خلية المشارك الثقافة الزخرفة باستخدام مائي مرحلتين أنظمة
Summary
واستخدمت مائي مرحلتين نظم للسكان في وقت واحد نمط متعددة من الخلايا. هذه طريقة سريعة وسهلة للخلية الزخرفة يستفيد من فصل مرحلة من المحاليل المائية للجلايكول والبولي ايثيلين ديكستران والتوتر السطحي القائمة بين حلول البوليمر اثنين.
Abstract
سوف تكون هناك حاجة التكنولوجيات الزخرفة الخلية التي هي سريعة وسهلة الاستخدام وبأسعار معقولة للتنمية المستقبلية للفحوصات عالية الإنتاجية الخلية، ومنصات لدراسة الخلية خلايا الأنسجة التفاعلات ونظم الهندسة. يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لتوليد المشترك الثقافات من الخلايا باستخدام حلول حيويا من ديكستران (DEX) والبولي اثيلين جليكول (PEG) أن التخلص منفصلة عند دمجها أعلاه تركيزات العتبة. ويمكن نمط الخلايا في مجموعة متنوعة من التشكيلات باستخدام هذا الأسلوب. لا يمكن أن يؤديها الخلية الزخرفة الاستبعاد عن طريق طباعة قطرات من DEX على ركيزة وتغطيتها بمحلول مكون من خلايا تحتوي على PEG. التوتر السطحي شكلت بين حلول البوليمر سببين الخلايا في الانخفاض في جميع أنحاء خارج الحبرية DEX وتشكيل المقاصة دائرية التي يمكن استخدامها لفحوصات الهجرة. يمكن منقوشة جزر خلية الاستغناء مرحلة DEX الخلية الغنية في حل PEG أو من خلال تغطية DEXالقطرة بمحلول مكون من PEG. يمكن أن تتكون شارك في الثقافات مباشرة من خلال الجمع بين الخلايا مع استبعاد الزخرفة الجزيرة DEX. هذه الأساليب متوافقة مع مجموعة متنوعة من النهج التعامل مع السائل، بما في ذلك micropipetting دليل، ويمكن استخدامها مع أي نوع من الخلايا تقريبا ملتصقة.
Introduction
مائي على مرحلتين نظم (ATPSs) شكل عند خلط الحلول اثنين من البوليمرات غير متوافقة معا في تركيزات عالية بما فيه الكفاية. ويتأثر فصل المرحلة عن طريق مجموعة متنوعة من العوامل التي تشمل الوزن الجزيئي وقطبية من البوليمرات، ودرجة الحرارة من درجة الحموضة والحلول والمحتوى الأيونية من المذيب المائي 1 و 2. النقطة التي يتم تحديد حلين البوليمر منفصلة من الخصائص الفيزيوكيميائية لنظام اختيار المرحلة، ولكن يحدث عادة على تركيزات منخفضة البوليمر (أقل من 20٪ بالوزن / WT) في ظل ظروف غير يبدل طبيعة، السماح باستخدام التكنولوجيا الحيوية لATPSs تطبيقات 3-9.
حتى الآن على نطاق واسع الأكثر دراسة ATPS هو البولي ايثيلين جلايكول (PEG) / ديكستران النظام (DEX). وقد وصفت في الأصل ATPS التي شكلتها هذه البوليمرات غير مكلفة وحيويا لتنقية الجزيئات الحيوية عن طريق تقسيم الجزيئية 2 و 10. تقسيميحدث عند خلط جزيئات إضافية أو الجزيئات التي لا تساهم في النظام مع المرحلة PEG وDEX. على أساس الانتماءات النسبية لأي DEX أو PEG، فإن الجزيئات أو الجسيمات الموجودة تفضيلي ضمن واحدة من المرحلتين أو في الواجهة. خاصية أخرى من ATPS PEG / DEX هو وجود التوتر السطحي بين مراحل البوليمر اثنين. ATPSs التي شكلتها PEG وDEX عرض التوترات عموما بينية التي هي أقل بكثير من غيرها من نظم على مرحلتين بين السوائل مثل النفط والمياه، إلا أن القوات لا تزال تمارس التوتر السطحي على آثار جزيئات صغيرة مثل الفيروسات والخلايا والمجاميع البروتين 2 ، 11-13. وأخيرا، منذ ارتفاع الوزن الجزيئي وPEG DEX منفصلة في تركيزات منخفضة (أقل من 5٪ بالوزن / WT عالية الوزن الجزيئي البوليمرات أصناف) في وجود تركيزات الفسيولوجية للأملاح، هناك عدد قليل إذا أي آثار ضارة على خلايا الثدييات أدرجت ضمن هذه نظم14-16.
