Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

خلية المشارك الثقافة الزخرفة باستخدام مائي مرحلتين أنظمة

doi: 10.3791/50304 Published: March 26, 2013

Summary

واستخدمت مائي مرحلتين نظم للسكان في وقت واحد نمط متعددة من الخلايا. هذه طريقة سريعة وسهلة للخلية الزخرفة يستفيد من فصل مرحلة من المحاليل المائية للجلايكول والبولي ايثيلين ديكستران والتوتر السطحي القائمة بين حلول البوليمر اثنين.

Abstract

سوف تكون هناك حاجة التكنولوجيات الزخرفة الخلية التي هي سريعة وسهلة الاستخدام وبأسعار معقولة للتنمية المستقبلية للفحوصات عالية الإنتاجية الخلية، ومنصات لدراسة الخلية خلايا الأنسجة التفاعلات ونظم الهندسة. يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لتوليد المشترك الثقافات من الخلايا باستخدام حلول حيويا من ديكستران (DEX) والبولي اثيلين جليكول (PEG) أن التخلص منفصلة عند دمجها أعلاه تركيزات العتبة. ويمكن نمط الخلايا في مجموعة متنوعة من التشكيلات باستخدام هذا الأسلوب. لا يمكن أن يؤديها الخلية الزخرفة الاستبعاد عن طريق طباعة قطرات من DEX على ركيزة وتغطيتها بمحلول مكون من خلايا تحتوي على PEG. التوتر السطحي شكلت بين حلول البوليمر سببين الخلايا في الانخفاض في جميع أنحاء خارج الحبرية DEX وتشكيل المقاصة دائرية التي يمكن استخدامها لفحوصات الهجرة. يمكن منقوشة جزر خلية الاستغناء مرحلة DEX الخلية الغنية في حل PEG أو من خلال تغطية DEXالقطرة بمحلول مكون من PEG. يمكن أن تتكون شارك في الثقافات مباشرة من خلال الجمع بين الخلايا مع استبعاد الزخرفة الجزيرة DEX. هذه الأساليب متوافقة مع مجموعة متنوعة من النهج التعامل مع السائل، بما في ذلك micropipetting دليل، ويمكن استخدامها مع أي نوع من الخلايا تقريبا ملتصقة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مائي على مرحلتين نظم (ATPSs) شكل عند خلط الحلول اثنين من البوليمرات غير متوافقة معا في تركيزات عالية بما فيه الكفاية. ويتأثر فصل المرحلة عن طريق مجموعة متنوعة من العوامل التي تشمل الوزن الجزيئي وقطبية من البوليمرات، ودرجة الحرارة من درجة الحموضة والحلول والمحتوى الأيونية من المذيب المائي 1 و 2. النقطة التي يتم تحديد حلين البوليمر منفصلة من الخصائص الفيزيوكيميائية لنظام اختيار المرحلة، ولكن يحدث عادة على تركيزات منخفضة البوليمر (أقل من 20٪ بالوزن / WT) في ظل ظروف غير يبدل طبيعة، السماح باستخدام التكنولوجيا الحيوية لATPSs تطبيقات 3-9.

حتى الآن على نطاق واسع الأكثر دراسة ATPS هو البولي ايثيلين جلايكول (PEG) / ديكستران النظام (DEX). وقد وصفت في الأصل ATPS التي شكلتها هذه البوليمرات غير مكلفة وحيويا لتنقية الجزيئات الحيوية عن طريق تقسيم الجزيئية 2 و 10. تقسيميحدث عند خلط جزيئات إضافية أو الجزيئات التي لا تساهم في النظام مع المرحلة PEG وDEX. على أساس الانتماءات النسبية لأي DEX أو PEG، فإن الجزيئات أو الجسيمات الموجودة تفضيلي ضمن واحدة من المرحلتين أو في الواجهة. خاصية أخرى من ATPS PEG / DEX هو وجود التوتر السطحي بين مراحل البوليمر اثنين. ATPSs التي شكلتها PEG وDEX عرض التوترات عموما بينية التي هي أقل بكثير من غيرها من نظم على مرحلتين بين السوائل مثل النفط والمياه، إلا أن القوات لا تزال تمارس التوتر السطحي على آثار جزيئات صغيرة مثل الفيروسات والخلايا والمجاميع البروتين 2 ، 11-13. وأخيرا، منذ ارتفاع الوزن الجزيئي وPEG DEX منفصلة في تركيزات منخفضة (أقل من 5٪ بالوزن / WT عالية الوزن الجزيئي البوليمرات أصناف) في وجود تركيزات الفسيولوجية للأملاح، هناك عدد قليل إذا أي آثار ضارة على خلايا الثدييات أدرجت ضمن هذه نظم14-16.

مؤخرا، تم تطبيق خصائص وتأثيرات بينية من تقسيم ATPSs من مختبرنا للتنميط خلية 14، 16-20. وتم ذلك عن طريق حل micropatterning DEX أكثر كثافة على ركائز ثقافة الخلية في وجود PEG. عندما تدمج الخلايا في مرحلة PEG، فهن مستبعدات من دخول قطرات DEX بسبب PEG / DEX التوتر السطحي 20. عندما يتم منقوشة الخلايا في مرحلة التنفيذ المباشر، يتم الاحتفاظ بها على سطح الخلية الركيزة الثقافة عن طريق تقسيم التوتر السطحي و16، 17، 19.

