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Bioengineering

सेल सह संस्कृति जलीय दो चरण सिस्टम का उपयोग कर Patterning

doi: 10.3791/50304 Published: March 26, 2013

Summary

जलीय दो चरण सिस्टम के साथ कोशिकाओं के पैटर्न कई आबादी के लिए इस्तेमाल किया गया. सेल patterning के लिए यह तेजी से और आसान तरीका dextran और polyethylene glycol और interfacial तनाव है कि दो बहुलक समाधान के बीच मौजूद जलीय समाधान के चरण जुदाई का लाभ लेता है.

Abstract

सेल patterning प्रौद्योगिकियों कि तेज, उपयोग करने के लिए आसान और सस्ती कर रहे हैं सेल सेल बातचीत और ऊतक इंजीनियर प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए उच्च throughput सेल assays, प्लेटफार्मों के भविष्य के विकास के लिए आवश्यक हो जाएगा. यह विस्तृत प्रोटोकॉल (DEX) dextran और polyethylene glycol (खूंटी) biocompatible समाधान है कि जब चरण अलग सीमा सांद्रता के ऊपर संयुक्त कोशिकाओं के सह संस्कृतियों पैदा करने के लिए एक विधि का वर्णन है. सेल विन्यास की एक किस्म में इस पद्धति का उपयोग किया जा सकता नमूनों. सेल अपवर्जन patterning एक सब्सट्रेट पर DEX की बूंदों छपाई और उन्हें खूंटी युक्त कोशिकाओं का एक समाधान के साथ कवर किया जा सकता है. interfacial दो बहुलक समाधान के बीच गठित तनाव कोशिकाओं का कारण बनता है DEX छोटी बूंद के बाहर चारों ओर आते हैं और कि प्रवास assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक परिपत्र समाशोधन फार्म. सेल द्वीप एक खूंटी समाधान में एक सेल युक्त DEX चरण वितरण या DEX कवर द्वारा किया जा सकता नमूनोंखूंटी की एक समाधान के साथ छोटी बूंद. सह संस्कृतियों DEX द्वीप patterning के साथ सेल अपवर्जन के संयोजन से सीधे का गठन कर सकते हैं. इन विधियों पुस्तिका micropipetting सहित तरल से निपटने के तरीकों की एक किस्म के साथ संगत कर रहे हैं, और वस्तुतः किसी भी पक्षपाती सेल प्रकार के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

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जलीय दो चरण सिस्टम (ATPSs) फार्म जब दो असंगत पॉलिमर के समाधान के साथ पर्याप्त उच्च सांद्रता में मिलाया जाता है. चरण जुदाई कारक है कि आणविक वजन और पॉलिमर के polarity, समाधान पीएच, और जलीय विलायक 1, 2 के ईओण सामग्री के तापमान में शामिल की एक किस्म से प्रभावित है. जो बिंदु पर दो बहुलक अलग समाधान चुना चरण प्रणाली के physiochemical गुणों द्वारा निर्धारित किया गया है, लेकिन आम तौर पर गैर denaturing शर्तों के तहत कम बहुलक सांद्रता (कम से कम 20% / wt wt) में होता है, ATPSs जैव प्रौद्योगिकी के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है 3-9 अनुप्रयोगों.

द्वारा अब तक के सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन ATPS polyethylene (खूंटी) glycol / dextran प्रणाली (DEX) है. इन सस्ती और biocompatible पॉलिमर द्वारा गठित ATPS मूल आणविक 2 विभाजन, 10 के रास्ते से biomolecules की शुद्धि के लिए वर्णित किया गया था. विभाजनतब होता है जब अतिरिक्त अणुओं या कणों कि चरण प्रणाली के लिए योगदान नहीं है खूंटी और DEX के साथ मिश्रित कर रहे हैं. या तो DEX या खूंटी के लिए उनके रिश्तेदार समानताएं के आधार पर, अणु कणों या preferentially एक दो चरणों के भीतर या अंतरफलक पर निवास करेंगे. खूंटी / DEX ATPS का एक अन्य संपत्ति दो बहुलक चरणों के बीच interfacial तनाव के अस्तित्व है. खूंटी और DEX द्वारा गठित ATPSs आम तौर पर interfacial तनाव कि अन्य तरल तरल तेल और पानी के रूप में इस तरह के दो चरण प्रणालियों की तुलना में काफी कम कर रहे हैं प्रदर्शित, तथापि, interfacial तनाव बलों को अभी भी वायरस, कोशिकाओं और प्रोटीन समुच्चय 2 के रूप में इस तरह के छोटे कणों पर प्रभाव डालती है 11-13. अंत में, उच्च आणविक भार खूंटी और DEX लवण की शारीरिक सांद्रता की उपस्थिति में कम सांद्रता (कम से कम 5% wt / उच्च आणविक भार पॉलिमर किस्मों के लिए wt) में अलग से, वहाँ कुछ कर रहे हैं अगर स्तनधारी कोशिकाओं पर कोई हानिकारक प्रभाव इन में शामिल सिस्टम14-16.

