Celle co-kultur Patterning hjælp Vandige tofasesystemer

Summary

Vandige tofasesystemer blev anvendt til samtidigt mønster flere populationer af celler. Denne hurtig og nem fremgangsmåde til celle-mønsterdannelse udnytter faseseparation af vandige opløsninger af dextran og polyethylenglycol og grænsefladespændingen, der eksisterer mellem de to polymeropløsninger.

Abstract

Cell mønster teknologier, der er hurtig, nem at bruge og økonomisk overkommelig vil være nødvendige for den fremtidige udvikling af high throughput celleassays, platforme for at studere celle-celle interaktioner og manipuleret væv systemer. Denne detaljeret protokol beskriver en fremgangsmåde til generering af co-kulturer af celler under anvendelse af biokompatible opløsninger af dextran (DEX) og polyethylenglycol (PEG), at fase-adskilt ved kombination ovenfor tærskelkoncentrationer. Celler kan mønstret i en række forskellige konfigurationer på denne måde. Cell udelukkelse mønsterdannelse kan udføres ved at udskrive dråber af DEX på et substrat og dække dem med en opløsning af PEG, der indeholder celler. Den interfaciale spænding dannet mellem de to polymeropløsninger får cellerne til at falde omkring ydersiden af ​​DEX dråbe og danner en cirkulær clearing, der kan anvendes til migration assays. Celle øer kan være mønstret ved at dispensere en celle-rige DEX fase i en PEG-opløsning eller ved at dække DEXdråbe med en opløsning af PEG. Co-kulturer kan dannes direkte ved at kombinere celle udelukkelse med DEX ø mønsterdannelse. Disse fremgangsmåder er kompatible med en række væskehåndteringssystemer fremgangsmåder, herunder manuelle micropipetting, og kan anvendes med praktisk talt enhver adhærent celletype.

Introduction

Vandige tofasesystemer (ATPSs) form, når opløsninger af to uforenelige polymerer blandes sammen ved tilstrækkeligt høje koncentrationer. Faseseparation påvirkes af en række faktorer, der omfatter den molekylære vægt og polaritet af polymererne, temperatur af opløsninger, pH og ionisk indhold af det vandige opløsningsmiddel ^{1, 2.} Det punkt, hvor de to polymeropløsninger separate bestemmes af de fysisk-kemiske egenskaber af den valgte fase system, men generelt ved lave polymerkoncentrationer (mindre end 20% vægt / vægt) under ikke-denaturerende betingelser, således ATPSs skal anvendes til bioteknologiske applikationer ^3-9.

Langt de mest ekstensivt undersøgte ATPS er polyethylenglycol (PEG) / dextran (DEX) system. De ATPS dannet af disse billige og biokompatible polymerer blev oprindeligt beskrevet til oprensning af biomolekyler ved hjælp af molekylær opdeling ^{2, 10.} Partitioneringopstår, når flere molekyler eller partikler, der ikke bidrager til fasesystemet blandes med PEG og DEX. Baseret på deres relative affiniteter for enten DEX eller PEG, vil molekylerne eller partiklerne fortrinsvis ligge i én af de to faser eller ved grænsefladen. En anden egenskab af PEG / dex ATPS er eksistensen af ​​grænsefladespændingen mellem de to polymerfaser. ATPSs dannet af PEG og DEX generelt udviser grænsefladespændinger, der er meget lavere end andre væske-væske tofasesystemer såsom olie og vand, men de grænsefladespændingsegenskaber kræfter stadig udøver virkninger på små partikler, såsom vira, celler og proteinaggregater ^{2 , 11-13.} Endelig, da højere molekylvægt PEG og DEX adskilt ved lave koncentrationer (mindre end 5% vægt / vægt til polymerer med høj molekylvægt sorter) i nærvær af fysiologiske koncentrationer af salte, er der få eller ingen skadelige virkninger på pattedyrceller inkorporeret i disse systemer^14-16.

