Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

Summary

Acuosos sistemas de dos fases se utiliza para poblaciones modelo simultáneamente múltiples de células. Este método rápido y fácil para el patrón celular se aprovecha de la separación de fases de las soluciones acuosas de glicol de polietileno y dextrano y la tensión interfacial que existe entre las dos soluciones de polímero.

Abstract

Tecnologías de células de patrones que son rápidos, fáciles de usar y asequible se requiere para el desarrollo futuro de los ensayos de rendimiento de alta celulares, plataformas para el estudio de interacciones célula-célula y sistemas de ingeniería tisular. Este protocolo detallado se describe un método para la generación de co-cultivos de células utilizando soluciones biocompatibles de dextrano (DEX) y polietilenglicol (PEG) que los de fase separada cuando se combina encima de las concentraciones umbral. Las células se pueden modelar en una variedad de configuraciones que utilizan este método. Patrón célula exclusión se puede realizar mediante la impresión de gotitas de DEX sobre un sustrato y cubriéndolos con una solución de PEG que contienen células. La tensión interfacial formada entre la dos soluciones de polímero hace que las células estén en torno al exterior de la gotita de DEX y formar un claro circular que puede ser utilizado para los ensayos de migración. Islas de células puede ser modelado por dispensación de una fase rica en células DEX en una solución de PEG, o cubriendo la DEXgota con una solución de PEG. Co-cultivos se pueden formar directamente mediante la combinación de exclusión celular con DEX patrón isla. Estos métodos son compatibles con una variedad de enfoques de manejo de líquidos, incluyendo micropipeteo manual, y se puede usar con prácticamente cualquier tipo de célula adherente.

Introduction

Acuosos sistemas de dos fases (ATPSs) forma cuando las soluciones de dos polímeros incompatibles se mezclan juntos en concentraciones suficientemente altas. La separación de fases está influenciada por una variedad de factores que incluyen el peso molecular y la polaridad de los polímeros, la temperatura de las soluciones, pH y contenido iónico del disolvente acuoso ^{1, 2.} El punto en el que las dos soluciones de polímeros separados se determina por las propiedades fisicoquímicas de la fase del sistema elegido, pero en general se produce a bajas concentraciones de polímero (menos de 20% peso / peso) bajo condiciones no desnaturalizantes, permitiendo ATPSs que se utilizará para la biotecnología ^3-9 aplicaciones.

Con mucho, los más ampliamente estudiados ATPS es el polietilenglicol (PEG) / sistema de dextrano (DEX). Los ATPS formadas por estos polímeros de bajo costo y biocompatible fue originalmente descrita para la purificación de biomoléculas por medio de partición molecular ^{2, 10.} Particionamientose produce cuando las moléculas o partículas adicionales que no contribuyen al sistema de fase se mezclan con PEG y DEX. En base a sus afinidades relativas para ya sea DEX o PEG, las moléculas o partículas preferentemente residirá dentro de una de las dos fases o en el interfaz. Otra característica de la ATPS PEG / dex es la existencia de la tensión interfacial entre las dos fases de polímero. ATPSs formados por PEG y DEX generalmente muestran tensiones interfaciales que son mucho más bajos que otros líquido-líquido en sistemas de dos fases, tales como aceite y agua, sin embargo, las fuerzas de tensión interfacial todavía ejercen efectos sobre las pequeñas partículas tales como virus, células y agregados de proteínas ^{2 , 11-13.} Finalmente, puesto que mayor peso molecular de PEG y DEX separado a bajas concentraciones (menos de 5% peso / peso de polímeros de alto peso molecular variedades) en presencia de concentraciones fisiológicas de sales, hay pocos o ningún efectos deletéreos sobre células de mamífero incorporado dentro de estos sistemas^14-16.

