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Bioengineering

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

doi: 10.3791/50304 Published: March 26, 2013

Summary

Acquose due sistemi monofase sono stati usati per simultaneamente popolazioni modello multiple di cellule. Questo metodo semplice e veloce per patterning cellulare sfrutta la fase di separazione di soluzioni acquose di destrano e polietilene glicole e la tensione interfacciale che esiste tra le due soluzioni polimeriche.

Abstract

Tecnologie di patterning cellulari che sono veloci, facili da usare e conveniente sarà necessario per il futuro sviluppo di saggi cellulari di throughput elevati, piattaforme per lo studio di interazioni cellula-cellula e sistemi di ingegneria tessutale. Questo protocollo dettagliato descrive un metodo per generare co-colture di cellule utilizzando soluzioni biocompatibili di destrano (DEX) e polietilene glicole (PEG) che di fase separata quando combinato sopra concentrazioni soglia. Cellule può essere modellato in una varietà di configurazioni con questo metodo. Esclusione patterning cella può essere eseguita stampando goccioline di DEX su un substrato e rivestimento con una soluzione di cellule contenenti PEG. La tensione interfacciale formato tra le due soluzioni polimeriche induce le cellule a diminuire verso l'esterno della goccia DEX e formare una radura circolare che può essere utilizzata per i saggi di migrazione. Isole di cellule può essere modellato erogando una cellula fase ricca DEX in una soluzione di PEG o coprendo il DEXgoccia con una soluzione di PEG. Co-colture possono essere formati direttamente dalla combinazione di esclusione delle cellule con patterning DEX isola. Questi metodi sono compatibili con una varietà di approcci manipolazione di liquidi, inclusi micropipetting manuale, e può essere utilizzato con qualsiasi tipo di cellule aderenti.

Introduction

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Acquose di due sistemi monofase (ATPSs) forma quando le soluzioni di due polimeri incompatibili sono miscelati assieme a concentrazioni sufficientemente elevate. Separazione di fase è influenzata da una varietà di fattori che includono il peso molecolare e la polarità dei polimeri, temperatura, pH e soluzioni contenuto ionico del solvente acquoso 1, 2. Il punto in cui viene determinato le due soluzioni di polimeri distinte dalle proprietà fisico del sistema fase prescelto, ma generalmente avviene a basse concentrazioni di polimero (meno del 20% peso / peso) sotto condizioni non denaturanti, permettendo ATPSs da utilizzare per la biotecnologia applicazioni 3-9.

Di gran lunga i più studiati ATPS è il polietilene glicole (PEG) / destrano (DEX) sistema. Le ATPS formati da questi polimeri economici e biocompatibile è stato originariamente descritto per la purificazione di biomolecole mediante partizionamento molecolare 2, 10. Partizionamentosi verifica quando le molecole aggiuntive o particelle che non contribuiscono al sistema di fase sono mescolati con PEG e DEX. Sulla base delle loro affinità relative sia per DEX o PEG, le molecole o le particelle sarà preferenzialmente trovarsi all'interno di una delle due fasi o all'interfaccia. Un'altra proprietà della PEG / DEX ATPS è l'esistenza di tensione interfacciale tra le due fasi polimeriche. ATPSs formate da PEG e DEX mostrano generalmente tensioni interfacciali che sono molto più basso rispetto agli altri liquido-liquido a due fasi di sistemi come l'olio e l'acqua, ma le forze di tensione di interfaccia ancora esercitare effetti su particelle di piccole dimensioni come i virus, le cellule e aggregati proteici 2 , 11-13. Infine, poiché il peso molecolare più elevato e PEG DEX separato a basse concentrazioni (meno del 5% peso / peso di alta varietà polimeri peso molecolare) in presenza di concentrazioni fisiologiche di sali, ci sono pochi eventuali effetti deleteri sulle cellule di mammifero incorporato in questi sistemi14-16.

Recentemente, le proprietà interfacciali e gli effetti di partizionamento ATPSs sono stati applicati dal nostro laboratorio per patterning cella 14, 16-20. Ciò è stato realizzato micropatterning una soluzione densa DEX su substrati di coltura cellulare in presenza di PEG. Quando le cellule sono incorporati nella fase di PEG, sono escluse le goccioline di entrare DEX causa di PEG / DEX tensione interfacciale 20. Quando le cellule sono modellati in fase di DEX, che vengono trattenuti sulla superficie del substrato di coltura cellulare da tensione interfacciale e partizionamento 16, 17, 19.