For nylig har de grænsefladeegenskaber og adskillelser virkninger ATPSs blevet anvendt af vores laboratorium for celle mønster ^{14, 16-20.} Dette blev opnået ved micropatterning en tættere DEX løsning på cellekultur-substrater i nærvær af PEG. Når celler inkorporeres i PEG-fasen, udelades de fra indtaste DEX smådråber på grund af PEG / dex-grænsefladespænding ^20. Når cellerne er mønstret i DEX fase, er de tilbageholdes på overfladen af cellekulturen substratet ved grænsefladespænding og opdeling ^{16, 17, 19.}

I modsætning til andre fremgangsmåder til celle-mønster, er ATPS celle mønsterdannelse let at lære og kræver kun rudimentært kendskab polymererne selv, og evnen til at udføre cellekultur og bruge en mikropipette. Andre metoder til celle mønster ofte involverer specialiseret udstyr og uddannelse, som ikke let oversættes til the biovidenskab. Fx. Nogle metoder (microcontact trykning eller inkjet-trykning) mønster celler indirekte ved at anvende mønstre af celleadhæsive biomolekyler til et dyrkningssubstrat, der efterfølgende virke som steder for cellebinding ^{21, 22} Indirekte fremgangsmåder er anvendelige til visse celletyper, der kræver en høj grad af brugerens dygtighed og specialiseret udstyr til fremstilling af mønstret værktøjet, og kan mangle specificitet afhængigt af den særlige celletype / biomolekyle mønster. Alternativt kan celler deponeres med høje mønster specificitet i form af direkte mønsterdannende fremgangsmåder, der omfatter laminar strømning mønster, stenciling og inkjetprint ^23-26. Men disse teknikker også kræve brugerens ekspertise og specialudstyr, og du kan beskadige celler under udskrivningen. Selv om disse tiltag generelt producere præcise mønstre af celler, til celle mønster at være et nyttigt redskab i biovidenskab, skal det være omkostningseffektivt ennd enkel at anvende.

Her rapporterer vi en detaljeret protokol til at generere mønstrede cellekulturer ved hjælp af de ATPSs beskrevet i vores tidligere offentliggjorte ansøgninger. Brug kun micropipettors, kan brugerne generere celle eksklusionszoner eller celle øer for migration assays. Dette opnås ved hjælp af PEG / dex-grænsefladespænding, der enten bibeholder cellerne i DEX fase eller udelukker celler deponeret i PEG-fasen fra DEX. Ved at kombinere disse to grundlæggende mønsterdannende teknikker, er det muligt at hurtigt frembringe co-kulturer af celler, såsom lever-fibroblast-celler co-kulturer. Mønsterdannende metoder, ATP parametre og forventede resultater er beskrevet i detaljer.

Protocol

1. Fase System Karakterisering: beslutte Tærskelværdier for faseseparation Fremstille opløsninger indeholdende PEG og DEX i den ønskede puffer eller celledyrkningsmedium som vist i figur 1 (lilla prikker) i 15 ml eller 50 ml koniske rør. Herefter vil PEG og DEX henvise til 35 kDa PEG og 500 kDa DEX, men vil kritiske koncentrationer ændres afhængigt af de to anvendte polymerer. Optag massen af ​​PEG og DEX i hver opløsning. Høj koncentration polymeropløsninger kan tage flere time…

Representative Results

For at vælge en passende kombination af PEG og DEX for celle mønster, er det vigtigt at bestemme binodal kurve. Denne kurve skildrer de punkter, hvor en ATPS kan dannes og kan variere for et givet sæt af polymerer baseret på temperatur, pH og ionisk indhold. Til dyrkning af celler, der kræver tilpassede medium formuleringer kan det være nødvendigt at eksperimentelt bestemme binodal kurve. Dette opnås ved at generere en række ATPSs som er langt fra binodal og varierende i deres PEG og DEX indhold (figur …

Discussion

Den ATPS celle micropatterning metode kræver meget lidt ekspertise over færdigheder i cellekulturteknikker og kan hurtigt mestrer. Fordelene ved denne tilgang er, at den er billig, hurtig og kompatibel med en række forskellige celletyper og kultur formater. Af disse grunde bør vores protokol let vedtaget af liv forskere, især dem, der studerer celleproliferation, migration og kemotaxi, og indflydelsen fra juxtacrine og parakrine interaktioner mellem cellepopulationer. Analyserne præsenteres her let kan kvantificer…

Materials

Reagent	Manufacturer
Dextran 500,000 kDa	Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum	Gibco, Carlsbad, CA