Recientemente, las propiedades interfaciales y los efectos de partición de ATPSs han sido aplicadas por nuestro laboratorio para el patrón celular ^{14, 16-20.} Esto se logró por micropatterning una solución más densa DEX sobre sustratos de cultivo de células en presencia de PEG. Cuando las células se incorporan en la fase de PEG, se excluyen la entrada de las gotitas de DEX debido a PEG / dex tensión interfacial ^20. Cuando las células se modelan en la fase de DEX, que son retenidos en la superficie del sustrato de cultivo celular mediante la tensión interfacial y la partición ^{16, 17, 19.}

En contraste con otros métodos para el patrón celular, patrón ATPS celular es fácil de aprender y sólo requiere conocimientos rudimentarios sobre los propios polímeros, y la capacidad para llevar a cabo el cultivo de células y el uso de una micropipeta. Otros métodos para modelar celular implican a menudo el equipo especializado y capacitación que no se traducen fácilmente a the las ciencias biológicas. Por ejemplo, algunos métodos (impresión por microcontacto de impresión de inyección de tinta o) células de patrón indirectamente mediante la aplicación de patrones de biomoléculas adhesivas celulares a un sustrato de cultivo que posteriormente sirven como sitios para la unión celular ^{21, 22.} Aunque los enfoques indirectos son útiles para algunos tipos celulares, que requieren un alto grado de habilidad del usuario y equipo especializado para la fabricación de la herramienta de modelado, y puede carecer de especificidad dependiendo del tipo particular de células / biomolécula patrón. Alternativamente, las células pueden ser depositados con una especificidad alta patrón por medio de enfoques de modelado directos que incluyen patrones de flujo laminar, estarcir y la impresión de inyección de tinta ^23-26. Sin embargo, estas técnicas también requieren experiencia del usuario y equipo especializado, y puede dañar las células durante el proceso de impresión. Si bien estos métodos generalmente producen patrones precisos de células, que permiten definir motivos de células a ser una herramienta útil en las ciencias de la vida, debe ser rentable unnd simple de implementar.

Aquí mostramos un protocolo detallado para la generación de patrones de cultivos celulares utilizando los ATPSs descritos en nuestras aplicaciones previamente publicados. Usando sólo Micropipetas, los usuarios pueden generar zonas de células de exclusión o islas celulares para los ensayos de migración. Esto se consigue por medio de PEG / dex tensión interfacial que o bien conserva las células en la fase de DEX o excluye las células depositadas en la fase de PEG de DEX. Por el peinado de estas dos técnicas fundamentales de dibujo, es posible generar rápidamente co-cultivos de células tales como células de hígado de fibroblastos co-cultivos. Métodos de patterning, parámetros ATPS y los resultados esperados se describen en detalle.

Protocol

1. Fase de caracterización del sistema: Los umbrales determinantes para la separación de fases Preparar soluciones que contienen PEG y DEX en el tampón deseado o medio de cultivo celular como se muestra en la Figura 1 (puntos púrpura) en 15 ml o 50 tubos cónicos ml. En lo sucesivo, PEG y DEX se refieren a PEG de 35 kDa y 500 kDa DEX, sin embargo, concentraciones críticas cambiará en función de los dos polímeros utilizados. Registrar la masa de PEG y DEX en cada solución. Alta concen…

Representative Results

Para seleccionar una combinación apropiada de PEG y DEX para el patrón de células es importante para determinar la curva binodal. Esta curva delimita los puntos en los que un ATPS pueden formar y pueden variar para un conjunto dado de polímeros basada en la temperatura, pH y contenido iónico. Para el cultivo de células que requieren formulaciones personalizadas medio puede ser necesario para determinar experimentalmente la curva binodal. Esto se logra mediante la generación de una serie de ATPSs que están lejos …

Discussion

La célula ATPS micropatterning método requiere conocimientos muy poco más allá de la competencia en técnicas de cultivo celular y se puede dominar rápidamente. Las ventajas de este enfoque son que es barato, rápido y compatible con una variedad de tipos de células y formatos de cultivo. Por estas razones, el protocolo debe ser fácilmente adoptada por científicos de la vida, en particular los que estudian la proliferación celular, la migración y la quimiotaxis, y la influencia de las interacciones yuxtacrina …

Materials

Reagent	Manufacturer
Dextran 500,000 kDa	Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum	Gibco, Carlsbad, CA