Interfacial गुण और ATPSs के विभाजन प्रभाव सेल patterning 14, 16-20 के लिए किया गया है हमारी प्रयोगशाला से लागू होता है. इस micropatterning द्वारा खूंटी की उपस्थिति में एक सघन सेल संस्कृति substrates पर DEX समाधान पूरा किया गया. जब कोशिकाओं खूंटी चरण में शामिल कर रहे हैं, वे DEX / खूंटी DEX interfacial 20 तनाव के कारण बूंदों में प्रवेश करने से बाहर रखा गया है. जब कोशिकाओं DEX चरण में नमूनों रहे हैं, वे interfacial तनाव और विभाजन 16, 17, 19 के द्वारा सेल संस्कृति सब्सट्रेट की सतह पर रखा जाता है.

सेल patterning के लिए अन्य तरीकों के विपरीत, ATPS सेल patterning जानने के लिए आसान है और केवल खुद पॉलिमर, और सेल संस्कृति प्रदर्शन और एक micropipettor का उपयोग करने की क्षमता के बारे में प्रारंभिक ज्ञान की आवश्यकता है. सेल patterning के लिए अन्य तरीकों अक्सर विशेष उपकरण और प्रशिक्षण कि आसानी वें नहीं अनुवाद कर रहे हैं शामिलई जीवन विज्ञान. उदाहरण के लिए, कुछ विधियों (microcontact मुद्रण या inkjet मुद्रण) एक संस्कृति है कि सब्सट्रेट बाद सेल लगाव 21, 22 के लिए साइटों के रूप में सेवा करने के लिए सेल चिपकने वाला biomolecules के पैटर्न लागू करने के द्वारा अप्रत्यक्ष रूप से पैटर्न कोशिकाओं. हालांकि अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण कुछ सेल प्रकार के लिए उपयोगी होते हैं, वे उपयोगकर्ता कौशल और विशेष patterning उपकरण निर्माण उपकरणों की एक उच्च डिग्री की आवश्यकता होती है, और विशिष्टता की कमी विशेष सेल प्रकार / biomolecule पैटर्न के आधार पर कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं प्रत्यक्ष patterning दृष्टिकोण है कि लामिना का प्रवाह patterning stenciling, और inkjet मुद्रण 23-26 के रास्ते से उच्च पैटर्न विशिष्टता के साथ जमा किया जा सकता है. हालांकि, इन तकनीकों को भी उपयोगकर्ता विशेषज्ञता और विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, और मुद्रण प्रक्रिया के दौरान कोशिकाओं को नुकसान हो सकता है. हालांकि इन तरीकों कोशिकाओं, सेल patterning के लिए आम तौर पर सटीक पैटर्न का उत्पादन करने के लिए जीवन विज्ञान में एक उपयोगी उपकरण हो, यह लागत प्रभावी एक होना चाहिएएन डी सरल लागू करने के लिए.

यहाँ हम नमूनों सेल ATPSs हमारे पहले प्रकाशित आवेदन में वर्णित का उपयोग कर संस्कृतियों को पैदा करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल रिपोर्ट. केवल micropipettors का उपयोग, उपयोगकर्ताओं सेल अपवर्जन प्रवास assays के लिए या क्षेत्रों सेल द्वीपों उत्पन्न कर सकते हैं. यह खूंटी / DEX interfacial तनाव है कि या तो DEX चरण में कोशिकाओं को बरकरार रखती है या DEX से खूंटी चरण में जमा कोशिकाओं शामिल नहीं की जिस तरह से हासिल की है. इन दो बुनियादी patterning तकनीक तलाशी से, यह संभव है तेजी से जिगर fibroblast सेल सह संस्कृतियों के रूप में कोशिकाओं के सह संस्कृतियों उत्पन्न. तरीकों patterning, ATPS मानकों और अपेक्षित परिणाम के विस्तार में वर्णित हैं.

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Protocol

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1. चरण प्रणाली विशेषता: चरण पृथक्करण के लिए निर्धारित सीमारेखा

  1. वांछित बफर या सेल संस्कृति के माध्यम के रूप में 15 मिलीग्राम या 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में चित्रा 1 (बैंगनी डॉट्स) में दिखाया में खूंटी और DEX युक्त समाधान तैयार. इसके बाद, खूंटी और DEX 35 केडीए खूंटी और 500 DEX केडीए संदर्भित करेंगे, लेकिन, महत्वपूर्ण सांद्रता दो पॉलिमर इस्तेमाल के आधार पर बदल जाएगा. प्रत्येक समाधान में खूंटी और DEX की बड़े पैमाने पर रिकार्ड. उच्च एकाग्रता बहुलक समाधान में कई घंटे लग भंग हो सकती है. Vortexing सीरम मुक्त समाधान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटीन या सीरम युक्त मीडिया के लिए एक कमाल मंच पर ट्यूब जगह जब तक दोनों पॉलिमर पूरी तरह से भंग कर रहे हैं. मीडिया का वजन करने के लिए पॉलिमर को भंग करने और प्रारंभिक सांद्रता के नोट लेने के लिए इस्तेमाल किया रिकार्ड.
  2. एक बार पॉलिमर पूरी तरह से भंग कर रहे हैं, समाधान बादल छाए रहेंगे दिखाई देनी चाहिए. यह पहला संकेत कि चरण जुदाई हुआ है है. यह पुष्टि करने के लिए अनुमति देते हैं,बहुलक समाधान कमरे के तापमान पर एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में 20 मिनट के लिए आराम करने के लिए. 1000 XG पर केन्द्रापसारण चरण जुदाई की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. denser नीचे चरण DEX और अमीर हो शीर्ष चरण खूंटी अमीर हो जाएगा.
  3. धीरे धीरे ट्यूबों को जोड़ने के अतिरिक्त बफर या मीडिया. लघु वेतन वृद्धि के रूप में चरण जुदाई बिंदु overshoot करने के लिए नहीं जा सकता है तो किया जाना चाहिए.
  4. जब समाधान स्पष्ट हो जाता है और अब कोई चरण अलग centrifugation के बाद, चरण जुदाई के लिए सीमा पर पहुँच गया है. ट्यूब के अंतिम वजन रिकार्ड.
  5. पॉलिमर के लिए पिछले रिकॉर्ड भार का उपयोग कर, अंतिम वजन के साथ साथ मीडिया को जोड़ने के बाद,% / प्रत्येक दो पॉलिमर जिस पर चरण जुदाई नहीं होती wt की wt निर्धारित.
  6. इन मूल्यों को प्लॉट% y-अक्ष और% wt / wt x-अक्ष पर DEX पर खूंटी / wt wt. इस साजिश, binodal वक्र के रूप में जाना जाता है, चरण जुदाई के लिए अलग concentrati के लिए सीमा एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैखूंटी / DEX की एक विशेष सेल संस्कृति माध्यम में लें.

