flowcytometrie is gevoelig genoeg echter om stam afwijkingen op te sporen.
Kwantificering van de totale CFU's in de monsters wordt uitgevoerd door het genereren van seriële verdunningen van de cellen geprepareerd voor flowcytometrie en daaropvolgende platingop CYEA media. Na 72 uur bij 37 ° C, enkelvoudige kolonies moet duidelijk en dun genoeg om te tellen.
Figuur 1. Protozoaire priming en doelcel stadium infecties met Legionella pneumophila. A. Wild-type of type IV secretie deficiënte (Δ DOTA) L. pneumophila stammen werden geïnduceerd om GFP expressie door in vitro cultuur (kleine frames) en gebruikt om A. infecteren castellanii monolagen gedurende 18 uur bij MOI = 20. Fluorescentie microscopie van infecties met elke L. pneumophila stam worden weergegeven (grote frames) als een fusie van fase-contrast-en E 512 nm fluorescentie beelden met een 20X objectief op een fluorescentie microscoop (AMG EVOS fl). Groene halve manen zijn representatief voor intracellulaire vacuolesharboring L. pneumophila. B. GFP fluorescentie microfoto's van 18 uur doelcel fase infectie van A. castellanii met wild-type L. pneumophila geoogst uit de protozoaire infectie priming fase (boven) of in vitro gekweekte (onder), waarbij de MOI = 10 voor elk werd berekend met de vergelijking afgeleid van de getoonde correlatie curve (blauw *). De curve werd gemaakt met seriële verdunningen van wild-type L. pneumophila GFP tot expressie brengen van een 18 uur in vitro cultuur. C. Fluorescentie microfoto van een priming stap infectie van A. castellanii met wild-type L. pneumophila als in (A). D. Fluorescentie opname van een 14 uur doelcel fase infectie van PMA gedifferentieerde THP-1 macrofagen met wild-type L. pneumophila geoogst uit de protozoaire infectie priming fase in (C). De MOI = 20 werd berekend met de vergelijking afgeleid van de correlatie curve (blauw *). De getoonde frame is een samenvoeging van fase contrast en E512 nm fluorescentiebeelden als in (A). E. Histogram plot van flowcytometrie data vergeleken THP-1 geïnfecteerde macrofagen (rood) en cellen geïnfecteerd met protozoaire geprimed wild-type L. pneumophila (groen). Scale bar = 100 um. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bacteriële genexpressie wordt streng gecontroleerd door een combinatie van levenscyclus en de reactie op signalen in de omgeving micromilieu. Vacuolaire ziekteverwekkers zoals L. pneumophila reageren op een groot aantal gastheercel afgeleide signalen bij compartimenten in een fagosoom. Als collectief gevolg van uitputting nutriënten in de gastheercel, de bacterie compenseert expressie factoren vereist voor succesvolle verspreiding naar een volgende gastheercel 25. L. pneumophila aangepast om efficiënt parasiteren diverse protozoaire cellen en daarmee herbergt een uitgebreide lijst van effector eiwitten om dit proces. Deze effector eiwitten worden direct translocatie in de gastheer cytoplasma tijdens infectie door de Dot / Icm soort IVb secretie systeem 16. Effector eiwit translocatie is vereist, als mutaties die resulteren in een defecte transporter volledig intracellulaire groei in een gastheercel-type af te schaffen. Curiositeitusly individuele deleties name effector eiwitten zelden geleid intracellulaire groei verzwakking. Bijna 300 effector eiwitten of bijna 10% van de eiwit coderende genoom gevalideerd als Dot / Icm substraten 14,15. Verscheidene hypothesen ontstaan om het ontbreken van waarneembare fenotypen uitleggen effector deleties, waaronder de aanwezigheid van paraloge kopieën of de horizontale verwerving van orthologe enzymen gevolg van het brede gastheerbereik van L. pneumophila.