A differenza di altri metodi di patterning cellulare, patterning cellulare ATPS è facile da imparare e richiede solo una conoscenza rudimentale sugli stessi polimeri, e la possibilità di effettuare la coltura cellulare e utilizzare una micropipetta. Altri metodi per patterning cellulare spesso coinvolgono attrezzature specializzate e di formazione che non sono facilmente tradotto in the scienze della vita. Ad esempio, alcuni metodi (microcontact stampa o stampa a getto d'inchiostro) cellule reticolo indirettamente applicando modelli di biomolecole adesive cellulari ad un substrato cultura che successivamente servire come siti per attaccamento cellulare 21, 22. Sebbene approcci indiretti sono utili per alcuni tipi di cellule, che richiedono un alto grado di abilità dell'utente e attrezzature specializzate per fabbricare lo strumento patterning, e può mancano di specificità a seconda del particolare tipo di cellula / biomolecola pattern. In alternativa, le cellule possono essere depositati presso specificità modello alto per mezzo di approcci diretti patterning che includono flusso laminare patterning, stencil e la stampa a getto d'inchiostro 23-26. Tuttavia, queste tecniche richiedono anche competenze dell'utente e attrezzature specializzate, e può danneggiare le cellule durante il processo di stampa. Sebbene questi approcci generalmente producono schemi precisi di cellule, per patterning cella per essere un utile strumento nelle scienze della vita, deve essere conveniente unand semplice da implementare.

Qui riportiamo un protocollo dettagliato per la generazione di colture cellulari a motivi geometrici utilizzando le ATPSs descritti nelle nostre applicazioni precedentemente pubblicate. Utilizzando micropipettatori solo, gli utenti possono generare zone di esclusione cellulari o isole di cellule per saggi di migrazione. Questo è ottenuto per mezzo di PEG / DEX tensione interfacciale che mantiene sia le cellule in fase di DEX o esclude cellule depositati nella fase PEG da DEX. Combinando queste due patterning tecniche fondamentali, è possibile generare rapidamente co-colture di cellule quali fibroblasti cellule epatiche-co-colture. Metodi di patterning, parametri ATPS e risultati attesi sono descritti in dettaglio.

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Protocol

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1. Fase di caratterizzazione del sistema: soglie che determinano la separazione delle fasi

  1. Preparare soluzioni contenenti PEG e DEX nel buffer desiderato o terreno di coltura cellulare come mostrato in Figura 1 (punti viola) in 15 ml o 50 ml provette coniche. D'ora in avanti, PEG e DEX farà riferimento a 35 PEG kDa e 500 kDa DEX, tuttavia, concentrazioni critiche cambierà a seconda dei due polimeri utilizzati. Registrare la massa di PEG e DEX in ciascuna soluzione. Ad alta concentrazione di soluzioni di polimeri può richiedere alcune ore per sciogliere. Vortexando può essere utilizzato per senza siero soluzioni. Per i supporti contenenti proteine ​​o siero, posizionare i tubi su un palco a dondolo fino a quando entrambi i polimeri sono completamente sciolti. Registrare il peso dei supporti utilizzati per sciogliere i polimeri e prendere atto delle concentrazioni iniziali.
  2. Una volta che i polimeri sono completamente sciolti, le soluzioni dovrebbero apparire nuvoloso. Questa è la prima indicazione che si è verificata la separazione di fase. A conferma di ciò, consentire lasoluzioni polimeriche a riposo in posizione verticale a temperatura ambiente per 20 min. Centrifugazione a 1000 xg può essere utilizzato per accelerare il processo di separazione di fase. La fase di fondo più denso sarà DEX-ricchi e la fase superiore sarà PEG-ricchi.
  3. Aggiungere lentamente buffer aggiuntivo o un supporto per i tubi. Piccoli incrementi dovrebbe essere usato in modo da non superamento del punto di separazione di fase.
  4. Quando la soluzione diventa limpida e non più di fase dopo centrifugazione separa, la soglia per separazione di fase è stato raggiunto. Registrare il peso finale del tubo.
  5. Utilizzando i pesi registrate in precedenza per i polimeri, insieme con il peso finale dopo l'aggiunta di supporto, determinare la% in peso / peso di ciascuno dei due polimeri in cui la separazione di fase non si verifica più.
  6. Tracciare questi valori come% p / p PEG sulla y e% peso / peso DEX sul asse x. Questa trama, detto curva binodal, può essere utilizzato per determinare la concentrazione di soglia per la separazione di fase per Concentrati diversaons di PEG / DEX in un mezzo di coltura cellulare specifico.