2. विन्यास: 1 बहिष्करण Patterning (96 अच्छी तरह से थाली स्वरूप)

  1. 5.0% / wt wt खूंटी और सेल संस्कृति के माध्यम में 12.8% / wt wt DEX की अलग - अलग समाधान तैयार. कम से कम दो बार महत्वपूर्ण बिंदु के ATPS समाधान का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि एक ATPS रहता है के बाद पॉलिमर एक दूसरे के सम्मान के साथ संतुलन में लाना. खूंटी अमीर चरण और इसके विपरीत में एक DEX के प्रवाह की एक छोटी राशि है, इसलिए, महत्वपूर्ण एकाग्रता के निकट भी काम महत्वपूर्ण बिंदु से नीचे सांद्रता बूंद के रूप में चरण प्रणाली की हानि में परिणाम कर सकते हैं. इसी तरह, एक नमी और तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर में सेल संस्कृति डिश स्थानांतरित दो चरण गुणों में परिवर्तन और दो समाधान विलेयशील. नोट: कुछ कोशिकाओं अन्य ATPS योगों के साथ बेहतर प्रदर्शन कर सकते हैं. स्वीकार्य योगों binodal भाग 1 से निर्धारित घटता के आधार पर चुना जा सकता है.
  2. अपवर्जन patte के लिए इस्तेमाल किया जा कोशिकाओं जल का संग्रहणrning. कुल उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या / एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. वैकल्पिक: CellTracker या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए अन्य गैर साइटोटोक्सिक लेबल के साथ कोशिकाओं लेबल.
  3. गोली कोशिकाओं और 5.0% की एक उचित मात्रा में गोली resuspend बहिष्करण के लिए कक्षों की अपेक्षित संख्या प्राप्त करने के लिए खूंटी. उदाहरण के लिए, एक अच्छी तरह से एक 96-अच्छी तरह से थाली के 37,500 fibroblast कोशिकाओं खूंटी की 200 μl में resuspended करने के लिए अगले दिन संगम उत्पादन की आवश्यकता है. अन्य प्रकार सेल और संस्कृति सब्सट्रेट आकार के लिए उपयुक्त के रूप में इन नंबरों को मापें.
  4. एक micropipettor का उपयोग करते हुए, एक सूखी सेल संस्कृति सब्सट्रेट DEX की 0.5 μl बूंदों बांटना. बड़ी मात्रा में बूंदों बड़ा अपवर्जन क्षेत्रों का उत्पादन. आकार में 0.1 से 1 μl लेकर बूंदों अपवर्जन micropatterning लिए सिफारिश कर रहे हैं. वैकल्पिक: DEX बूंदों समय की 24 घंटा आगे जमा किया जा सकता है और कमरे के तापमान पर निर्जलीकरण की अनुमति दी. यह क्लीनर पैटर्न का उत्पादन कर सकते हैं.
  5. टी में 200 μl खूंटी सेल निलंबन के बांटनावह अच्छी तरह से DEX बूंदों को कवर करने के लिए.
  6. 37 पर 12 घंटे के लिए एक humidified इनक्यूबेटर डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में रखें. सुनिश्चित करें कि डिश हैंडलिंग के दौरान और कि यह एक स्तर इनक्यूबेटर शेल्फ पर रखा गया है पैटर्न में खलल न डालें से बचने नहीं झुका है.
  7. खूंटी समाधान निकालें और संस्कृति के माध्यम के 200 μl के साथ तीन बार धो लो.
  8. ताजा संस्कृति मध्यम और इनक्यूबेटर में लौटने जोड़ें.
  9. संस्कृतियों के लिए समय - समय पर नजर रखने के अपवर्जन क्षेत्र में सेल आंदोलन का पालन.