Omdat L. pneumophila krijgt een pathogeen voordeel bij voorgekweekt in protozoa cellen (Figuren 1A-B), redeneerden we dat in vitro gekweekte bacteriën niet dezelfde genexpressieprofiel duidelijk weergegeven in bacteriën verlaten de protozoaire host. Daarom kan expressie van bepaalde eiwitten effector alleen geïnduceerd worden in de context van intracellulaire groei van cellen protozoa. Als een bepaalde effector niet geïnduceerd expression tijdens in vitro cultuur dan de bijdrage van de verwijderde effector kon niet effectief worden geëvalueerd in een traditionele infectie scenario. Fenotypes voor virulentiefactoren belang voor de totstandbrenging van infectie of verspreiding alleen gedetecteerd in langdurige infecties die toegestaan cel tot cel verspreiding. Daarom getracht een assay dat de bijdrage van mogelijke virulentiefactoren in de context van een sequentiële infectie kan meten. In het geval van natuurlijke L. pneumophila verkrijgen, is het waarschijnlijk dat een menselijke gastheer zullen ondervinden een bacterie die gedurende infectie geprepareerd protozoa cel waar protozoa kunnen veel tegen traditionele gemeentelijke water behandelpraktijken 10.
Om de gedeeltelijke zuivering van voldoende hoeveelheden primer bacteriën optimaliseren eerst werd een visueel handelbaar stam van L. pneumophila met IPTG induceerbare GFP uzingen plasmide gedragen kopieën van de GFP locus. Ook gegenereerd een exemplaar chromosomale insertie van IPTG induceerbare gfp het wild-type genoom. Hoewel beide stammen fluoresceren in vitro en tijdens infectie, een hoger aantal kopieën van het plasmide gedragen GFP tot voldoende signaal voor verdere toepassingen in de assay. We stelden vast dat het gebruik van bouillon gekweekte L. pneumophila bij een MOI = 20 was voldoende sterk infecteren A. castellanii monolagen. Achttien uur incubatie werd bepaald optimaal grote vacuolen fluorescent zichtbaar zonder dat er een fase van gastheercel lysis (Figuur 1A). Protozoaire monolagen worden niet gehandeld op grond van celcultuur kunststoffen, en zijn dus gemakkelijk verstoord met wasstappen. 12-well platen geproduceerd celkweek de meest stabiele monolagen in vergelijking met andere vaartuigen (6 of 24 en 10 cm schaal). Omdat L. pneumophila kan niet groeien in het infectiemedium in the priming stap, kozen we ervoor om elke wasstap om extracellulaire bacteriën te verwijderen verlaten. Dit verbetert het rendement van geïnfecteerde amoebe in de monolaag. Gentamycin wordt ook vaak gebruikt om extracellulaire bacteriën te doden. We protozoa toxiciteitseffecten bij concentraties boven 25 ug / ml, en vond geen verschil in het totale aantal bacteriën dat de priming stadium infectie op 18 uur. Lysis van de protozoaire celmonolaag werd uitgevoerd met ijskoude ultra gefiltreerde H 2 O, een oplosmiddel dat osmotisch compromitteert de gastheercel zonder nadelige gevolgen L. pneumophila. Indien aangepast voor gebruik met pathogenen die niet stabiel in H2O, 0,1% Triton X-100 in PBS kan worden gebruikt om de amoeben lyseren met vergelijkbare resultaten.
Om rechtstreeks stam verschillen in latere infecties doelcel stam vergelijken werd een vergelijking gegenereerd aan optische dichtheid van bacteriën correleren bij 600 nm met fluorescentie-emissie van GFP bij 512 nm (Figure 1 *). We kozen voor fluorescentie-emissie als middel voor kwantificering door de grote bijdrage van gastheercel afval in OD 600 metingen van eukaryote cellysaten. Deze hoge achtergrond tegenover verwaarloosbare waarden waargenomen voor emissie bij 512 nm van dezelfde lysaten. Waarden van OD 600 = 1.0 = 1x10 9 CFU / ml werden vooraf bepaald voor L. pneumophila, waardoor berekening van bacteriële concentratie over een breed bereik van fluorescentiewaarden. Veel organismen hebben vastgesteld CFU waarden OD 600 = 1,0, hetgeen het mogelijk maakt toepassing van deze techniek om een ander pathogeen door generatie van een correlatie curve op basis van fluorescentie-emissie. We kozen voor een bacteriële zuiveringsstap tijdens lysis van de cellen te voorkomen protozoa om 1) optimaal rendement uit bacteriën primer voor de doelcel infectie en 2) het minimaliseren van de tijd tussen de oogst en daaropvolgende infectie globale genexpressie p behoudenatterns.