وعلى النقيض من الأساليب الأخرى لخلية الزخرفة، الزخرفة ATPS خلية من السهل تعلم، ويتطلب فقط معرفة أولية حول البوليمرات أنفسهم، والقدرة على أداء زراعة الخلايا واستخدام micropipettor. أساليب أخرى للتنميط الخلية غالبا ما تنطوي على المعدات المتخصصة والتدريب التي لا تترجم بسهولة إلى اله علوم الحياة. على سبيل المثال، بعض الطرق (microcontact الطباعة النافثة للحبر الطباعة أو) الخلايا بشكل غير مباشر من خلال تطبيق نمط أنماط الجزيئات الحيوية لاصقة خلية إلى الركيزة التي تخدم الثقافة فيما بعد مواقع لمرفق الخلية 21 و 22. على الرغم من النهج غير المباشرة مفيدة لبعض أنواع الخلايا، فإنها تتطلب درجة عالية من المهارة المستخدم والمعدات المتخصصة لصنع أداة الزخرفة، ويمكن أن تفتقر خصوصية تبعا لنمط معين نوع / جزيء حيوي الخلية. بدلا من ذلك، يتم إيداع الخلايا مع خصوصية عالية عن طريق نمط من النهج الزخرفة المباشرة التي تشمل تدفق الصفحي الزخرفة، الطباعة بالستينسيل والطباعة النافثة للحبر 23-26. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات تتطلب أيضا خبرة المستخدم والمعدات المتخصصة، ويمكن أن يتلف الخلايا أثناء عملية الطباعة. على الرغم من أن هذه المناهج عموما إنتاج أنماط دقيقة من الخلايا، على سبيل الزخرفة الخلية إلى أن تكون أداة مفيدة في علوم الحياة، يجب أن يكون فعالة من حيث التكلفة لبسيطة لتنفيذ الثانية.

نحن هنا تقرير مفصل بروتوكول لتوليد نمط مزارع الخلايا باستخدام ATPSs وصفها في تطبيقاتنا التي صدرت سابقا. باستخدام micropipettors فقط، يمكن للمستخدمين إنشاء مناطق الحظر الخلية أو الخلايا الجزر لفحوصات الهجرة. ويتحقق هذا عن طريق PEG / DEX التوتر السطحي أن يحتفظ إما الخلايا في مرحلة التنفيذ المباشر أو يستثني الخلايا المودعة في المرحلة PEG من DEX. من هذه تمشيط اثنين من التقنيات الأساسية الزخرفة، فمن الممكن لتوليد بسرعة شارك في الثقافات من الخلايا مثل الخلايا الليفية الخلايا الكبد شارك في الثقافات. أساليب الزخرفة وصفها، ATPS المعلمات والنتائج المتوقعة بالتفصيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. المرحلة توصيف النظام: تحديد عتبات للفصل المرحلة

  1. إعداد محاليل تحتوي على PEG وDEX في المخزن المؤقت المطلوب أو خلية ثقافة المتوسط ​​كما هو موضح في الشكل 1 (النقاط البنفسجية) في 15 مل أو 50 مل المخروطية أنابيب. الآخرة، وسوف PEG وDEX الرجوع إلى PEG كيلو دالتون 35 و 500 كيلو دالتون DEX، ومع ذلك، سوف تتغير تركيزات الحرجة اعتمادا على البوليمرات اللتين استخدمتا. تسجيل كتلة PEG وDEX في كل حل. قد عالية التركيز حلول البوليمر يستغرق عدة ساعات ليذوب. ويمكن استخدام المصل لVortexing خالية الحلول. وسائل الإعلام التي تحتوي على البروتينات أو مصل، ضع الأنابيب في مرحلة تعصف حتى يتم حل كل البوليمرات بشكل كامل. سجل وزن وسائل الإعلام المستخدمة لإذابة البوليمرات وتحيط علما تركيزات الأولي.
  2. مرة واحدة يتم حل الكامل للبوليمرات، ينبغي أن تظهر حلول غائم. هذا هو أول إشارة إلى أن فصل المرحلة حدث. لتأكيد هذا، والسماح للالبوليمر حلول للراحة في وضع عمودي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ويمكن استخدام الطرد المركزي في 1000 x ج لتسريع عملية فصل المرحلة. سوف يكون أكثر كثافة مرحلة القاع DEX الغنية والمرحلة الأعلى سيكون PEG الغنية.
  3. إضافة ببطء عازلة إضافية أو وسائل الإعلام إلى الأنابيب. وينبغي أن تستخدم زيادات صغيرة حتى لا يقفز نقطة فصل المرحلة.
  4. عندما يصبح واضحا الحل لم يعد والتخلص يفصل بعد الطرد المركزي، تم الوصول إلى عتبة مرحلة الانفصال. تسجيل الوزن النهائي من الأنبوب.
  5. باستخدام الأوزان السابقة المسجلة للبوليمرات، جنبا إلى جنب مع الوزن النهائي بعد إضافة وسائل الإعلام، وتحديد وزن٪ / وزن كل البوليمرات التي اثنين من فصل المرحلة لن يحدث.
  6. رسم هذه القيم كما PEG WT / WT٪ على DEX WT / WT المحور ص و٪ على المحور س. ويمكن استخدام هذه المؤامرة، والمعروفة باسم منحنى binodal، لتحديد عتبة التركيز لفصل المرحلة لconcentrati مختلفةإضافات من PEG / DEX في وسط الخلية ثقافة محددة.