3. 2 विन्यास: द्वीप Patterning (96 अच्छी तरह से थाली स्वरूप)

  1. 5.0% / wt wt खूंटी और सेल संस्कृति के माध्यम के रूप में ऊपर में 12.8% / wt wt DEX के समाधान तैयार.
  2. द्वीप patterning के लिए इस्तेमाल किया जा कोशिकाओं फसल. कुल उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या / एकाग्रता का निर्धारण करते हैं.
  3. गोली और resuspend 12.8% DEX का एक उचित मात्रा में कोशिकाओं द्वीप patterning के लिए कोशिकाओं के वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के. 5000 CE के सांद्रताLLS / μl या उससे कम जोरदार पक्षपाती सेल प्रकार के लिए सिफारिश कर रहे हैं. कोशिकाओं है कि संलग्न कठिनाई या कोशिकाओं है कि शिथिल पालन करना है, अप करने के लिए 10,000 कोशिकाओं / μl सांद्रता माना जा सकता है.
  4. काम जल्दी सुखाने, एक सूखी सेल संस्कृति सब्सट्रेट विंदुक DEX के 0.5 μl बूंदों के रूप में ऊपर वर्णित से बचने के लिए. बूंदों शुष्क करने की अनुमति न दें. वैकल्पिक: खूंटी समाधान के 200 μl अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा जा सकता है समय से आगे. DEX बूंदों तो खूंटी समाधान जहां वे नीचे सिंक और संस्कृति संपर्क सतह में जमा किया जा सकता है. इस क्लीनर द्वीप पैटर्न का उत्पादन कर सकते हैं.
  5. खूंटी के 200 μl DEX बूंदों के साथ कवर.
  6. 37 पर 12 घंटे के लिए एक humidified इनक्यूबेटर डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में रखें. सुनिश्चित करें कि डिश हैंडलिंग के दौरान और कि यह एक स्तर इनक्यूबेटर शेल्फ पर रखा गया है पैटर्न में खलल न डालें से बचने नहीं झुका है.
  7. खूंटी समाधान निकालें और संस्कृति के माध्यम के 200 μl के साथ तीन बार धो लो.
  8. ताजा संस्कृति जोड़ेंमध्यम और इनक्यूबेटर में लौटने.
  9. संस्कृतियों समय समय पर मॉनिटर करने के लिए सेल और द्वीपों से आंदोलन प्रसार बाहर का पालन.

4. 3 विन्यास बहिष्करण सह संस्कृतियों (96 अच्छी तरह से थाली स्वरूप)

  1. 5.0% / wt wt खूंटी और सेल संस्कृति के माध्यम के रूप में ऊपर में 12.8% / wt wt DEX के समाधान तैयार.
  2. बहिष्कार और द्वीप patterning के लिए इस्तेमाल किया जा कोशिकाओं फसल. कुल / प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. वैकल्पिक: कुछ सेल pairings नाटकीय रूप से अलग प्रसार इंडेक्स प्रदर्शित कर सकता है. द्वीप नमूनों कोशिकाओं (विशेष रूप से लंबी अवधि संस्कृतियों के लिए) overpopulating से बाहर कोशिकाओं को रोकने के लिए, mitomycin सी के साथ 2 घंटे के लिए बाहर करने के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं का इलाज या उन्हें कटाई से पहले प्रकाशित. इस प्रसार को रोकने जाएगा. प्रतिदीप्त CellTracker रंजक के लिए यदि आवश्यक हो तो दो सेल आबादी भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. Exclusio के लिए गोली और कोशिकाओं गोली resuspend5.0% खूंटी के एक उचित मात्रा में n patterning कोशिकाओं की अपेक्षित संख्या प्राप्त करने के लिए, जैसा कि ऊपर. द्वीप patterning के लिए गोली 12.8% DEX का एक उचित मात्रा में करने के लिए ऊपर के रूप में कोशिकाओं के वांछित एकाग्रता, प्राप्त करने Resuspend.
  4. एक micropipettor का उपयोग करते हुए, एक सूखी सेल संस्कृति सब्सट्रेट DEX सेल निलंबन के 0.5 μl बूंदों बांटना. बूंदों शुष्क करने की अनुमति न दें.
  5. खूंटी सेल निलंबन के 200 μl DEX बूंदों के साथ कवर.
  6. 37 पर 12 घंटे के लिए एक humidified इनक्यूबेटर डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में रखें. सुनिश्चित करें कि डिश हैंडलिंग के दौरान और कि यह एक स्तर इनक्यूबेटर शेल्फ पर रखा गया है पैटर्न में खलल न डालें से बचने नहीं झुका है.
  7. खूंटी समाधान निकालें और संस्कृति के माध्यम के 200 μl में तीन बार धो लो.
  8. ताजा संस्कृति मध्यम और इनक्यूबेटर में लौटने जोड़ें.
  9. सह संस्कृतियों को मॉनिटर करने के लिए सेल आबादी के बीच बातचीत का निरीक्षण करने के लिए. वैकल्पिक: नियंत्रण अपवर्जन या द्वीप patterning indiv प्रदर्शन द्वारा तैयार किया जा सकता हैidually, सह संस्कृति कोशिकाओं है कि बातचीत नहीं करते हैं या एक या दोनों से पहले या बाद patterning सेल आबादी में ब्याज के रास्ते को अवरुद्ध करके.

