Сотовые Co-культуре Создание массивов с использованием водных двухфазных системах

Summary

Водные двухфазных системах были использованы для одновременного картина несколько популяций клеток. Это быстрый и простой способ для сотовых паттерна использует преимущества фазового разделения водных растворов декстрана и полиэтиленгликоля и поверхностное натяжение, которое существует между двумя растворов полимеров.

Abstract

Сотовые паттерна технологий, которые являются быстрый, легкий в использовании и доступным будут необходимы для дальнейшего развития высокой пропускной способности ячейки анализы, платформы для изучения межклеточных взаимодействий и тканей инженерных систем. Это подробный протокол описывает метод для создания совместных культурах клеток с использованием биосовместимых решения декстрана (DEX) и полиэтиленгликоля (PEG), что поэтапный отдельные сочетании выше пороговых концентраций. Клетки могут быть узорными в различных конфигурациях, используя этот метод. Структурирование сотовых исключение может быть выполнена путем печати каплями DEX на подложке и покрывая их решения PEG, содержащий клетки. Поверхностного натяжения образуется между двумя растворов полимеров заставляет клетки падают вокруг внешней капли DEX и образуют круговую очистки, которые могут быть использованы для миграции анализов. Сотовые острова могут быть узорными по выдачи ячейки богатых DEX фазы в раствор ПЭГ или путем покрытия DEXкапли с раствором ПЭГ. Co-культур может быть сформирована непосредственно путем объединения ячейки исключения с структурирование DEX острова. Эти методы являются совместимыми с различными подходами обработки жидких, в том числе руководство micropipetting, и может быть использован практически с любым приверженцем типа клеток.

Introduction

Водные двухфазные системы (ATPSs) форме, когда решения двух несовместимых полимеров смешиваются при достаточно высоких концентрациях. Разделение фаз зависит от целого ряда факторов, которые включают молекулярный вес и полярности полимеры, температура решений, рН и ионной содержание водного растворителя ^{1, 2.} Точка, в которой два полимерных растворов отдельные определяется физико-химическими свойствами выбранных фаз системы, но обычно происходит при низких концентрациях полимера (менее 20% вес / вес) в неденатурирующих условия, позволяющие ATPSs, которые будут использоваться для биотехнологии приложениям ^3-9.

До сих пор наиболее широко изучены ATPS является полиэтиленгликоля (ПЭГ) / декстран (DEX) системы. ATPS, образованных этими недорогими и биосовместимых полимеров был впервые описан для очистки биомолекул путем молекулярного разбиение ^{2, 10.} Разметкапроисходит, когда дополнительные молекулы или частицы, которые не способствуют фазная система смешивают с ПЭГ и DEX. На основе их относительного сходства либо DEX или PEG, молекул или частиц будет преимущественно находиться в одном из двух фаз или в интерфейсе. Еще одно свойство PEG / DEX ATPS является наличие поверхностного натяжения между двумя фазами полимера. ATPSs образована PEG и DEX обычно проявляют поверхностного натяжения, что значительно ниже, чем у других жидкостей двухфазных систем, таких как масло и вода, однако, поверхностное натяжение силы все еще ​​оказывают влияние на мелкие частицы, такие как вирусы, клетки и белковых агрегатов ^{2 , 11-13.} Наконец, с более высокой молекулярной массой ПЭГ и DEX отдельной при низких концентрациях (менее 5% вес / вес для высокого молекулярного веса полимеров сортов) в присутствии физиологических концентраций солей, есть мало, если вообще вредное воздействие на клетки млекопитающих включены в эти системы^14-16.

В последнее время межфазных свойств и разделения эффектов ATPSs были применены нашей лаборатории для сотовых паттерна ^{14, 16-20.} Это было достигнуто путем micropatterning решение плотнее DEX на подложках культуре клеток в присутствии ПЭГ. Когда клетки встраиваются в фазу PEG, они исключаются из входящих DEX капель в связи с PEG / DEX поверхностное натяжение ^20. Когда клетки образцу в фазе DEX, они сохраняются на поверхности подложки культуре клеток поверхностного натяжения и перегородки ^{16, 17, 19.}

В отличие от других методов для сотовых рисунка, ATPS ячейки паттерна проста в освоении и требует лишь элементарные знания о полимерах себя, и способность выполнять культуре клеток и использовать микропипетки. Другие методы для сотовых паттерна часто включают в себя специализированное оборудование и обучение, которые не легко переводятся в гоэлектронной науках о жизни. Например, некоторые методы (микроконтактной печати или печати на струйных принтерах) образец клеток косвенным путем применения модели биомолекулы клетки клея на подложку культуры, которые впоследствии служат в качестве объектов для прикрепления клеток ^{21, 22.} Хотя косвенные подходы полезны для некоторых типов клеток, они требуют высокого уровня квалификации пользователя и специализированного оборудования для изготовления паттерна инструмент, и может не хватать специфику в зависимости от конкретного типа клеток / биомолекулы шаблону. Кроме того, клетки могут быть нанесены с высокой специфичностью картина путем прямого подхода паттернов, которые включают ламинарного потока рисунка, трафарету и струйной печати ^23-26. Однако, эти методы также требуют опыта пользователя и специализированного оборудования, и может привести к повреждению клеток во время процесса печати. Хотя эти подходы обычно производят точные модели клетки, клетки рисунок, чтобы быть полезным инструментом в науках о жизни, оно должно быть экономически эффективнымя прост в реализации.

Здесь мы приводим подробный протокол для создания узорной использованием клеточных культур ATPSs описаны в наших ранее опубликованных приложений. Используя только micropipettors, пользователи могут создавать ячейки запретных зон или сотовый островов для миграции анализов. Это достигается путем PEG / DEX поверхностное натяжение, что либо сохраняет клетки в фазе DEX или исключает клетки на хранение в PEG фазы от DEX. По расчесывание этих двух основных методов структурирования, можно быстро генерировать совместных культурах клеток, таких как печень фибробластов со-культуры. Создание массивов методами, ATPS параметры и ожидаемые результаты описаны в деталях.

Protocol

1. Фазная система Характеристика: Определение пороговых значений для разделения фаз Подготовка растворов, содержащих ПЭГ и DEX в нужную ячейку буфера или культуральной среде, как показано на рисунке 1 (фиолетовые точки) в 15 мл или 50 мл конические пробирки. Далее, PEG и DEX будет…

Representative Results

Чтобы выбрать соответствующую комбинацию ПЭГ и DEX для сотовых паттерна важно для определения бинодали кривой. Эта кривая очерчивает точки, в которых ATPS могут образовываться и может варьироваться для данного набора полимеров в зависимости от температуры, рН и ионного состава. Для культ…

Discussion

Micropatterning ATPS ячейки метод требует очень мало знаний, помимо знания методов культуры клеток и могут быть быстро освоены. Преимущества этого подхода в том, что он является недорогим, быстрым и совместимы с различными типами клеток и культуры форматов. По этим причинам, наш протокол должен ?…

Materials

Reagent	Manufacturer
Dextran 500,000 kDa	Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela	ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A	ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3	ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker	Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM	Gibco, Carlsbad, CA
RPMI	Gibco, Carlsbad, CA
F12	Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum	Gibco, Carlsbad, CA