2. التكوين 1: زخرفة استبعاد (96 لوحة جيدا تنسيق)

  1. إعداد الحلول منفصلة من 5.0٪ بالوزن / WT PEG و12.8٪ بالوزن DEX / WT في مستنبت الخلية. ATPS استخدام الحلول من وجهة نظر على الأقل مرتين الحرجة لضمان أن يظل ATPS بعد البوليمرات تتوازن مع الاحترام لبعضهما البعض. هناك كمية صغيرة من تدفق DEX في المرحلة PEG الغنية والعكس بالعكس، لذلك، والعمل أيضا بالقرب من تركيز الحرجة يمكن أن يؤدي إلى فقدان النظام وانخفاض تركيزات المرحلة أدناه نقطة حرجة. وبالمثل، يمكن نقل الطبق الثقافة الخلية الحاضنة إلى الرطوبة ودرجة الحرارة التي تسيطر عليها تغيير خصائص مرحلتين وجعل الحلين غير قابلة للامتزاج. ملاحظة: بعض الخلايا قد تؤدي بشكل أفضل مع تركيبات ATPS أخرى. ويمكن اختيار الصيغ مقبولة على أساس منحنيات binodal تحديدها من الجزء 1.
  2. حصاد الخلايا لاستخدامها في patte الاستبعادrning. تحديد العدد الإجمالي / تركيز الخلايا المتاحة. اختياري: تسمية الخلايا مع CellTracker أو غيرها من التسميات غير السامة للخلايا للفحص المجهري مضان.
  3. بيليه الخلايا و resuspend بيليه في حجم مناسب من 5.0٪ الوتد لتحقيق الرقم المطلوب من الخلايا للاستبعاد. على سبيل المثال، واحدة من لوحة جيدا 96-جيدا يتطلب أن يكون معلق الخلايا الليفية 37500 في 200 ميكرولتر من PEG لإنتاج التقاء في اليوم التالي. توسيع نطاق هذه الأرقام بما يتناسب مع أنواع الخلايا الأخرى والأحجام الركيزة الثقافة.
  4. باستخدام micropipettor، الاستغناء 0،5 ميكرولتر من قطرات DEX على ركيزة الثقافة الخلية الجافة. قطرات أكبر حجم إنتاج أكبر مناطق الاستبعاد. ويوصى قطرات تتراوح في حجمها 0،1 حتي 1 ميكرولتر لmicropatterning الاستبعاد. اختياري: يمكن إيداع قطرات DEX 24 ساعة قبل الموعد المحدد ويسمح لليذوى في درجة حرارة الغرفة. وهذا يمكن أن تنتج أنماط أنظف.
  5. 200 ميكرولتر من الاستغناء تعليق الخلية إلى PEG روأشار إلى أن تغطية قطرات DEX.
  6. مكان في الحاضنة لمدة 12 ساعة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. تأكد من أن لا يميل الطبق أثناء التداول والتي يتم وضعها على الرف حاضنة مستوى لتفادي تعطيل الأنماط.
  7. إزالة الحل PEG ويغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من ثقافة المتوسط.
  8. إضافة جديدة متوسطة الثقافة والعودة إلى الحاضنة.
  9. رصد الثقافات دوري لمراقبة حركة الخلية في منطقة الحظر.

3. التكوين 2: زخرفة جزيرة (96 لوحة جيدا تنسيق)

  1. إعداد الحلول من 5.0٪ بالوزن / WT PEG و12.8٪ بالوزن DEX / WT في مستنبت الخلية، على النحو الوارد أعلاه.
  2. حصاد الخلايا لاستخدامها في الزخرفة الجزيرة. تحديد العدد الإجمالي / تركيز الخلايا المتاحة.
  3. بيليه و resuspend الخلايا في وحدة تخزين مناسبة من DEX 12.8٪ لتحقيق التركيز المطلوب من الخلايا لتنميط الجزيرة. تركيزات من 5،000 مويوصى LLS / ميكرولتر أو أقل لأنواع الخلايا الملتصقة بقوة. قد لاعتبار الخلايا التي يجدون صعوبة في إرفاق أو الخلايا التي تلتزم فضفاضة، تركيزات تصل إلى 10،000 خلية / ميكرولتر.
  4. العمل بسرعة لتجنب التجفيف، ماصة قطرات 0،5 ميكرولتر من DEX على ركيزة الثقافة الخلية الجافة، كما هو موضح أعلاه. لا تسمح قطرات لتجف. اختياري: يمكن إضافة 200 ميكرولتر من محلول PEG إلى البئر في وقت مبكر. ويمكن بعد ذلك قطرات DEX تودع في حل PEG حيث أنها سوف تنزل الى القاع والاتصال سطح الثقافة. وهذا يمكن أن تنتج أنماط أنظف الجزيرة.
  5. تغطية قطرات DEX مع 200 ميكرولتر من PEG.
  6. مكان في الحاضنة لمدة 12 ساعة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. تأكد من أن لا يميل الطبق أثناء التداول والتي يتم وضعها على الرف حاضنة مستوى لتفادي تعطيل الأنماط.
  7. إزالة الحل PEG ويغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من ثقافة المتوسط.
  8. إضافة ثقافة جديدةالمتوسطة والعودة إلى الحاضنة.
  9. رصد الثقافات دوري لمراقبة حركة الخلايا وانتشار الخارج من الجزر.