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Representative Results

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सेल patterning के लिए एक खूंटी और DEX के उचित संयोजन का चयन करने के लिए यह महत्वपूर्ण है कि binodal वक्र निर्धारित. इस वक्र अंक जिस पर एक ATPS फार्म और पॉलिमर का सेट दिया तापमान, पीएच, और ईओण सामग्री के आधार पर करने के लिए भिन्न हो सकते हैं कर सकते हैं रूपरेखा बनाती है. संवर्धन कोशिकाओं कि अनुकूलित मध्यम योगों की आवश्यकता के लिए यह आवश्यक हो तजरबा binodal वक्र निर्धारित हो सकता है. यह ATPSs है कि दूर से binodal और उनके खूंटी और DEX सामग्री में अलग (1 चित्रा, बैंगनी हलकों) की एक श्रृंखला पैदा करके पूरा किया है. जब एक ATPS मौजूद है, बहुलक समाधान बादल छाए रहेंगे प्रकट जब मिश्रित और अलग - अलग चरणों में संतुलन में लाना अगर छोड़ undisturbed. बहुलक मिश्रण करने के लिए अतिरिक्त विलायक जोड़ने, ATPS 0% खूंटी / 0% DEX दृष्टिकोण होगा. कुछ बिंदु पर, मिश्रण अब अलग चरण होगा. एक बिंदु पर है कि ऊपर, खूंटी DEX / एकाग्रता, जिस पर यह तब होता है binodal वक्र पर एक बिंदु का प्रतिनिधित्व करता हैपुनश्च फार्म और उस बिंदु से नीचे यह नहीं कर सकते. चित्रा 1 में घटता के साथ और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के बिना तीन आम सेल संस्कृति मीडिया के लिए binodals का प्रतिनिधित्व करते हैं. सांद्रता, जिस पर एक ATPS गठन किया है थोड़ा FBS की उपस्थिति में अधिक हैं.

हमारी पिछली रिपोर्टों में, हम एक महत्वपूर्ण बिंदु (binodal पर जो बिंदु पर संतुलन के बाद खूंटी और DEX फार्म की बराबर मात्रा में) 2.5% खूंटी 35 kDa/3.2% DEX 500 केडीए के. पर आधारित ATPSs का इस्तेमाल किया परिणाम हमारे binodal डेटा से इस महत्वपूर्ण बिंदु मूल्य के करीब निकटता में हैं. हम patterning के लिए नौ चरण प्रणाली संयोजनों का परीक्षण किया है, के रूप में तालिका 1 में दिखाया. खूंटी और DEX की शुद्ध समाधान के बाद से उनके बहुलक सांद्रता को सम्मान के साथ संतुलन में लाना बाद वे संयुक्त कर रहे हैं, इन समाधान के कुछ स्थिर ATPSs फार्म नहीं था, और इसलिए थे patterning (टेबल 1a, x अंक) के लिए उपयोगी नहीं है. अन्य बहुलक संयोजन पहचानने योग्य पैटर्न का उत्पादन, लेकिन वर्दी प्रयोग के लिए पर्याप्त नहीं थे (टेबल 1a x / के निशान ✓). उपयोगी बहुलक योगों अपवर्जन क्षेत्र या द्वीपों है कि गैर नमूनों क्षेत्रों (टेबल 1a, के निशान ✓) में लगभग कोशिकाओं से रहित थे गठन किया था.

10% खूंटी के साथ, हमने पाया है कि सेल आकारिकी असामान्य रूप दौर था और धुरी की तरह 24 घंटे के बाद कोशिकाओं को एक कम संस्कृति सतह (टेबल 1b, x अंक) संलग्न करने की क्षमता प्रदर्शित करने के साथ,. आकृति विज्ञान और लगाव के लिए 2.5% और 5% खूंटी (टेबल 1b, ✓ के निशान) सामान्य थे. हम उच्च खूंटी सांद्रता (तालिका -1 सी, एक्स अंक) में संस्कृति के माध्यम से कि सीरम उपजी मनाया, सुझाव है कि असामान्य सेल और 10% खूंटी में morphology लगाव सीरम के उपयोग के साथ समस्याओं से संबंधित हो सकता है. इसके अतिरिक्त, खूंटी प्लाज्मा झिल्ली 27 को बाधित करने के लिए जाना जाता है. हालांकि इन प्रभावों को कम mol के उच्च सांद्रता में ही मनाया जाता हैecular वजन खूंटी, यह सबसे अच्छा है सबसे कम खूंटी एकाग्रता कि विश्वसनीय patterning उत्पादन का उपयोग करें.

लगातार हमारे पिछली रिपोर्टों के साथ, हम निष्कर्ष निकाला है कि 5% PEG/6.4% DEX और 5% PEG/12.8% DEX सेल patterning के लिए अच्छी तरह से उपयुक्त थे 12.8% DEX उत्पादन अधिक समान पैटर्न के साथ. तीन patterning सेल का उपयोग प्रारूपों के लिए अपेक्षित परिणाम ट्रैकर लेबल HELA कोशिकाओं चित्रा 2 में दिखाया जाता है. प्रत्येक दृष्टिकोण patterning के बाद से, यह संभव है प्रत्येक प्रकार के समान पैटर्न नमूनों क्षेत्रों के बाहर बहुत कुछ कोशिकाओं के साथ बनाने के लिए.