2. Configurazione 1: Patterning Esclusione (formato a 96 pozzetti Plate)

  1. Preparare soluzioni separate di 5,0% p / p PEG e 12,8% peso / peso DEX in mezzo di coltura cellulare. Usare soluzioni ATPS di almeno due volte il punto critico per garantire che un ATPS rimane dopo i polimeri equilibrare con rispetto all'altro. Vi è una piccola quantità di flusso di DEX nel PEG fase ricca e viceversa, pertanto, lavorando troppo vicino alla concentrazione critica può comportare la perdita di fase come sistema goccia concentrazioni sotto il punto critico. Analogamente, il trasferimento del piatto di coltura cellulare ad una umidità e temperatura controllata incubatrice può alterare le due fasi proprietà e rendere le due soluzioni miscibili. Nota: Alcune cellule potrebbero funzionare meglio con le altre formulazioni ATPS. Formulazioni accettabili possono essere selezionati in base alle curve binodal determinati dalla parte 1.
  2. Raccogliere le cellule da utilizzare per l'esclusione patterning. Determinare il numero totale / concentrazione di cellule disponibili. Opzionale: marcare le cellule con CellTracker o altri non-citotossici etichette per microscopia a fluorescenza.
  3. Il pellet e risospendere il pellet in un volume adeguato di 5,0% PEG per ottenere il numero desiderato di cellule di esclusione. Per esempio, un pozzetto di una piastra da 96 pozzetti richiede 37.500 cellule di fibroblasti da risospese in 200 pl di PEG per produrre confluenza il giorno seguente. Scala questi numeri a seconda dei casi per altri tipi di cellule e dimensioni del substrato di coltura.
  4. Utilizzando una micropipetta, dispensare 0,5 pl di goccioline DEX su un substrato secco coltura cellulare. Goccioline di volume maggiore produzione di zone di esclusione più grandi. Gocce di dimensioni variabili 0,1-1 microlitri sono raccomandati per micropatterning esclusione. Opzionale: DEX goccioline possono essere depositati 24 ore prima del tempo e lasciati disidratare a temperatura ambiente. Questo può produrre modelli più puliti.
  5. Pipettare 200 ml di sospensione cellulare PEG in tegli bene a coprire le goccioline DEX.
  6. Posto in un incubatore umidificato per 12 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. Assicurarsi che il piatto non sia inclinato durante la movimentazione e che sia posizionato su una mensola livello incubatore per evitare di interrompere i modelli.
  7. Rimuovere la soluzione di PEG e lavare tre volte con 200 microlitri di terreno di coltura.
  8. Aggiungere mezzo fresco cultura e tornare alla incubatrice.
  9. Monitorare periodicamente le culture di osservare il movimento delle cellule nella zona di esclusione.

3. Configurazione 2: Island Patterning (formato a 96 pozzetti Plate)

  1. Preparare soluzioni di 5,0% p / p PEG e 12,8% peso / peso DEX in mezzo di coltura cellulare, come sopra.
  2. Raccogliere le cellule da utilizzare per patterning isola. Determinare il numero totale / concentrazione di cellule disponibili.
  3. Pellet e risospendere le cellule in un volume adeguato di DEX% 12,8 per ottenere la concentrazione desiderata di celle per patterning isola. Le concentrazioni di 5000 ceLLS / microlitri o meno sono raccomandati per tipi cellulari fortemente aderenti. Per le celle che hanno difficoltà di collegare o cellule che aderiscono liberamente, le concentrazioni fino a 10.000 cellule / mL possono essere considerate.
  4. Lavorando rapidamente per evitare l'essiccamento, pipette goccioline 0,5 pl di DEX su un substrato secco coltura cellulare, come descritto sopra. Non lasciare asciugare gocce. Opzionale: 200 pl di soluzione di PEG può essere aggiunto al ben prima del tempo. DEX goccioline possono essere depositati nella soluzione PEG dove potranno depositano sul fondo e la superficie di contatto cultura. Questo in grado di produrre modelli più puliti dell'isola.
  5. Coprire le goccioline DEX con 200 ml di PEG.
  6. Posto in un incubatore umidificato per 12 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. Assicurarsi che il piatto non sia inclinato durante la movimentazione e che sia posizionato su una mensola livello incubatore per evitare di interrompere i modelli.
  7. Rimuovere la soluzione di PEG e lavare tre volte con 200 microlitri di terreno di coltura.
  8. Aggiungi coltura frescamedie e ritorno al incubatore.
  9. Monitorare periodicamente le culture di osservare il movimento delle cellule verso l'esterno e la proliferazione delle isole.