4. تكوين 3: استبعاد المشارك الثقافات (96 لوحة جيدا تنسيق)

  1. إعداد الحلول من 5.0٪ بالوزن / WT PEG و12.8٪ بالوزن DEX / WT في مستنبت الخلية، على النحو الوارد أعلاه.
  2. حصاد الخلايا لاستخدامها في الزخرفة الإقصاء والجزيرة. تحديد العدد الإجمالي / تركيز الخلايا المتوفرة لكل نوع من الخلايا. اختياري: بعض أزواج الخلية قد يعرض مؤشرات انتشار مختلفة بشكل كبير. لمنع خلايا استبعادها من overpopulating على نمط الخلايا الجزيرة (وخاصة بالنسبة للثقافات على المدى الطويل)، وعلاج الخلايا المستخدمة لاستبعاد مع C لمدة 2 ساعة ميتوميسين أو أشرق لهم قبل الحصاد. وهذا منع الانتشار. ويمكن استخدام الأصباغ الفلورية CellTracker للتمييز بين السكان اثنين من خلية إذا لزم الأمر.
  3. بيليه الخلايا و resuspend بيليه لexclusioن الزخرفة في حجم مناسب لPEG 5.0٪ لتحقيق الرقم المطلوب من الخلايا، على النحو الوارد أعلاه. إعادة تعليق بيليه لجزيرة الزخرفة في حجم مناسب لDEX 12.8٪ لتحقيق التركيز المطلوب من الخلايا، على النحو الوارد أعلاه.
  4. باستخدام micropipettor، الاستغناء 0،5 ميكرولتر من قطرات التعليق الخلية DEX على ركيزة الثقافة الخلية الجافة. لا تسمح قطرات لتجف.
  5. تغطية قطرات DEX مع 200 ميكرولتر من تعليق الخلية PEG.
  6. مكان في الحاضنة لمدة 12 ساعة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. تأكد من أن لا يميل الطبق أثناء التداول والتي يتم وضعها على الرف حاضنة مستوى لتفادي تعطيل الأنماط.
  7. إزالة الحل PEG ويغسل ثلاث مرات في 200 ميكرولتر من ثقافة المتوسط.
  8. إضافة جديدة متوسطة الثقافة والعودة إلى الحاضنة.
  9. رصد شارك في الثقافات لمراقبة التفاعل بين السكان الخلية. يمكن إعداد الضوابط قبل تنفيذ استبعاد أو فردي الجزيرة الزخرفة: اختياريidually، من خلال المشاركة في الثقافة الخلايا التي لا تتفاعل أو عن طريق منع المسارات التاريخية في السكان خلية واحدة أو كليهما قبل أو بعد الزخرفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لتحديد توليفة مناسبة من PEG والزخرفة DEX لخلية من المهم لتحديد منحنى binodal. هذا المنحنى يحدد النقاط التي يمكن أن تشكل على ATPS ويمكن أن تختلف لمجموعة معينة من البوليمرات على أساس درجة الحموضة، ودرجة الحرارة والمحتوى الأيونية. زراعة للخلايا التي تتطلب تركيبات مخصصة المتوسطة قد يكون من الضروري لتحديد منحنى binodal تجريبيا. يتم ذلك عن طريق توليد سلسلة من ATPSs التي هي بعيدة عن binodal ومتفاوتة في PEG ومحتويات DEX (الشكل 1، والدوائر البنفسجية). عندما ATPS هو الحاضر، فإن حلول البوليمر تظهر عند مزجه غائم وسوف تتوازن إلى مراحل منفصلة إذا تركت دون عائق. عن طريق إضافة المذيبات إضافية إلى خليط البوليمر، فإن نهج ATPS PEG 0٪ / DEX 0٪. في مرحلة ما، فإن خليط لم تعد مرحلة منفصلة. تركيز PEG / DEX الذي يحدث هذا يمثل نقطة على منحنى binodal؛ فوق هذه النقطة لATيمكن تشكيل PS وتحت هذه النقطة ما في وسعها لا. منحنيات في الشكل 1 يمثل binodals لمدة ثلاث مشتركة مع وسائل الإعلام خلية ثقافة ودون مصل بقري جنيني 10٪ (FBS). تركيزات التي يتم تشكيل ATPS أعلى قليلا في وجود FBS.

في تقاريرنا السابقة، استخدمنا ATPSs استنادا إلى نقطة حرجة (نقطة على binodal الذي أحجام متساوية من حيث الشكل وPEG DEX بعد موازنة) من 2.5٪ PEG 35٪ kDa/3.2 DEX 500 كيلو دالتون. النتائج من البيانات المتوفرة لدينا هي binodal على مقربة من هذه القيمة نقطة حرجة. نحن اختبار تركيبات النظام للمرحلة 9 الزخرفة، كما هو مبين في الجدول 1. منذ حلول نقية من PEG وDEX تتوازن فيما يتعلق تركيزات البوليمر لهم بعد دمجهما، فإن بعض من هذه الحلول لا تشكل ATPSs مستقرة، وبالتالي كانت غير مفيدة للتنميط (الجدول 1A، علامات X). أنتجت مجموعات أخرى البوليمر أنماط التعرف، ولكنها لم تكن كافية للتجريب موحدة (الجدول 1A X / ✓ علامات). شكلت مفيدة تركيبات البوليمر مناطق الاستبعاد أو الجزر التي كانت خالية تقريبا من الخلايا في مناطق غير منقوشة (الجدول 1A، ✓ علامات).