अपवर्जन और द्वीप patterning का उपयोग यह संभव है कि प्रसार और नमूनों कोशिकाओं के प्रवास (3 चित्रा) का आकलन है. तीन दिनों के दौरान, HELA कोशिकाओं अपवर्जन क्षेत्र (3a-ग आंकड़े) भर दिया. द्वीप नमूनों कोशिकाओं प्रारंभिक पैटर्न आंकड़े (3 डी एफ) से जावक का विस्तार किया. इन परिवर्तनों का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैमानक imageJ माप उपकरण (आंकड़े 3 ग, च). यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि जब कई सेल आबादी सह सुसंस्कृत हैं (चित्रा 2, 3 प्रारूप), एक सेल की आबादी से बाहर पैदा करना सकता है और अन्य की जगह. बहिष्करण patterning और द्वीप patterning उपयोगी उपकरण का आकलन कर सकते हैं अगर यह एक समस्या हो जाएगी. स्थितियों में जहां प्रसार सूचकांक में नाटकीय मतभेद होते हैं, यह सिफारिश की है कि एक सेल आबादी विकिरण या रासायनिक कारकों के द्वारा इलाज किया जा अपनी प्रसार को सीमित करने के लिए. यह विशेष स्थितियों में, जहां एक कोशिका प्रकार एक धीमी बढ़ती और अधिक संवेदनशील सेल प्रकार के लिए एक समर्थन सेल के रूप में प्रयोग किया जाता है में उपयोगी है.

हम संवर्धन HepG2 कोशिकाओं, एक hepatocellular कार्सिनोमा सेल लाइन है कि आमतौर पर मॉडल hepatocyte जीव विज्ञान के NIH 3T3 fibroblast कि mitomycin सी (4 चित्रा) का उपयोग करते हुए गिरफ्तार किया गया था के साथ करने के लिए प्रयोग किया जाता है, के द्वारा इस सिद्धांत का प्रदर्शन किया. समय के साथ, HepG2 कोशिकाओं उनके स्थानीयकरण को बनाए रखनेघ कॉलोनी आकार (4a चित्रा). एक ही थाली में कई बूंदों रखने और उन्हें fibroblasts के साथ आसपास के द्वारा यह संभव है एक स्वरूप है कि संभावित मल्टिप्लेक्स अध्ययन (4b चित्रा) के लिए उपयोगी है में इन कोशिकाओं को विकसित करने के लिए. सेल द्वीप monocultures paracrine कारकों (चित्रा 4C) के प्रभाव के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस प्रारूप के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. बहुलक सांद्रता, जिस पर एक ATPS फार्म कर सकते हैं प्रयोगात्मक निर्धारित binodal घटता से extrapolated किया जा सकते हैं यह binodal वक्र बादल बिंदु विधि का उपयोग अतिरिक्त विलायक जोड़ने अंक जिस पर अलग / खूंटी DEX सांद्रता के दो चरण मिश्रण (बैंगनी को मापने के द्वारा बनवाया गया था. हलकों) कोई अब चरण separati की सक्षम थेएनजी. सीरम के साथ और बिना Binodals DMEM F12, और RPMI के लिए निर्धारित किया गया है. डेटा बिंदुओं एक तीन पैरामीटर तर्कसंगत समारोह के साथ लगाया गया था. = 3 एन प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए.

चित्रा 2
चित्रा 2. Polystyrene प्लेटों पर ATPS समाधान वितरण, सेल patterning के लिए तीन प्रारूपों उत्पादन प्रक्रिया DEX बूंदों) है कि तब खूंटी के साथ लेपित हैं) pipetting द्वारा शुरू होता है. एक बार कोशिकाओं देते हैं, ATPS समाधान दूर धोया जा सकता है और संस्कृति मध्यम (ग, घ) के साथ बदल दिया. Monocultures के लिए प्रतिदीप्ति छवियों patterning के बाद CellTracker रंजक के साथ दाग थे. सह संस्कृतियों के लिए, कोशिकाओं को अलग patterning पहले CellTracker रंगों के साथ दाग थे. HELA कोशिकाओं सभी तीन स्वरूपों संस्कृति पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया गया. चित्रा 3
चित्रा 3. बहिष्करण patterning और द्वीप patterning सेल प्रवास और प्रसार का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) बहिष्करण नमूनों HELA कोशिकाओं patterning के बाद 1 दिन ख) बहिष्करण नमूनों HELA कोशिकाओं patterning के बाद 3 दिन ग) कोशिकाओं को पैदा करना और प्रवास, काफी के आकार को कम अपवर्जन क्षेत्र घ) द्वीप नमूनों HeLa 1 दिन patterning के बाद ई) द्वीप नमूनों HELA कोशिकाओं patterning के बाद 3 दिन च) सेल कोशिकाओं पैदा करना और बाहर विस्थापित हो, काफी द्वीप के आकार का विस्तार. छवियाँ ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करने से पहले और बाद में प्रवास सेल समाशोधन और सेल द्वीप क्षेत्रों को मापने मात्रा निर्धारित थे. बार्स मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं± SEM कम से कम तीन स्वतंत्र टिप्पणियों की.