In vitro gekweekte wild-type L. pneumophila werd geïnduceerd gedurende 18 uur GFP expressie met 1 mM IPTG. Seriële verdunningen van deze kweek werden gebruikt voor de spectrofotometrische metingen. Met de afgeleide vergelijking werden doelcel infecties routinematig uitgevoerd op verschillende MOI met consistente output. Een MOI van 10 geproduceerde ongeveer 1/2 het totale aantal geïnfecteerde cellen in vergelijking met infecties die een MOI van 20 (figuren 1A-B) heeft. We hebben drie geteste doelcel hosts met deze test; A. castellanii, muizen J774 macrofagen en humane PMA gedifferentieerde THP-1 macrofagen. In elk geval, de resulterende infectie niet zo robuust als priming infectie op dezelfde MOI (figuren 1C-D). We hebben vastgesteld dat een extra wasstap in de doelcel fase infectie, die wordt uitgevoerd om zowel synchroniseren de doelcel infectie en extracellulaire bacteriën te verminderen, is responsible voor deze observatie. Niettemin is het cruciaal dat het experiment intern wordt met een wild-type stam voor zowel de priming en doelcel fase infecties. Bacteriële teruggewonnen hoeveelheden in de priming stap is niet beperkend voor latere infecties dus alleen een doel celtype worden gebruikt per experiment.
Kwantificering van de doelcel infectie werd bereikt met behulp van drie methoden in deze assay. Fluorescentiemicroscopie werd gebruikt met een 20X objectief. Beelden van vacuolen herbergen L. pneumophila werden handmatig geteld uit verschillende velden voor elk getest stam. Flowcytometrische analyse die een gevoelige maat voor verschillen in de totale cellen geïnfecteerd, alsmede een aanpassing van vacuolair lading waarbij een hoger fluorescentiesignaal werd gecorreleerd met de bijdrage van GFP signaal steeds meer L. pneumophila cellen. Seriële verdunning plating voorzien kwantitatieve waarden voor het totale aantalvan per volume CFU's in de cel monsters voor flowcytometrie. Tezamen zijn deze methoden laten volledig handelbaar en kwantificeerbare resultaten in een sequentiële infectie scenario.
De priming test is heel veelzijdig en is geschikt voor de aanpassing aan een bacteriële ziekteverwekker die zoetwater protozoa gebruikt als een milieu-intermediair 29,3. De keuze van de doelcel kan worden verzorgd aan de natuurlijke infectie route geschikt is voor de specifieke ziekteverwekker. Belangrijker, een sequentiële infectie model worden gebruikt om mutanten die niet aanwezig zijn met een groei fenotype in een traditioneel infectiemodel met in vitro gekweekte bacteriën te onderzoeken. Transcriptionele profilering in vitro gekweekte bacteriën voor veronderstelde virulentiefactoren kunnen onthullen de belangrijkste verschillen in het profiel van meningsuiting in de geïnfecteerde tussengastheer. Dit kan het openen van een nieuwe lijn van onderzoek voor de functie van ongekarakteriseerde eiwitten en hun bijdrage aan de natuurlijkeinfectie routes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken dr. Craig Roy en Dr Dario Zamboni voor het verstrekken van een sjabloon voor protozoaire cel infecties. Wij danken dr. Jagdeep Obhrai, Dr Georgiana Purdy, Dr Fred Heffron en Todd Wisner voor apparatuur en reagentia; Dr Lulu Cambronne voor kritische beoordeling van het manuscript. Flow cytometrie werd uitgevoerd bij de OHSU Flowcytometrie Shared Resource faciliteit. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een subsidie van de Medical Research Foundation van Oregon en een NIH subsidie R21 AI088275 (EDC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
- Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
- Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
- Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
- Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
- Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
- Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
- King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
- Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
- Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
- Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 Forthcoming.
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
- Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
- Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
- Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
- Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).