مع PEG 10٪، لاحظنا أن شكل الخلية بشكل غير طبيعي وكان الجولة المغزل مثل بعد 24 ساعة، مع عرض الخلايا تقلصت قدرتهم على نعلق على سطح الثقافة (1B الطاولة، علامات X). ومورفولوجيا والتعلق الطبيعي 2.5٪ وPEG 5٪ (1B الطاولة، ✓ علامات). لاحظنا أن المصل عجلت من ثقافة المتوسط ​​بتركيزات عالية PEG (الجدول 1C، علامات X)، مما يوحي بأن قد تكون ذات صلة غير طبيعية مورفولوجيا الخلايا ومرفق في PEG 10٪ لمشاكل مع وصول المصل. بالإضافة إلى ذلك، ومن المعروف PEG لتعطيل أغشية البلازما 27. على الرغم من أن هذه الآثار لوحظ فقط في تركيزات عالية من مول منخفضةecular PEG الوزن، فمن الأفضل استخدام أقل تركيز PEG التي تنتج الزخرفة موثوق بها.

خلصنا بما يتفق مع تقاريرنا السابقة، التي كانت مناسبة تماما 5٪ PEG/6.4٪ و 5٪ DEX PEG/12.8٪ لتنميط DEX الخلية، ب 12.8٪ DEX إنتاج أنماط أكثر اتساقا. النتائج المتوقعة لصيغ الزخرفة الثلاث باستخدام خلية وتظهر المقتفي التي تحمل علامات خلايا هيلا في الشكل 2. باتباع نهج كل الزخرفة، فمن الممكن لخلق أنماط موحدة من كل نوع، مع عدد قليل جدا من الخلايا خارج المناطق منقوشة.

باستخدام الإقصاء والزخرفة الجزيرة أنه من الممكن لتقييم انتشار وهجرة الخلايا منقوشة (الشكل 3). على مدى ثلاثة أيام، وشغل خلايا هيلا مناطق الحظر (أرقام 3A-C). توسيع الجزيرة نقوش الخلايا إلى الخارج من أنماط الأولية (أرقام 3D-F). ويمكن استخدام هذه التغيرات كميامعيار يماغيج أدوات القياس (أرقام 3 ج، و). من المهم أن نلاحظ أنه عندما السكان الخلية متعددة مثقف شارك في (الشكل 2، الصيغة 3)، والسكان الخلية قد تتكاثر خارج واستبدال أخرى. يمكن الزخرفة الإقصاء والزخرفة الجزيرة أن تكون أدوات مفيدة لتقييم ما إذا كان هذا سوف يكون مشكلة. في الحالات التي يكون فيها الفارق الضخم في مؤشر انتشار تحدث، فمن المستحسن أن يعامل من قبل قسم من السكان الخلية العوامل الكيميائية أو الإشعاعية للحد من انتشارها. هذا هو مفيد في حالات معينة حيث يتم استخدام نوع واحد خلية خلية ودعم أبطأ من النمو نوع من الخلايا أكثر حساسية.

أثبتنا هذا المبدأ من قبل خلايا HepG2 زراعة، خلية سرطان الخلايا الكبدية خط يستخدم عادة لعلم الأحياء نموذج الكبدية، مع الخلايا الليفية 3T3 المعاهد الوطنية للصحة انه تم القبض على استخدام ميتوميسين C (الشكل 4). مع مرور الوقت، والحفاظ على خلايا HepG2 الترجمة الخاصة بهم علىد شكل مستعمرة (الشكل 4A). عن طريق وضع قطرات كثيرة في نفس الصفيحة المحيطة بهم ومع الخلايا الليفية فمن الممكن أن تنمو هذه الخلايا في شكل يمكن أن يكون مفيدا للدراسات المضاعفة المحتملة (الشكل 4B). ويمكن استخدام الخلايا الزراعات الأحادية الجزيرة مع هذا الشكل كعنصر تحكم لتأثير عوامل نظير الصماوي (الشكل 4C).

الشكل 1
الشكل 1. ويمكن استقراء تركيزات البوليمر التي يمكن أن تشكل على ATPS من منحنيات binodal تحديد تجريبيا. شيد هذا المنحنى binodal باستخدام طريقة السحب عن طريق إضافة نقطة إضافية المذيبات لقياس النقاط التي مرحلتين خليط من تركيزات PEG / DEX متفاوتة (الأرجواني الدوائر) لم تعد قادرة على separati المرحلةنانوغرام. تم تحديد Binodals لDMEM، F12 وRPMI مع وبدون المصل. تم تركيب نقاط البيانات مع وظيفة عقلانية 3 المعلمة. N = 3 لكل نقطة بيانات.