चित्रा 4
चित्रा 4. लिवर सेल / fibroblast संस्कृतियों ATPS अपवर्जन patterning सह संस्कृति का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है.) संस्कृति में कम से कम 4 दिनों के लिए इन कालोनियों उनके संगठन को बनाए रखने बी) क्या कई द्वीपों मल्टिप्लेक्स या उच्च throughput के लिए क्षमता के साथ एक ही थाली में तैनात किया जा सकता है. assays ग) गैर सह सुसंस्कृत द्वीप पैटर्न की तुलना में, सह संवर्धित कोशिकाओं albumin सह संस्कृतियों दाग monocultures बनाम गुणात्मक तुलना से स्पष्ट albumin उत्पादन के थोड़ा उच्च स्तर (भूरे रंग धुंधला हो जाना) के रूप में प्रदर्शित करते हैं. Albumin एक प्रोटीन जिगर की कोशिकाओं द्वारा उत्पादित है. इसलिए, इस परिणाम से पता चलता है कि जिगर की कोशिकाओं के समारोह में जब fibroblast ATPS का उपयोग कर के साथ सह सुसंस्कृत बढ़ाया है.

) एक पैटर्न का गठन 3.2% DEX 6.4% DEX DEX 12.8%
2.5% खूंटी x x x
खूंटी 5.0% एक्स / ✓
10.0% खूंटी एक्स / ✓
ख) आकृति विज्ञान 3.2% DEX 6.4% DEX DEX 12.8%
2.5% खूंटी
खूंटी 5.0% & # X2713;
10.0% खूंटी x x x
ग) सीरम वर्षा 3.2% DEX 6.4% DEX DEX 12.8%
2.5% खूंटी
खूंटी 5.0%
10.0% खूंटी x x x

तालिका 1) ATPS योगों कि patterning के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जांच के निशान, उन है कि एक्स के निशान से संकेत नहीं जा सकता द्वारा संकेत कर रहे हैं, ख) योगों कि सामान्य सेल आकारिकी और लगाव गुण को बनाए रखने का संकेत कर रहे हैं.y जांच के निशान, उन है कि एक्स के निशान से संकेत नहीं कर सकते हैं ग) योगों कि सीरम प्रोटीन की वर्षा में हुई एक्स के निशान से संकेत कर रहे हैं.

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Discussion

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ATPS सेल micropatterning विधि सेल कल्चर तकनीकों में प्रवीणता से परे बहुत कम विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है और जल्दी से महारत हासिल किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण का लाभ कर रहे हैं कि यह सस्ती है, तेजी से और सेल प्रकार और संस्कृति स्वरूपों की एक किस्म के साथ संगत है. इन कारणों के लिए, हमारे प्रोटोकॉल को आसानी से जीवन वैज्ञानिकों, विशेष रूप से उन जो सेल प्रसार, प्रवास और chemotaxis, और सेल आबादी के बीच juxtacrine और paracrine बातचीत के प्रभाव का अध्ययन द्वारा अपनाया जाना चाहिए. यहाँ प्रस्तुत assays आसानी से सेल की आबादी के स्तर पर मानक छवि विश्लेषण ImageJ के रूप में इस तरह के सॉफ्टवेयर में उपलब्ध प्रक्रियाओं का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.

लगातार पैटर्न उत्पन्न करने के लिए हम निम्नलिखित सावधानियां सलाह. सबसे पहले, पिपेट टिप DEX समाधान वितरित करने के लिए प्रयोग किया जाता के बाद प्रत्येक DEX छोटी बूंद और अधिक लगातार छोटी बूंद संस्करणों को उपलब्ध कराने के लिए जमा किया जाता है बदला जाना चाहिए. चूंकि DEX समाधान अपेक्षाकृत चिपचिपा है, यह भी अतिरिक्त DEX जमा कि विंदुक टिप की बाहरी सतह पर मौजूद हो सकता है और कि DEX रास्ते की पूरी मात्रा टिप सुनिश्चित हो सकता है से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. दूसरा, बूंदों अगर खूंटी बहुत तेजी से जोड़ा जाता है या अगर पकवान झुका हुआ है स्थानांतरित कर सकते हैं. DEX विघटन एक स्तर की सतह पर पकवान रखने और खूंटी समाधान धीरे - धीरे छोटी बूंद का हिस्सा हटाना खूंटी meniscus से बड़ी ताकतों की अनुमति के बिना करने के लिए ऊपर से बूंदों को कवर करने के लिए अनुमति देता है के द्वारा कम किया जा सकता है. छोटी बूंद व्यवधान बड़े DEX बूंदों के साथ अधिक बार होता है, इसलिए की बूंदों 0.5 μl या यदि संभव हो तो कम इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इन तकनीकी समाधान वितरण के साथ शामिल मुद्दों के अलावा, वहाँ बहुत कुछ इस तकनीक के साथ जुड़े नुकसान, बशर्ते कि उपयुक्त बहुलक आणविक भार और सांद्रता इस्तेमाल कर रहे हैं.

हालांकि ATPS patterning आसानी से हो सकता है एक micropipette (के रूप में यहाँ प्रस्तुत) का उपयोग किया जा सकता है, वहाँ अधिक sophi की एक किस्म हैsticated दृष्टिकोण है कि तेजी से और अधिक जटिल ज्यामितीय arrays (जैसे तरल से निपटने रोबोट और ध्वनिक छोटी बूंद इंजेक्शन) के पैटर्न उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में हमारे पिछले 14 अध्ययन, 15, 20 में प्रस्तुत किया जा रहा है. यह भी संभव है कि केशिका orifices के माध्यम से या एक microchannel में एक छिद्र actuating की ओर बहती है DEX खूंटी 19 द्वारा sheathed बूंदों का उत्पादन बहुत pneumatically बाहर खदेड़ना DEX द्वारा मात्रा में छोटे होते हैं DEX बूंदों उत्पन्न. इन तरीकों ब्याज की उच्च throughput या मल्टिप्लेक्स सह संस्कृति या प्रवास assays का उत्पादन करने की मांग करने वालों के लिए हो सकता है. इसके अलावा, microfluidic दृष्टिकोण का उपयोग कर, यह संभव है कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के साथ प्रयोग करते हैं, या एक microchannel जहां द्रव का प्रवाह और सरासर के प्रभाव की जांच की जा सकती में कोशिकाओं के साथ. हालांकि, इन उन्नत तरीकों सबसे अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक नहीं है.

कोशिकाओं के जलीय patterning दो चरण सरल और आसानी से एक ठेठ सेल के लिए अनुकूलित हैसंस्कृति की स्थापना. इस पद्धति का एक ठेठ सेल संस्कृति प्रयोगशाला (एक हुड के लिए उपयोग, सीओ 2 इनक्यूबेटर, और micropipettes) और reproducibly मोनोकल्चर और सह संस्कृति में पैटर्न कोशिकाओं को aforementioned पॉलिमर के उपयोग के साथ किसी भी शोधकर्ता की अनुमति देता है. हमारी प्रयोगशाला कोशिकाओं के arrays मुद्रण एक घाव भरने परख में सेल प्रवास का अध्ययन करने के लिए और भ्रूण कोशिकाओं 16, 17, 20 के भेदभाव में juxtacrine और paracrine संकेतन के प्रभाव की जांच द्वारा इस क्षमता का प्रदर्शन किया है. कोशिकी मैट्रिक्स 28, inkjet मुद्रण 29 microfluidic 25 उपकरणों में लामिना का प्रवाह और patterning patterning सहित अन्य तरीकों, 26 भी कोशिकाओं स्थानीय बनाना के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन अन्य तरीकों कोशिकाओं की अच्छी तरह से परिभाषित पैटर्न को प्राप्त करने के लिए प्रभावी दृष्टिकोण हैं और अक्सर एकल कोशिका परिशुद्धता प्राप्त कर सकते हैं. हालांकि, इन तरीकों में भी उच्च विशेष उपकरण और या cleanroom सुविधाओं के लिए उपयोग / जनसंपर्क करने के लिए इस्तेमाल किया टिकटों निर्माण करने की आवश्यकता हैint कोशिकी मैट्रिक्स प्रोटीन या microfluidics उपकरणों का उत्पादन. उनकी बिजली की आपूर्ति, सिरिंज पंप, और अन्य बाह्य घटकों कनेक्शन भी अपने उपकरण और उपयोगकर्ता इसे संचालित करने के लिए आवश्यक कौशल के साथ जुड़े लागत की वजह से कार्यान्वयन hinders.

भविष्य के आवेदनों के मामले में हम उम्मीद करते हैं कि हमारे विधि संस्कृति प्रणालियों कि सेल आंदोलन और प्रसार का विश्लेषण उच्च throughput, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सक्षम की जांच कई सेल आबादी के बीच सेल सेल बातचीत के विकास के लिए उपयोगी हो जाएगा. इस बिंदु पर, हमारी रिपोर्टों केवल एक ही बार में नमूनों कोशिकाओं के कुछ प्रकार की बातचीत की जांच पर ध्यान केंद्रित किया है. हालांकि, यह कल्पना है कि कोशिकाओं के कई subpopulations कई सेल एक एकल सेल संस्कृति सेटअप में एक साथ हो प्रकार के paracrine और juxtacrine संकेतन के प्रभाव की जांच के लिए एक आम फीडर परत के साथ संवर्धित किया जा सकता है. अंत में, ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों अक्सर आवश्यक स्थानिक स्थानीयकरणएक या एक से अधिक सेल प्रकार. यह संभव हो सकता patterning कोशिकाओं में उपयोग करने के लिए हमारी तकनीक अनुकूलित क्रम में अधिक physiologically प्रासंगिक ऊतक इंजीनियर रोग मॉडल का उत्पादन या नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए implantable सामग्री पर पैटर्न कोशिकाओं के लिए हो सकता है.

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Disclosures

लेखक कोई वित्तीय हितों की होड़ है.

Acknowledgments

Jbw के लिए: यह काम कल्टर फाउंडेशन, Beyster फाउंडेशन, अंडर ग्रेजुएट रिसर्च (UROP) अवसर ATA और एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट छात्र रिसर्च फैलोशिप (2010101926 आईडी अनुदान नहीं डीजीई 0718128) के लिए ग्रीष्मकालीन कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran 500,000 kDa Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3 ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM Gibco, Carlsbad, CA
RPMI Gibco, Carlsbad, CA
F12 Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum Gibco, Carlsbad, CA

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सेल सह संस्कृति जलीय दो चरण सिस्टम का उपयोग कर Patterning
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Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems. J. Vis. Exp. (73), e50304, doi:10.3791/50304 (2013).More

Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems. J. Vis. Exp. (73), e50304, doi:10.3791/50304 (2013).

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