مؤخرا، تم تطبيق خصائص وتأثيرات بينية من تقسيم ATPSs من مختبرنا للتنميط خلية 14، 16-20. وتم ذلك عن طريق حل micropatterning DEX أكثر كثافة على ركائز ثقافة الخلية في وجود PEG. عندما تدمج الخلايا في مرحلة PEG، فهن مستبعدات من دخول قطرات DEX بسبب PEG / DEX التوتر السطحي 20. عندما يتم منقوشة الخلايا في مرحلة التنفيذ المباشر، يتم الاحتفاظ بها على سطح الخلية الركيزة الثقافة عن طريق تقسيم التوتر السطحي و16، 17، 19.
وعلى النقيض من الأساليب الأخرى لخلية الزخرفة، الزخرفة ATPS خلية من السهل تعلم، ويتطلب فقط معرفة أولية حول البوليمرات أنفسهم، والقدرة على أداء زراعة الخلايا واستخدام micropipettor. أساليب أخرى للتنميط الخلية غالبا ما تنطوي على المعدات المتخصصة والتدريب التي لا تترجم بسهولة إلى اله علوم الحياة. على سبيل المثال، بعض الطرق (microcontact الطباعة النافثة للحبر الطباعة أو) الخلايا بشكل غير مباشر من خلال تطبيق نمط أنماط الجزيئات الحيوية لاصقة خلية إلى الركيزة التي تخدم الثقافة فيما بعد مواقع لمرفق الخلية 21 و 22. على الرغم من النهج غير المباشرة مفيدة لبعض أنواع الخلايا، فإنها تتطلب درجة عالية من المهارة المستخدم والمعدات المتخصصة لصنع أداة الزخرفة، ويمكن أن تفتقر خصوصية تبعا لنمط معين نوع / جزيء حيوي الخلية. بدلا من ذلك، يتم إيداع الخلايا مع خصوصية عالية عن طريق نمط من النهج الزخرفة المباشرة التي تشمل تدفق الصفحي الزخرفة، الطباعة بالستينسيل والطباعة النافثة للحبر 23-26. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات تتطلب أيضا خبرة المستخدم والمعدات المتخصصة، ويمكن أن يتلف الخلايا أثناء عملية الطباعة. على الرغم من أن هذه المناهج عموما إنتاج أنماط دقيقة من الخلايا، على سبيل الزخرفة الخلية إلى أن تكون أداة مفيدة في علوم الحياة، يجب أن يكون فعالة من حيث التكلفة لبسيطة لتنفيذ الثانية.
نحن هنا تقرير مفصل بروتوكول لتوليد نمط مزارع الخلايا باستخدام ATPSs وصفها في تطبيقاتنا التي صدرت سابقا. باستخدام micropipettors فقط، يمكن للمستخدمين إنشاء مناطق الحظر الخلية أو الخلايا الجزر لفحوصات الهجرة. ويتحقق هذا عن طريق PEG / DEX التوتر السطحي أن يحتفظ إما الخلايا في مرحلة التنفيذ المباشر أو يستثني الخلايا المودعة في المرحلة PEG من DEX. من هذه تمشيط اثنين من التقنيات الأساسية الزخرفة، فمن الممكن لتوليد بسرعة شارك في الثقافات من الخلايا مثل الخلايا الليفية الخلايا الكبد شارك في الثقافات. أساليب الزخرفة وصفها، ATPS المعلمات والنتائج المتوقعة بالتفصيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
وmicropatterning الخلية ATPS الأسلوب يتطلب القليل جدا من الخبرة وراء الكفاءة في تقنيات زراعة الخلايا ويمكن أن يتقن بسرعة. مزايا هذا النهج هي أن أنها غير مكلفة وسريعة ومتوافقة مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا وصيغ الثقافة. لهذه الأسباب، ينبغي لنا اعتمد بروتوكول بسهولة من قبل …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة كولتر، ومؤسسة بايستر، فرصة البحوث الجامعية (UROP) البرنامج الصيفي لATA وطلاب الدراسات العليا العلوم الوطنية زمالة مؤسسة البحوث (منحة لا DGE 0718128؛ ID: 2010101926) لJBW.
Materials
| Reagent | Manufacturer |
| Dextran 500,000 kDa | Pharmacosmos, Denmark |
| Polyethylene Glycol 35,000 kDa | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO |
| Hela | ATCC, Manassas, VA |
| HepG2 C3A | ATCC, Manassas, VA |
| NIH 3T3 | ATCC, Manassas, VA |
| Cell Tracker | Invitrogen, Carlsbad, CA |
| DMEM | Gibco, Carlsbad, CA |
| RPMI | Gibco, Carlsbad, CA |
| F12 | Gibco, Carlsbad, CA |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Carlsbad, CA |
References
- Hatti-Kaul, R. Aqueous two-phase systems : methods and protocols. Methods in biotechnology. xiii, 440 (2000).