الشكل 2
الشكل 2. من الاستغناء حلول ATPS على لوحات البوليسترين، يمكن إنتاج ثلاثة أشكال الزخرفة لخلية. الإجراء يبدأ pipetting قطرات DEX أ) أن والمغلفة ثم مع ب PEG). مرة واحدة في خلايا إرفاق، يمكن غسلها الحلول ATPS بعيدا والاستعاضة عنها مستنبت (ج، د). كانت ملطخة الصور مضان لالزراعات الأحادية مع الأصباغ CellTracker بعد الزخرفة. للثقافات المشتركة، كانت ملطخة الخلايا بشكل منفصل مع الأصباغ CellTracker قبل الزخرفة. واستخدمت خلايا هيلا لتوليد جميع أشكال الثقافة الثلاثة. الشكل 3
الشكل 3. ويمكن استخدام الزخرفة الإقصاء والزخرفة الجزيرة لتقييم الهجرة الخلية والانتشار. استبعاد) منقوشة خلايا هيلا 1 يوم بعد الزخرفة. ب) استبعاد منقوشة خلايا هيلا 3 أيام بعد الزخرفة. ج) خلايا تتكاثر وتهاجر، والحد بشكل كبير من حجم منطقة الحظر. د) جزيرة نقوش خلايا هيلا 1 يوم بعد الزخرفة. ه) جزيرة نقوش خلايا هيلا 3 أيام بعد الزخرفة. و) خلايا تتكاثر وتهاجر إلى الخارج، وتوسيع كبير في حجم الجزيرة. وتم قياس كمية الصور باستخدام يماغيج برامج لقياس المقاصة خلية خلية والمناطق الجزيرة قبل وبعد الهجرة. تمثل القضبان يعني± SEM ما لا يقل عن ثلاث ملاحظات مستقلة.

الشكل 4
الشكل 4. يمكن أن تتولد خلايا الكبد / ثقافات الخلايا الليفية باستخدام ATPS استبعاد المشارك الثقافة الزخرفة. أ) الحفاظ على هذه المستعمرات لمنظمتهم 4 أيام على الأقل في الثقافة. ب) يمكن المحتشدة جزر متعددة في صحن واحد مع إمكانية المضاعفة أو عالية الإنتاجية، المقايسات. ج) بالمقارنة مع أنماط الجزيرة غير مثقف شارك في والخلايا المستزرعة شارك في عرض مستويات أعلى قليلا من إنتاج الألبومين (تلطيخ البني) كما يتضح من المقارنة النوعية من الألبومين الملون شارك في الثقافات مقابل الزراعات الأحادية. الزلال هو بروتين تنتجه خلايا الكبد. لذلك، هذه النتيجة تشير إلى أن يتم تحسين وظيفة خلايا الكبد عندما شارك في تربيتها مع الخلايا الليفية باستخدام ATPS.

أ) شكلت نمط DEX 3.2٪ DEX 6.4٪ DEX 12.8٪
PEG 2.5٪ X X X
PEG 5.0٪ X / ✓
PEG 10.0٪ X / ✓
ب) علم الصرف DEX 3.2٪ DEX 6.4٪ DEX 12.8٪
PEG 2.5٪
PEG 5.0٪ X & #2713؛
PEG 10.0٪ X X X
ج) مصل الأمطار DEX 3.2٪ DEX 6.4٪ DEX 12.8٪
PEG 2.5٪
PEG 5.0٪
PEG 10.0٪ X X X

الجدول 1. يشار إلى أ) تركيبات ATPS التي يمكن استخدامها لتنميط من علامات الاختيار، وتلك التي لا يمكن بالرمز علامات X ب) يشار إلى المستحضرات الطبيعية التي تحتفظ شكل الخلية وخصائص المرفق بيشار إلى علامات الاختيار Y، تلك التي لا يمكن بالرمز علامات X ج) المستحضرات التي أدت إلى ترسيب بروتينات مصل من علامات X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وmicropatterning الخلية ATPS الأسلوب يتطلب القليل جدا من الخبرة وراء الكفاءة في تقنيات زراعة الخلايا ويمكن أن يتقن بسرعة. مزايا هذا النهج هي أن أنها غير مكلفة وسريعة ومتوافقة مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا وصيغ الثقافة. لهذه الأسباب، ينبغي لنا اعتمد بروتوكول بسهولة من قبل علماء الحياة، وخاصة أولئك الذين يدرسون تكاثر الخلايا، والهجرة والكيميائي، وتأثير التفاعلات juxtacrine ونظير الصماوي بين السكان الخلية. ويمكن للفحوصات المقدمة هنا كميا بسهولة في الخلية مستوى السكان باستخدام معيار إجراءات تحليل الصور المتاحة في مجال البرمجيات مثل يماغيج.

