सेल सह संस्कृति जलीय दो चरण सिस्टम का उपयोग कर Patterning
Summary
जलीय दो चरण सिस्टम के साथ कोशिकाओं के पैटर्न कई आबादी के लिए इस्तेमाल किया गया. सेल patterning के लिए यह तेजी से और आसान तरीका dextran और polyethylene glycol और interfacial तनाव है कि दो बहुलक समाधान के बीच मौजूद जलीय समाधान के चरण जुदाई का लाभ लेता है.
Abstract
सेल patterning प्रौद्योगिकियों कि तेज, उपयोग करने के लिए आसान और सस्ती कर रहे हैं सेल सेल बातचीत और ऊतक इंजीनियर प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए उच्च throughput सेल assays, प्लेटफार्मों के भविष्य के विकास के लिए आवश्यक हो जाएगा. यह विस्तृत प्रोटोकॉल (DEX) dextran और polyethylene glycol (खूंटी) biocompatible समाधान है कि जब चरण अलग सीमा सांद्रता के ऊपर संयुक्त कोशिकाओं के सह संस्कृतियों पैदा करने के लिए एक विधि का वर्णन है. सेल विन्यास की एक किस्म में इस पद्धति का उपयोग किया जा सकता नमूनों. सेल अपवर्जन patterning एक सब्सट्रेट पर DEX की बूंदों छपाई और उन्हें खूंटी युक्त कोशिकाओं का एक समाधान के साथ कवर किया जा सकता है. interfacial दो बहुलक समाधान के बीच गठित तनाव कोशिकाओं का कारण बनता है DEX छोटी बूंद के बाहर चारों ओर आते हैं और कि प्रवास assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक परिपत्र समाशोधन फार्म. सेल द्वीप एक खूंटी समाधान में एक सेल युक्त DEX चरण वितरण या DEX कवर द्वारा किया जा सकता नमूनोंखूंटी की एक समाधान के साथ छोटी बूंद. सह संस्कृतियों DEX द्वीप patterning के साथ सेल अपवर्जन के संयोजन से सीधे का गठन कर सकते हैं. इन विधियों पुस्तिका micropipetting सहित तरल से निपटने के तरीकों की एक किस्म के साथ संगत कर रहे हैं, और वस्तुतः किसी भी पक्षपाती सेल प्रकार के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
जलीय दो चरण सिस्टम (ATPSs) फार्म जब दो असंगत पॉलिमर के समाधान के साथ पर्याप्त उच्च सांद्रता में मिलाया जाता है. चरण जुदाई कारक है कि आणविक वजन और पॉलिमर के polarity, समाधान पीएच, और जलीय विलायक 1, 2 के ईओण सामग्री के तापमान में शामिल की एक किस्म से प्रभावित है. जो बिंदु पर दो बहुलक अलग समाधान चुना चरण प्रणाली के physiochemical गुणों द्वारा निर्धारित किया गया है, लेकिन आम तौर पर गैर denaturing शर्तों के तहत कम बहुलक सांद्रता (कम से कम 20% / wt wt) में होता है, ATPSs जैव प्रौद्योगिकी के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है 3-9 अनुप्रयोगों.
द्वारा अब तक के सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन ATPS polyethylene (खूंटी) glycol / dextran प्रणाली (DEX) है. इन सस्ती और biocompatible पॉलिमर द्वारा गठित ATPS मूल आणविक 2 विभाजन, 10 के रास्ते से biomolecules की शुद्धि के लिए वर्णित किया गया था. विभाजनतब होता है जब अतिरिक्त अणुओं या कणों कि चरण प्रणाली के लिए योगदान नहीं है खूंटी और DEX के साथ मिश्रित कर रहे हैं. या तो DEX या खूंटी के लिए उनके रिश्तेदार समानताएं के आधार पर, अणु कणों या preferentially एक दो चरणों के भीतर या अंतरफलक पर निवास करेंगे. खूंटी / DEX ATPS का एक अन्य संपत्ति दो बहुलक चरणों के बीच interfacial तनाव के अस्तित्व है. खूंटी और DEX द्वारा गठित ATPSs आम तौर पर interfacial तनाव कि अन्य तरल तरल तेल और पानी के रूप में इस तरह के दो चरण प्रणालियों की तुलना में काफी कम कर रहे हैं प्रदर्शित, तथापि, interfacial तनाव बलों को अभी भी वायरस, कोशिकाओं और प्रोटीन समुच्चय 2 के रूप में इस तरह के छोटे कणों पर प्रभाव डालती है 11-13. अंत में, उच्च आणविक भार खूंटी और DEX लवण की शारीरिक सांद्रता की उपस्थिति में कम सांद्रता (कम से कम 5% wt / उच्च आणविक भार पॉलिमर किस्मों के लिए wt) में अलग से, वहाँ कुछ कर रहे हैं अगर स्तनधारी कोशिकाओं पर कोई हानिकारक प्रभाव इन में शामिल सिस्टम14-16.
Interfacial गुण और ATPSs के विभाजन प्रभाव सेल patterning 14, 16-20 के लिए किया गया है हमारी प्रयोगशाला से लागू होता है. इस micropatterning द्वारा खूंटी की उपस्थिति में एक सघन सेल संस्कृति substrates पर DEX समाधान पूरा किया गया. जब कोशिकाओं खूंटी चरण में शामिल कर रहे हैं, वे DEX / खूंटी DEX interfacial 20 तनाव के कारण बूंदों में प्रवेश करने से बाहर रखा गया है. जब कोशिकाओं DEX चरण में नमूनों रहे हैं, वे interfacial तनाव और विभाजन 16, 17, 19 के द्वारा सेल संस्कृति सब्सट्रेट की सतह पर रखा जाता है.
सेल patterning के लिए अन्य तरीकों के विपरीत, ATPS सेल patterning जानने के लिए आसान है और केवल खुद पॉलिमर, और सेल संस्कृति प्रदर्शन और एक micropipettor का उपयोग करने की क्षमता के बारे में प्रारंभिक ज्ञान की आवश्यकता है. सेल patterning के लिए अन्य तरीकों अक्सर विशेष उपकरण और प्रशिक्षण कि आसानी वें नहीं अनुवाद कर रहे हैं शामिलई जीवन विज्ञान. उदाहरण के लिए, कुछ विधियों (microcontact मुद्रण या inkjet मुद्रण) एक संस्कृति है कि सब्सट्रेट बाद सेल लगाव 21, 22 के लिए साइटों के रूप में सेवा करने के लिए सेल चिपकने वाला biomolecules के पैटर्न लागू करने के द्वारा अप्रत्यक्ष रूप से पैटर्न कोशिकाओं. हालांकि अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण कुछ सेल प्रकार के लिए उपयोगी होते हैं, वे उपयोगकर्ता कौशल और विशेष patterning उपकरण निर्माण उपकरणों की एक उच्च डिग्री की आवश्यकता होती है, और विशिष्टता की कमी विशेष सेल प्रकार / biomolecule पैटर्न के आधार पर कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं प्रत्यक्ष patterning दृष्टिकोण है कि लामिना का प्रवाह patterning stenciling, और inkjet मुद्रण 23-26 के रास्ते से उच्च पैटर्न विशिष्टता के साथ जमा किया जा सकता है. हालांकि, इन तकनीकों को भी उपयोगकर्ता विशेषज्ञता और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, और मुद्रण प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है. हालांकि इन तरीकों कोशिकाओं, सेल patterning के लिए आम तौर पर सटीक पैटर्न का उत्पादन करने के लिए जीवन विज्ञान में एक उपयोगी उपकरण हो, यह लागत प्रभावी एक होना चाहिएएन डी सरल लागू करने के लिए.
यहाँ हम नमूनों सेल ATPSs हमारे पहले प्रकाशित आवेदन में वर्णित का उपयोग कर संस्कृतियों को पैदा करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल रिपोर्ट. केवल micropipettors का उपयोग, उपयोगकर्ताओं सेल अपवर्जन प्रवास assays के लिए या क्षेत्रों सेल द्वीपों उत्पन्न कर सकते हैं. यह खूंटी / DEX interfacial तनाव है कि या तो DEX चरण में कोशिकाओं को बरकरार रखती है या DEX से खूंटी चरण में जमा कोशिकाओं शामिल नहीं की जिस तरह से हासिल की है. इन दो बुनियादी patterning तकनीक तलाशी से, यह संभव है तेजी से जिगर fibroblast सेल सह संस्कृतियों के रूप में कोशिकाओं के सह संस्कृतियों उत्पन्न. तरीकों patterning, ATPS मानकों और अपेक्षित परिणाम के विस्तार में वर्णित हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
ATPS सेल micropatterning विधि सेल कल्चर तकनीकों में प्रवीणता से परे बहुत कम विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है और जल्दी से महारत हासिल किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण का लाभ कर रहे हैं कि यह सस्ती है, तेजी से और सेल प्रकार ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jbw के लिए: यह काम कल्टर फाउंडेशन, Beyster फाउंडेशन, अंडर ग्रेजुएट रिसर्च (UROP) अवसर ATA और एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट छात्र रिसर्च फैलोशिप (2010101926 आईडी अनुदान नहीं डीजीई 0718128) के लिए ग्रीष्मकालीन कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Reagent | Manufacturer |
| Dextran 500,000 kDa | Pharmacosmos, Denmark |
| Polyethylene Glycol 35,000 kDa | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO |
| Hela | ATCC, Manassas, VA |
| HepG2 C3A | ATCC, Manassas, VA |
| NIH 3T3 | ATCC, Manassas, VA |
| Cell Tracker | Invitrogen, Carlsbad, CA |
| DMEM | Gibco, Carlsbad, CA |
| RPMI | Gibco, Carlsbad, CA |
| F12 | Gibco, Carlsbad, CA |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Carlsbad, CA |
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