4. Configurazione 3: Esclusione Co-colture (formato a 96 pozzetti Plate)

  1. Preparare soluzioni di 5,0% p / p PEG e 12,8% peso / peso DEX in mezzo di coltura cellulare, come sopra.
  2. Raccogliere le cellule da utilizzare per l'esclusione e patterning isola. Determinare il numero totale / concentrazione di cellule disponibili per ogni tipo cellulare. Opzionale: Alcuni abbinamenti cellulari possono visualizzare indici di proliferazione drammaticamente diversi. Per evitare che le cellule escluse dal overpopulating cellule fantasia insulari (soprattutto per le culture a lungo termine), trattare le cellule utilizzate per l'esclusione con mitomicina C per 2 ore o irradiare prima raccolta. Ciò impedirà la proliferazione. CellTracker coloranti fluorescenti possono essere utilizzati per distinguere le due popolazioni cellulari se necessario.
  3. Il pellet e risospendere il pellet per exclusion patterning in un volume appropriato di 5,0% PEG per ottenere il numero desiderato di cellule, come sopra. Risospendere il pellet di patterning isola in un volume appropriato di DEX 12,8% per ottenere la concentrazione desiderata di cellule, come sopra.
  4. Utilizzando una micropipetta, dispensare 0,5 goccioline pl di sospensione cellulare DEX su un substrato secco coltura cellulare. Non lasciare asciugare gocce.
  5. Coprire le goccioline DEX con 200 microlitri di sospensione cellulare PEG.
  6. Posto in un incubatore umidificato per 12 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. Assicurarsi che il piatto non sia inclinato durante la movimentazione e che sia posizionato su una mensola livello incubatore per evitare di interrompere i modelli.
  7. Rimuovere la soluzione di PEG e lavare tre volte in 200 ml di terreno di coltura.
  8. Aggiungere mezzo fresco cultura e tornare alla incubatrice.
  9. Monitorare i co-colture di osservare l'interazione tra popolazioni cellulari. Opzionali: I controlli possono essere preparate eseguendo esclusione o isola patterning individually, mediante co-coltura delle cellule che non interagiscono o bloccando percorsi di interesse in una o entrambe le popolazioni cellulari prima o dopo patterning.

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Representative Results

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Per selezionare una combinazione appropriata di PEG e DEX per patterning cella è importante per determinare la curva binodal. Questa curva delinea i punti in cui si possono formare un ATPS e può variare per un dato insieme di polimeri a base di temperatura, pH e contenuto ionico. Per coltura di cellule che richiedono formulazioni personalizzate medio può essere necessario determinare sperimentalmente la curva binodal. Questo si ottiene generando una serie di ATPSs che sono lontani dal binodal e variando nel loro contenuto e PEG DEX (Figura 1, cerchi viola). Quando un ATPS è presente, le soluzioni polimeriche avrà un aspetto torbido quando sono mescolati e equilibrare in fasi distinte, se lasciato indisturbato. Aggiungendo solvente aggiuntivo alla miscela polimerica, i ATPS si avvicinerà 0% PEG / 0% DEX. Ad un certo punto, la miscela non sarà più fasi separate. Il PEG / DEX concentrazione alla quale si verifica ciò rappresenta un punto sulla curva binodal; sopra quel punto un ATPS possono formare e al di sotto di tale punto non può. Le curve in Figura 1 rappresentano binodals per tre comuni mezzi di coltura cellulare con e senza il 10% di siero bovino fetale (FBS). Le concentrazioni a cui è formata una ATPS sono leggermente maggiore in presenza di FBS.

Nei rapporti precedenti, abbiamo usato ATPSs sulla base di un punto critico (il punto sul binodal in cui volumi uguali di forma PEG e DEX, messo in equilibrio) del 2,5% PEG 35% kDa/3.2 DEX 500 kDa. I risultati dei nostri dati binodal sono in prossimità di questo valore punto critico. Abbiamo testato nove combinazioni di sistema per patterning di fase, come mostrato nella Tabella 1. Poiché le soluzioni pure di PEG e DEX equilibrare rispetto alle loro concentrazioni di polimero dopo che sono combinati, alcune di queste soluzioni non formare ATPSs stabili, e pertanto non erano utili per patterning (tabella 1a, segni x). Altre combinazioni di polimeri prodotta modelli riconoscibili, Ma non erano abbastanza uniforme per la sperimentazione (Tabella 1 bis x / ✓ marchi). Utili formulazioni polimeriche formate zone di esclusione o isole che erano quasi prive di cellule nei senza disegni regioni (Tabella 1a, ✓ marchi).