لتوليد الأنماط الثابتة فإننا ننصح الاحتياطات التالية. أولا، يجب تغيير غيض ماصة تستخدم لصرف DEX حل بعد كل قطرة يترسب DEX لتوفير كميات الحبرية أكثر اتساقا. منذ حل DEX هو لزج نسبيا، فمن المهم أيضا تجنب إيداع DEX الزائدة التي قد تكون موجودة على السطح الخارجي للتلميح ماصة وضمان وحدة التخزين بالكامل من مخارج طرف DEX. الثانية، يمكن أن تحرك قطرات إذا تم إضافة PEG بقوة جدا أو إذا كان يميل الطبق. يمكن التقليل من انقطاع DEX عن طريق الحفاظ على طبق على سطح مستو والسماح الحل PEG لتغطية تدريجيا قطرات من فوق دون السماح قوات كبيرة من الغضروف المفصلي PEG لطرد جزء من الحبرية. تعطل الحبرية تحدث بشكل متكرر أكثر مع قطرات كبيرة DEX، لذلك قطرات من 0.5 ميكروليتر أو أقل ينبغي أن تستخدم إذا كان ذلك ممكنا. وبصرف النظر عن هذه المسائل التقنية ذات الصلة مع الاستغناء الحلول، وهناك عدد قليل جدا من المزالق المرتبطة مع هذه التقنية، شريطة أن تستخدم الأوزان المناسبة البوليمر الجزيئية وتركيزات.

على الرغم من إمكانية إجراء ATPS الزخرفة بسهولة باستخدام micropipette (كما وردت هنا)، وهناك مجموعة متنوعة من أكثر sophiالنهج sticated التي يمكن استخدامها لتوليد أنماط بسرعة أكثر صفائف هندسية معقدة (مثل الروبوتات التعامل مع السائل والصوتية طرد قطرات)، كما وردت في دراساتنا السابقة 14 و 15 و 20. ومن الممكن أيضا لتوليد قطرات DEX التي هي أصغر بكثير في الحجم من إخراج DEX هوائيا من خلال فتحات الشعرية أو من خلال تشغيل وفتحة متناهية في تدفق لإنتاج قطرات من DEX مغمد PEG 19. قد تكون هذه الأساليب تكون ذات فائدة لأولئك الذين يسعون لانتاج عالية الإنتاجية المضاعفة أو المقايسات شارك في الثقافة أو الهجرة. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام نهج ميكروفلويديك، فمن الممكن لأداء التجارب مع أعداد صغيرة من الخلايا، أو مع الخلايا في متناهية حيث يمكن فحص آثار تدفق السوائل ومحض. ومع ذلك، لا يطلب من هذه الأساليب المتقدمة لمعظم التطبيقات.

مائي على مرحلتين الزخرفة من الخلايا بسيطة وتتكيف بسهولة مع خلية نموذجيةالإعداد الثقافة. هذا الأسلوب يسمح لأي باحث الوصول إلى مختبر خلية ثقافة نموذجية (الحصول على غطاء محرك السيارة، CO حاضنة وmicropipettes) والبوليمرات المذكورة أعلاه إلى الخلايا الأحادية في نمط بتكاثر وشارك الثقافة. وقد أثبتت هذه القدرة مختبرنا عن طريق طباعة صفائف من الخلايا لدراسة الهجرة خلية في الجرح الشفاء فحص ودراسة الآثار المترتبة على إشارات juxtacrine ونظير الصماوي في تمايز الخلايا الجنينية 16 و 17 و 20. أساليب أخرى، بما في ذلك الزخرفة من المصفوفة خارج الخلية 28، الطباعة النافثة للحبر 29، والزخرفة من تدفق الصفحي في أجهزة ميكروفلويديك 25، كما تم استخدام 26 في توطين الخلايا. هذه الأساليب هي الأخرى نهج فعالة لتحقيق أنماط محددة جيدا من الخلايا، ويمكن في كثير من الأحيان تحقيق الدقة وحيدة الخلية. ومع ذلك، هذه الأساليب تتطلب أيضا درجة عالية من المعدات المتخصصة و / أو الوصول إلى المرافق غرف الأبحاث لصنع الطوابع المستخدمة في العلاقات العامةالباحث البروتينات المصفوفة خارج الخلية أو إنتاج أجهزة على microfluidics. صلتهم إمدادات الطاقة، ومضخات المحاقن، والمكونات الخارجية الأخرى أيضا يعيق تنفيذها بسبب التكاليف المرتبطة المعدات والمهارات المطلوبة المستخدم لتشغيلها.