- Albertsson, P. A. k. . Partition of cell particles and macromolecules: separation and purification of biomolecules, cell organelles, membranes, and cells in aqueous polymer two-phase systems and their use in biochemical analysis and biotechnology. , 346 (1986).
- Yamada, M., et al. Continuous cell partitioning using an aqueous two-phase flow system in microfluidic devices. Biotechnol. Bioeng. 88 (4), 489-494 (2004).
- Soohoo, J. R., Walker, G. M. Microfluidic aqueous two phase system for leukocyte concentration from whole blood. Biomed. Microdevices. 11 (2), 323-329 (2009).
- Hahn, T., Hardt, S. Concentration and size separation of DNA samples at liquid-liquid interfaces. Anal. Chem. 83 (14), 5476-5479 (2011).
- Hatti-Kaul, R. Aqueous two-phase systems. A general overview. Mol. Biotechnol. 19 (3), 269-277 (2001).
- Hustedt, H., Kroner, K. H., Menge, U., Kula, M. -. R. Protein recovery using two-phase systems. Trends in Biotechnology. 3 (6), 139-144 (1985).
- Keating, C. D. Aqueous Phase Separation as a Possible Route to Compartmentalization of Biological Molecules. Acc Chem. Res. 45 (12), 2114-2124 (2012).
- Helfrich, M. R., et al. Partitioning and assembly of metal particles and their bioconjugates in aqueous two-phase systems. Langmuir. 21 (18), 8478-8486 (2005).
- Diamond, A. D., Hsu, J. T. Prote. Partitioning in PEG/Dextran Aqueous Two-Phase Systems. AIChE Journal. 36 (7), 1017-1024 (1990).
- Y-T, Z. -. Q., Zhu, Modeling of interfacial tension of aqueous two-phase systems. Chemical Engineering Science. 54 (4), 433-440 (1999).
- Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. Concentration dependence of the interfacial tension for aqueous two-phase polymer solutions of dextran and polyethylene glycol. Langmuir. 28 (8), 3831-3839 (2012).
- Rha, C. Interfacial Tension of Polyethylene Glycol/Potassium Phosphate Aqueous Two-Phase Systems. Physics and Chemistry of Liquids: An International Journal. 38 (1), 25-34 (2000).
- Fang, Y., et al. Rapid Generation of Multiplexed Cell Cocultures Using Acoustic Droplet Ejection Followed by Aqueous Two-Phase Exclusion Patterning. Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (9), 647-657 (2012).
- Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8 (9), 736-741 (2009).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22 (24), 2628-2631 (2010).
- Tavana, H., et al. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. , (2011).
- Tavana, H., Takayama, S. Aqueous biphasic microprinting approach to tissue engineering. Biomicrofluidics. 5 (1), 13404 (2011).
- Frampton, J. P., et al. Precisely targeted delivery of cells and biomolecules within microchannels using aqueous two-phase systems. Biomed. Microdevices. 13 (6), 1043-1051 (2011).
- Hossein Tavana, K. K., Bersano-Begey, T., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Rehydration of Polymeric, Aqueous, Biphasic System Facilitates High Throughput Cell Exclusion Patterning for Cell Migration Studies. Advanced Functional Materials. 21 (15), 2920-2926 (2011).
- Falconnet, D., et al. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
- Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Eng. 13 (8), 1879-1891 (2007).
- Ringeisen, B. R., et al. Jet-based methods to print living cells. Biotechnol. J. 1 (9), 930-948 (2006).
- Wright, D., et al. Generation of static and dynamic patterned co-cultures using microfabricated parylene-C stencils. Lab Chip. 7 (10), 1272-1279 (2007).
- Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (10), 5545-5548 (1999).
- Berthier, E., et al. Pipette-friendly laminar flow patterning for cell-based assays. Lab Chip. 11 (12), 2060-2065 (2011).
- Davidson, R. L., O’Malley, K. A., Wheeler, T. B. Polyethylene glycol-induced mammalian cell hybridization: effect of polyethylene glycol molecular weight and concentration. Somatic Cell Genet. 2 (3), 271-280 (1976).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Moon, S., Lin, P., Keles, H. O., Yoo, S., Demirci, U. Title Cell Encapsulation by Droplets. J. Vis. Exp. (8), e316 (2007).
