利用双水相系统的细胞共培养图案

Summary

双水相系统，用于同时图案多个的细胞群体。此快速和容易的方法，细胞图案利用葡聚糖和聚​​乙二醇的水溶液，和两者之间的聚合物溶液中存在的界面张力的相分离。

Abstract

细胞图案化技术，速度快，易于使用，价格合理的高通量细胞分析平台的未来发展将需要研究细胞间的相互作用和组织工程化系统。此详细的协议描述了一种用于产生的细胞的共培养物，使用生物相容的解决方案的葡聚糖（DEX）和聚乙二醇（PEG），发生相分离时，在阈值以上的浓度相结合的方法。细胞可以使用此方法的配置的各种图案。可以通过印刷在基板上的液滴的DEX和覆盖它们的PEG含有细胞的溶液进行细胞排斥构图。两者之间的聚合物溶液形成的界面张力，使细胞落在对DEX液滴周围的外侧，并形成了一个环形的结算可以用于迁移实验。细胞岛可以分配到的PEG溶液的细胞丰富的DEX阶段，或图案覆盖的DEX液滴与PEG的溶液。共培养物，可形成直接与地塞米松岛屿构图通过结合细胞排斥。这些方法兼容的各种液体处理方法，包括手动微穿刺，可用于几乎任何粘附的细胞类型。

Introduction

双水相的系统（ATPSs）形式时，两种不相容的聚合物的溶液混合在一起，在足够高的浓度。相分离的影响，由多种因素，其中包括的聚合物的分子量和极性，温度下的溶液，pH值和离子含量的水性溶剂^1，2。在该点的两种聚合物溶液单独确定由所选择的三相系统的理化性质，但一般发生在低聚合物的浓度（小于20％重量/重量），在非变性条件下，允许将用于生物技术的ATPSs应用程序^3-9。

到目前为止研究得最广泛的ATPS是聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEX）系统。由这些廉价的和生物相容的聚合物形成的ATPS最初被描述为纯化的生物分子的分子的分区^2，10的方式。分区没有贡献的相位系统的额外的分子或颗粒时，会发生混合与PEG和DEX。基于它们的相对亲和力地塞米松或PEG，分子或颗粒内的两个阶段中的一个或界面处将优先驻留。另一个特性PEG / DEX ATPS的是两种聚合物相之间的界面张力的存在。由PEG和DEX ATPSs形成一般显示是低得多的比其他如油和水的液-液两相体系的界面张力;然而，界面张力仍然发挥效果的小颗粒，如病毒，细胞和蛋白质总量^{2 11-13。}最后，因为较高分子量的PEG和DEX单独的生理浓度的盐的存在下，在低浓度（小于5％的高分子量的聚合物品种的重量/重量），有一些对哺乳动物细胞的任何有害的影响，如果在这些注册成立系统^14-16。

近日，界面性质和分区的ATPSs已被应用于本实验室的细胞图案^{14，16-20。}这是通过缩微更密集地塞米松溶液对PEG的存在下，在细胞培养基材。当细胞被纳入PEG相，他们被排除进入对DEX由于PEG / DEX界面张力^20的液滴。当细胞被图案化中的DEX相，它们被保持在通过界面张力和分区^16，17，19的细胞培养基材的表面上。

在对比等方法进行细胞图案，ATPS的细胞图案是简单易学，只需要基本的知识有关的聚合物，并能进行细胞培养和使用微量移液器。细胞图案的其他方法往往涉及专门的设备和培训，不容易被转换为日e生活科学。例如，一些方法（微接触印刷或喷墨印刷）图案细胞间接通过施加模式的细胞粘附的生物分子到培养基材，随后作为电池附件^21，22的网站。尽管间接方法对于某些类型的细胞是有用的，它们需要用户的技能和专门的设备来制造图案形成工具的高度的，并且可以取决于对特定类型的细胞/生物分子图案缺乏特异性。此外，细胞可以沉积模式特异性高的方式直接图形的方法，包括层流图案，制版和喷墨印刷^{23日至26日} 。然而，这些技术也需要用户的专业知识和专门的设备，在印刷过程中，可能会损坏细胞。尽管这些方法通常会产生的细胞，细胞图案的精确模式是一个有用的工具，在生命科学领域，它必须是符合成本效益的一个实现ND简单。

在这里，我们报告的详细描述在我们之前发布的应用程序使用ATPSs产生图案的细胞培养协议。只使用微量移液器，用户可以生成细胞的禁区或细胞的岛屿迁移实验。这是通过PEG / DEX的界面张力，可以保持细胞在对DEX相中或排除细胞沉积在从DEX PEG相方式。通过梳理上述两个基本图案形成技术，它是可能的，以迅速产生如肝成纤维细胞共培养的细胞的共培养。图案形成方法，ATPS参数和预期结果进行详细说明。

Protocol

1。相体系相分离的特性：确定阈值准备含有PEG和DEX的解决方案中所需的缓冲区或细胞培养基中所示，在图1（紫色的点）在15毫升或50毫升锥形管。在下文中，PEG和DEX将参考35 kDa的PEG和500 kDa的DEX;然而，临界浓度会改变，这取决于所用的两种聚合物。记录每个解决方案中的质量PEG和DEX。高浓度聚合物解决方案可能需要几个小时才能溶解。无血清的解决方案可用于涡旋。含有蛋白?…

Representative Results

要选择PEG和DEX细胞图案的适当组合，重要的是要确定的双结点曲线。这条曲线描绘的点，可以形成一个ATPS可以改变为一组给定的基础上的温度，pH值和离子含量的聚合物。用于培养细胞的需要定制的培养基配方中，可能有必要通过实验确定的双结点曲线。这是通过产生一系列ATPSs是远离的双结点和在他们的PEG和DEX内容变化（ 图1，紫色圆圈）。 ATPS是本时，聚合物溶液出现混浊混合时?…

Discussion

的ATPS细胞缩微方法只需要很少的细胞培养技术熟练的专业知识之外，可以很快掌握。这种方法的优点是，它是廉价的，快速的和具有多种类型的细胞和文化格式兼容。由于这些原因，我们的协议应该很容易通过生命科学家，特别是研究细胞的增殖，迁移和趋化性，近分泌和旁分泌的细胞群之间的相互作用的影响。这里介绍的分析，可以很容易地使用标准的图像分析程序，可用的软件，如ImageJ的细…

Materials

Reagent	Manufacturer
Dextran 500,000 kDa	Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum	Gibco, Carlsbad, CA