من حيث التطبيقات المستقبلية نتوقع أن أسلوبنا سيكون مفيدا للثقافة تطوير نظم التي تمكن عالية الإنتاجية تحليل حركة الخلايا وانتشار الأسلحة النووية، وكذلك التحقيق في خلية خلية التفاعلات بين السكان خلايا متعددة. إلى هذه النقطة، وركزت على دراسة تقاريرنا التفاعل من أنواع قليلة فقط من الخلايا منقوشة في وقت واحد. ومع ذلك، فمن المتصور أنه يمكن تربيتها مجموعات سكانية فرعية عديدة من الخلايا المغذية بطبقة مشتركة للتحقيق في تأثير إشارات نظير الصماوي وjuxtacrine من العديد من أنواع الخلايا نمت معا في الإعداد خلية ثقافة واحدة. وأخيرا توطين المكانية، وتطبيقات هندسة الأنسجة المطلوبة في كثير من الأحيان منأنواع الخلايا واحد أو أكثر. قد يكون من الممكن للتكيف مع أسلوبنا للاستخدام في الخلايا الزخرفة من أجل إنتاج المزيد من النماذج ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية الأنسجة المهندسة المرض إلى الخلايا أو نمط على المواد القابلة للزرع للتطبيقات السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب لا تتنافس المصالح المالية.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة كولتر، ومؤسسة بايستر، فرصة البحوث الجامعية (UROP) البرنامج الصيفي لATA وطلاب الدراسات العليا العلوم الوطنية زمالة مؤسسة البحوث (منحة لا DGE 0718128؛ ID: 2010101926) لJBW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran 500,000 kDa Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3 ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM Gibco, Carlsbad, CA
RPMI Gibco, Carlsbad, CA
F12 Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum Gibco, Carlsbad, CA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hatti-Kaul, R. Aqueous two-phase systems : methods and protocols. Methods in biotechnology. xiii, Humana Press. 440 (2000).
  2. Albertsson, P. A. k Partition of cell particles and macromolecules: separation and purification of biomolecules, cell organelles, membranes, and cells in aqueous polymer two-phase systems and their use in biochemical analysis and biotechnology. 3rd ed, Wiley. 346 (1986).
  3. Yamada, M., et al. Continuous cell partitioning using an aqueous two-phase flow system in microfluidic devices. Biotechnol. Bioeng. 88, (4), 489-494 (2004).
  4. Soohoo, J. R., Walker, G. M. Microfluidic aqueous two phase system for leukocyte concentration from whole blood. Biomed. Microdevices. 11, (2), 323-329 (2009).
  5. Hahn, T., Hardt, S. Concentration and size separation of DNA samples at liquid-liquid interfaces. Anal. Chem. 83, (14), 5476-5479 (2011).
  6. Hatti-Kaul, R. Aqueous two-phase systems. A general overview. Mol. Biotechnol. 19, (3), 269-277 (2001).
  7. Hustedt, H., Kroner, K. H., Menge, U., Kula, M. -R. Protein recovery using two-phase systems. Trends in Biotechnology. 3, (6), 139-144 (1985).
  8. Keating, C. D. Aqueous Phase Separation as a Possible Route to Compartmentalization of Biological Molecules. Acc Chem. Res. 45, (12), 2114-2124 (2012).
  9. Helfrich, M. R., et al. Partitioning and assembly of metal particles and their bioconjugates in aqueous two-phase systems. Langmuir. 21, (18), 8478-8486 (2005).
  10. Diamond, A. D., Hsu, J. T. Prote. Partitioning in PEG/Dextran Aqueous Two-Phase Systems. AIChE Journal. 36, (7), 1017-1024 (1990).
  11. Y-T,, Zhu, Z. -Q. Modeling of interfacial tension of aqueous two-phase systems. Chemical Engineering Science. 54, (4), 433-440 (1999).
  12. Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. Concentration dependence of the interfacial tension for aqueous two-phase polymer solutions of dextran and polyethylene glycol. Langmuir. 28, (8), 3831-3839 (2012).
  13. Rha, C. Interfacial Tension of Polyethylene Glycol/Potassium Phosphate Aqueous Two-Phase Systems. Physics and Chemistry of Liquids: An International Journal. 38, (1), 25-34 (2000).
  14. Fang, Y., et al. Rapid Generation of Multiplexed Cell Cocultures Using Acoustic Droplet Ejection Followed by Aqueous Two-Phase Exclusion Patterning. Tissue Eng. Part C. Methods. 18, (9), 647-657 (2012).
  15. Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, (9), 736-741 (2009).
  16. Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, (24), 2628-2631 (2010).
  17. Tavana, H., et al. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. (2011).
  18. Tavana, H., Takayama, S. Aqueous biphasic microprinting approach to tissue engineering. Biomicrofluidics. 5, (1), 13404 (2011).
  19. Frampton, J. P., et al. Precisely targeted delivery of cells and biomolecules within microchannels using aqueous two-phase systems. Biomed. Microdevices. 13, (6), 1043-1051 (2011).
  20. Hossein Tavana, K. K., Bersano-Begey, T., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Rehydration of Polymeric, Aqueous, Biphasic System Facilitates High Throughput Cell Exclusion Patterning for Cell Migration Studies. Advanced Functional Materials. 21, (15), 2920-2926 (2011).
  21. Falconnet, D., et al. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27, (16), 3044-3063 (2006).
  22. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Eng. 13, (8), 1879-1891 (2007).
  23. Ringeisen, B. R., et al. Jet-based methods to print living cells. Biotechnol. J. 1, (9), 930-948 (2006).
  24. Wright, D., et al. Generation of static and dynamic patterned co-cultures using microfabricated parylene-C stencils. Lab Chip. 7, (10), 1272-1279 (2007).
  25. Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, (10), 5545-5548 (1999).
  26. Berthier, E., et al. Pipette-friendly laminar flow patterning for cell-based assays. Lab Chip. 11, (12), 2060-2065 (2011).
  27. Davidson, R. L., O'Malley, K. A., Wheeler, T. B. Polyethylene glycol-induced mammalian cell hybridization: effect of polyethylene glycol molecular weight and concentration. Somatic Cell Genet. 2, (3), 271-280 (1976).
  28. Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
  29. Moon, S., Lin, P., Keles, H. O., Yoo, S., Demirci, U. Title Cell Encapsulation by Droplets. J. Vis. Exp. (8), e316 (2007).
خلية المشارك الثقافة الزخرفة باستخدام مائي مرحلتين أنظمة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems. J. Vis. Exp. (73), e50304, doi:10.3791/50304 (2013).More

Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems. J. Vis. Exp. (73), e50304, doi:10.3791/50304 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter