Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Summary

Wässriger Zweiphasensysteme wurden gleichzeitig Muster mehrere Populationen von Zellen verwendet. Dieses schnelle und einfache Methode zur Musterbildung Zelle nutzt die Phasentrennung der wässrigen Lösungen von Dextran und Polyethylenglycol und die Grenzflächenspannung zwischen den beiden Polymerlösungen besteht.

Abstract

Zelle Strukturierung Technologien, die schnell, einfach zu bedienen und erschwinglich sind, werden für die zukünftige Entwicklung von Hochdurchsatz-Zell-Assays, Plattformen zur Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen und Gewebe technischer Systeme benötigt werden. Diese detaillierte Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Erzeugen von Co-Kulturen von Zellen unter Verwendung von biokompatiblen Lösungen von Dextran (Dex) und Polyethylenglykol (PEG), die Phasentrennung bei über dem Schwellenwert Konzentrationen kombiniert. Zellen können in einer Vielzahl von Konfigurationen unter Verwendung dieses Verfahrens strukturiert werden. Zellausschlussschicht Strukturierung kann durch Drucken von Tröpfchen DEX auf einem Substrat und Abdecken mit einer Lösung von PEG mit Zellen durchgeführt werden. Die Grenzflächenspannung zwischen den beiden Polymerlösungen gebildet bewirkt Zellen um die Außenseite des DEX Tröpfchens fallen und bilden eine kreisförmige Lichtung die für die Migration Assays verwendet werden kann. Zelle Inseln können durch den Verzicht auf eine Zelle reichen DEX Phase in eine PEG-Lösung oder durch Abdecken des DEX strukturiert werdenTröpfchen mit einer Lösung von PEG. Co-Kulturen können direkt durch die Kombination Zellausschlussschicht mit DEX Insel Strukturierung gebildet werden. Diese Verfahren sind mit einer Vielzahl von Liquid-Handling Ansätze, einschließlich manueller Mikropipettiervorrichtung und können mit nahezu jedem adhärenten Zelltyp eingesetzt werden.

Introduction

Wässriger Zweiphasensysteme (ATPSs) bilden, wenn Lösungen aus zwei inkompatiblen Polymeren miteinander bei ausreichend hohen Konzentrationen vermischt. Phasentrennung wird durch eine Vielzahl von Faktoren, die das Molekulargewicht und die Polarität der Polymeren, Temperatur der Lösung, pH-Wert und ionischen Gehalt der wässrigen Lösungsmittel ^{1, 2} umfassen beeinflusst. Der Punkt, an dem die beiden Polymerlösungen separaten von den physikochemischen Eigenschaften des ausgewählten Phasen-System bestimmt wird, sondern erfolgt in der Regel bei niedrigen Polymer Konzentrationen (weniger als 20% wt / wt) unter nicht-denaturierenden Bedingungen, wodurch ATPSs für Biotechnologie eingesetzt werden Anwendungen ^3-9.

Die mit Abstand am intensivsten untersuchten ATPS ist die Polyethylenglykol (PEG) / Dextran (DEX) System. Die ATPS durch diese kostengünstig und biokompatiblen Polymeren gebildet wurde ursprünglich zur Reinigung von Biomolekülen über molekulare Partitionierung ^{2, 10} beschrieben. Abtrennungtritt bei zusätzlichen Molekülen oder Partikeln, die nicht dem Phasensystem beitragen mit PEG und DEX werden gemischt. Basierend auf ihren relativen Affinitäten für entweder DEX oder PEG, werden die Moleküle oder Teilchen bevorzugt in einer der beiden Phasen oder an der Schnittstelle befinden. Eine weitere Eigenschaft des PEG / DEX ATPS ist die Existenz der Grenzflächenspannung zwischen den beiden Polymer-Phasen. ATPSs von PEG und DEX gebildet zeigen im Allgemeinen Grenzflächenspannungen, die viel niedriger als in anderen Flüssig-Flüssig-Zwei-Phasen-Systeme wie Öl und Wasser, aber die Grenzflächenspannung Kräfte üben noch immer Auswirkungen auf kleine Partikel wie Viren, Zellen und Proteinaggregate ^{2 , 11-13.} Da schließlich höhermolekularen PEG und DEX separaten bei niedrigen Konzentrationen (weniger als 5% Gewicht / Gewicht für Polymere mit hohem Molekulargewicht Sorten) in Anwesenheit von physiologischen Konzentrationen von Salzen, gibt es wenige oder gar keine schädlichen Wirkungen auf Säugetierzellen innerhalb dieser eingearbeitet Systeme^14-16.

Kürzlich haben die Grenzflächeneigenschaften und Partitionierung Wirkungen ATPSs von unserem Labor für Zelle Strukturieren ^{14, 16-20} angewandt. Dies wurde durch Mikrostrukturierung eine dichtere Lösung auf DEX Zellkultursubstraten in Gegenwart von PEG durchgeführt. Wenn Zellen in die PEG-Phase eingearbeitet sind, werden sie aus der Eingabe der DEX Tröpfchen aufgrund PEG / DEX Grenzflächenspannung ²⁰ ausgeschlossen. Wenn Zellen in der DEX Phase gemustert werden, werden sie an der Oberfläche des Substrats durch Zellkultur Grenzflächenspannung und Partitionierung ^{16, 17, 19} beibehalten.

Im Gegensatz zu anderen Verfahren zur Musterbildung Zelle ist ATPS Zelle Strukturieren einfach zu erlernen und erfordert nur rudimentäre Wissen über die Polymere selbst, und die Fähigkeit zur Zellkultur durchzuführen und eine Mikropipette. Andere Methoden zur Zelle Strukturierung beinhalten oft spezielle Ausrüstung und Ausbildung, die nicht leicht zu th übersetzte Life Sciences. Zum Beispiel können einige Methoden (Mikrokontaktdrucken oder Tintenstrahldruck)-Muster Zellen indirekt durch Aufbringen von Mustern zelladhäsive Biomoleküle an einem Kultursubstrat, das anschließend als Stellen für die Zellanheftung ^{21, 22} dienen. Obwohl indirekten Ansätzen nützlich für einige Zelltypen sind, erfordern sie einen hohen Grad an Geschicklichkeit und Benutzers Spezialausrüstung die Musterbildung Werkzeug herzustellen, und können Spezifität fehlt Abhängigkeit von der speziellen Zelltyp / Biomolekül Muster. Alternativ können Zellen, die mit hoher Spezifität Muster durch direkte Strukturierung Ansätze, die laminare Strömung Strukturieren, stenciling und ^23-26 gehören Tintenstrahldruck abgeschieden werden. Jedoch erfordern diese Techniken auch Benutzerexpertise und Spezialausrüstung und kann Zellen während des Druckprozesses zu beschädigen. Obwohl diese Ansätze in der Regel produzieren präzise Muster der Zellen, Zell-Strukturierung ein nützliches Werkzeug in den Lebenswissenschaften zu sein, muss es kostengünstig a seinnd einfach zu implementieren.

Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von strukturierten Zellkulturen mit den ATPSs in unserem zuvor veröffentlichten Anwendungen beschrieben. Mit nur Mikropipetten können Anwender Zellausschlussschicht Zonen oder Zelle Inseln Zellmigrationsassays. Dies wird mittels PEG / DEX Grenzflächenspannung, die entweder beibehält Zellen im DEX Phase oder schließt Zellen in der PEG-Phase vom abgeschiedenen DEX erreicht. Durch Kämmen diese beiden grundlegenden Strukturieren Techniken ist es möglich, schnell zu generieren Co-Kulturen von Zellen wie Leber-Fibroblastenzelle Co-Kulturen. Strukturierungsverfahren, ATPS Parametern und erwarteten Ergebnisse sind in Einzelheiten beschrieben.

Protocol

Ein. Phase-System Charakterisierung: Ermittlung Schwellenwerte für Phase Separation Planen Lösungen enthaltend PEG und DEX in dem gewünschten Puffer oder Zellkulturmedium, wie in Figur 1 (lila Punkte) in 15 ml oder 50 ml konischen Röhrchen gezeigt. Im Folgenden wird PEG und DEX auf 35 kDa PEG und 500 kDa DEX beziehen, aber kritischen Konzentrationen ändert sich je nach den beiden Polymeren verwendet. Notieren Sie sich die Masse von PEG und DEX in jeder Lösung. High-Konzentration Polymer…

Representative Results

Um eine geeignete Kombination von PEG und DEX für Zelle Strukturieren auszuwählen, ist es wichtig, um die binodale Kurve bestimmen. Diese Kurve skizziert die Punkte, an denen ein ATPS bilden können und für einen gegebenen Satz von Polymeren auf Temperatur, pH und Ionengehalt variieren. Zum Kultivieren von Zellen, die angepasst Mediums Formulierungen erfordern kann es erforderlich sein, um experimentell die binodale Kurve. Dies wird durch Erzeugen einer Reihe von ATPSs, die weit von der binodale und Variieren in ihre…

Discussion

Die ATPS Zelle Mikrostrukturierung Methode erfordert nur sehr wenig Know-how über Kenntnisse in Zellkultur-Techniken und kann schnell gemeistert werden. Die Vorteile dieser Vorgehensweise sind, dass sie preiswert, schnell und kompatibel mit einer Vielzahl von Zelltypen und Kultur Formaten ist. Aus diesen Gründen sollte unser Protokoll leicht Biowissenschaftler, insbesondere diejenigen, die Zellproliferation, Migration und Chemotaxis und den Einfluss der juxtacrine und parakrine Interaktionen zwischen Zellpopulationen …

Materials

Reagent	Manufacturer
Dextran 500,000 kDa	Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum	Gibco, Carlsbad, CA