Cell Co-kultur mönstring med användning av vattenhaltiga tvåfassystem

Summary

Vattenhaltiga tvåfassystem användes för att samtidigt mönster flera populationer av celler. Denna snabb och enkel metod för cell-mönstring utnyttjar fasseparationen av vattenlösningar av dextran och polyetylenglykol och gränsytspänningen som finns mellan de båda polymerlösningarna.

Abstract

Cell mönstring teknik som är snabb, enkel att använda och prisvärd kommer att krävas för den framtida utvecklingen av höga analyser genomströmning cell, plattformar för att studera cell-cell interaktioner och vävnadstekniska system. Denna detaljerade protokoll beskriver en metod för att generera samkulturer av celler använda biokompatibla lösningar av dextran (DEX) och polyetylenglykol (PEG) som fasseparerar när de kombineras ovan tröskelkoncentrationer. Celler kan vara mönstrad i en mängd olika konfigurationer som använder denna metod. Cell uteslutning mönstring kan utföras genom tryckning droppar av DEX på ett substrat och täcka dem med en lösning av PEG-innehållande celler. Gränsytspänningen bildas mellan de två polymerlösningarna orsakar celler att falla runt utsidan av DEX droppen och bildar en cirkulär clearing som kan användas för migration analyser. Cellöar kan mönstras genom att fördela en cell-rik DEX fasen till en PEG-lösning eller genom att täcka DEXdroppe med en lösning av PEG. Samkulturer kan bildas direkt genom att kombinera celler uteslutning med DEX ö mönster. Dessa metoder är kompatibel med en mängd av flytande hantering strategier, inklusive manuell micropipetting, och kan användas med praktiskt taget alla vidhäftande celltyp.

Introduction

Vattenhaltiga tvåfassystem (ATPSs) form när lösningar av två inkompatibla polymerer blandas samman vid tillräckligt höga koncentrationer. Fasseparation påverkas av en mängd olika faktorer som inkluderar molekylvikten och polaritet av polymererna, temperaturen hos lösningar, pH och jonisk innehåll av det vattenhaltiga lösningsmedlet ^{1, 2.} Den punkt vid vilken de två polymerlösningarna separata bestäms av de fysiokemiska egenskaperna hos det valda fassystemet, men sker i allmänhet vid låga polymerkoncentrationer (mindre än 20% vikt / vikt) under icke-denaturerande betingelser, så att ATPSs kan användas för bioteknik tillämpningar ^3-9.

Den överlägset mest omfattande studerade ATPS är polyetylenglykol (PEG) / dextran (DEX)-system. De ATPS bildas av dessa billiga och biokompatibla polymerer beskrevs ursprungligen för rening av biomolekyler genom molekylär avskärmning ^{2, 10.} Partitioneringuppstår när ytterligare molekyler eller partiklar som inte bidrar till fassystemet blandas med PEG och DEX. Baserat på deras relativa affiniteter för antingen DEX eller PEG, kommer molekylerna eller partiklarna uppehålla företrädesvis inom en av de två faserna eller vid gränsytan. En annan egenskap av PEG / DEX ATPS är förekomsten av ytspänningen mellan de två polymer faserna. ATPSs bildas av PEG och DEX visa generellt gränsytmedel spänningar som är mycket lägre än andra vätske-vätske tvåfassystem såsom olja och vatten, men gränsytespänningen krafter fortfarande utövar effekter på små partiklar såsom virus, celler och aggregat protein ^{2 , 11-13.} Slutligen, eftersom högre molekylvikt PEG och DEX separat vid låga koncentrationer (mindre än 5% vikt / vikt för högmolekylära polymerer sorter) i närvaro av fysiologiska koncentrationer av salter, det finns få, om några skadliga effekter på däggdjursceller införlivas i dessa system^14-16.

Nyligen har de gränsytmedel egenskaper och partitionering effekter av ATPSs tillämpats av vårt labb för cell mönstring ^{14, 16-20.} Detta åstadkoms genom micropatterning en tätare DEX lösning på cellkultursubstrat i närvaro av PEG. När cellerna inkorporeras i PEG-fasen, är de uteslutna från att komma in DEX dropparna på grund PEG / DEX gränsytspänning ^20. När celler är mönstrade i DEX fasen, de kvarhålles vid ytan av cellen odlingssubstratet genom gränsytspänning och partitionering ^{16, 17, 19.}

I motsats till andra metoder för cell mönstring är ATPS cell mönster är lätt att lära sig och kräver endast rudimentära kunskaper om de polymerer själva och förmågan att utföra cellodling och använda en mikropipett. Andra metoder för cell-mönstring innebär ofta specialiserad utrustning och utbildning som inte är lätt översättas till the biovetenskap. Till exempel, vissa metoder (microcontact utskrift eller bläckstråleutskrifter) mönster celler indirekt genom att tillämpa mönster av biomolekyler cell lim till en kultur substrat som sedan fungerar som platser för cellvidhäftning ^{21, 22.} Även indirekta metoder är användbara för vissa celltyper, kräver de en hög grad av användarens skicklighet och specialutrustning för att tillverka verktyget mönstring, och kan sakna specificitet beroende på den speciella celltyp / biomolekyl mönster. Alternativt kan celler deponeras med hög mönster specificitet genom direkta mönstring tillvägagångssätt som inkluderar laminärt flöde mönstring, stenciling och bläckstråleutskrifter ^23-26. Dessa tekniker kräver också användaren expertis och specialutrustning, och kan skada celler under tryckprocessen. Även om dessa metoder i allmänhet producera exakta mönster av celler, för cell mönstring för att vara ett användbart verktyg inom livsvetenskaperna, måste det vara kostnadseffektivt ettnd enkel att genomföra.

Här rapporterar vi ett detaljerat protokoll för att generera mönstrade cellkulturer med hjälp av ATPSs beskrivs i våra tidigare publicerade applikationer. Med enbart mikropipetter kan användarna skapa zoner cell uteslutning eller öar cell för migration analyser. Detta uppnås med hjälp av PEG / DEX-gränsytspänning som antingen bibehåller celler i DEX fasen eller utesluter celler deponeras i PEG-fasen från DEX. Genom kamning dessa två grundläggande mönstring teknik är det möjligt att snabbt generera samkulturer av celler såsom lever-fibroblastcell samkulturer. Mönstring metoder, ATPS parametrar och förväntade resultat beskrivs i detalj.

Protocol

1. Fas system Karaktärisering: Fastställande Tröskelvärden för fasseparation Bered lösningar innehållande PEG och DEX i den önskade bufferten eller cellodlingsmedium såsom visas i figur 1 (lila punkter) i 15 ml eller 50 ml koniska rör. Härefter kommer PEG och DEX avser 35 kDa PEG och 500 kDa DEX, men kommer kritiska koncentrationer ändras beroende på de använda två polymerer. Notera den totala massan av PEG och DEX i varje lösning. Hög koncentration polymerlösningar kan ta f…

Representative Results

För att välja en lämplig kombination av PEG och DEX för cell mönstring är det viktigt att bestämma binodal kurvan. Denna kurva beskriver de punkter vid vilka en ATPS kan bilda och kan variera för en given uppsättning av polymerer baserade på temperatur, pH och jonisk innehåll. För odling av celler som kräver anpassade mediet formuleringar kan det vara nödvändigt att experimentellt bestämma binodal kurvan. Detta åstadkommes genom att generera en serie ATPSs som är långt från binodal och varierande i d…

Discussion

Den ATPS celler micropatterning metod kräver väldigt lite kunskap bortom kunskaper i cellodlingstekniker och kan snabbt behärskar. Fördelarna med detta tillvägagångssätt är att det är billigt, snabbt och kompatibel med en mängd olika celltyper och format kultur. Av dessa skäl bör vi protokoll enkelt anta livet forskare, särskilt de som studerar cellproliferation, migration och kemotaxi, och påverkan av juxtacrine och parakrina interaktioner mellan cellpopulationer. Analyserna som presenteras här kan lätt…

Materials

Reagent	Manufacturer
Dextran 500,000 kDa	Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum	Gibco, Carlsbad, CA