Con il 10% PEG, abbiamo notato che la morfologia delle cellule era anormalmente rotonda e l'asta-come dopo 24 ore, con celle di visualizzazione di una diminuzione della capacità di attaccarsi alla superficie della cultura (tabella 1b, segni di x). Morfologia e attaccamento erano normali per il 2,5% e il 5% PEG (tabella 1b ✓ marchi). Abbiamo osservato che precipitato siero dal mezzo di coltura a concentrazioni elevate (PEG Tabella 1c, segni x), suggerendo che la morfologia cellulare anormale e allegato in 10% PEG possono essere correlati a problemi di accesso siero. Inoltre, PEG è noto per disturbare membrane plasmatiche 27. Sebbene questi effetti sono osservati solo ad alte concentrazioni di mol bassaPEG ecular peso, è meglio utilizzare la più bassa concentrazione di PEG che produce patterning affidabile.

Coerentemente con i nostri rapporti precedenti, siamo giunti alla conclusione che il 5% PEG/6.4% DEX e il 5% PEG/12.8% DEX erano adatte per patterning cellulare, con il 12,8% DEX produrre modelli più uniformi. Risultati attesi per tre formati patterning Tracker utilizzando cellule marcate con cellule HeLa sono mostrati nella Figura 2. Seguendo ogni approccio patterning, è possibile creare modelli uniformi di ogni tipo, con pochissime cellule fuori delle aree fantasia.

Utilizzando esclusione e patterning isola è possibile valutare la proliferazione e la migrazione delle cellule patterned (Figura 3). Nel corso di tre giorni, le cellule HeLa hanno riempito le zone di esclusione (figure 3a-c). Isola-fantasia cellule espanse verso l'esterno dai modelli iniziali (Figure 3d-f). Questi cambiamenti possono essere quantificati conImageJ standard di strumenti di misura (figure 3 c, f). È importante notare che quando le popolazioni cellulari multiple sono co-coltura (figura 2, 3 Format), una popolazione di cellule possono proliferare-out e sostituire l'altro. Patterning Esclusione e patterning isola può essere uno strumento utile per valutare se questo sarà un problema. In situazioni in cui drammatiche differenze nell'indice di proliferazione verificano, si raccomanda che una popolazione di cellule trattate da fattori irradiazione o chimica di limitare la proliferazione. Questo è particolarmente utile in situazioni in cui si utilizza un tipo di cellula come cellula supporto per un tipo di crescita più lenta cellule più sensibili.

Abbiamo dimostrato questo principio coltivando cellule HepG2, un carcinoma epatocellulare linea cellulare che è comunemente usato per biologia modello epatociti, con fibroblasti NIH 3T3 che sono state arrestate con mitomicina C (Figura 4). Nel corso del tempo, le cellule HepG2 mantengono la loro localizzazione und forma colonia (Figura 4a). Ponendo molte goccioline nella stessa piastra e li circonda con fibroblasti è possibile coltivare queste cellule in un formato che è potenzialmente utile per studi multiplati (Figura 4b). Cellule insulari monocolture possono essere utilizzati con questo formato come controllo per l'influenza di fattori paracrini (Figura 4c).

Figura 1
Figura 1. Le concentrazioni di polimero in cui un ATPS possono formare possono essere estrapolati da determinati sperimentalmente curve binodal. Questa curva binodal è stato costruito con il metodo del punto di intorbidamento con l'aggiunta di solvente aggiuntivo per misurare i punti in cui due fasi diverse miscele di PEG / DEX concentrazioni (viola cerchi) non erano in grado di fase separating. Binodals stati determinati per DMEM F12 ed RPMI con e senza siero. Punti dati sono stati dotati di una funzione di tre parametri razionale. N = 3 per ciascun punto di dati.

Figura 2
Figura 2. Erogando soluzioni ATPS su piastre di polistirene, tre formati per patterning cella può essere prodotta. La procedura inizia pipettando goccioline DEX a), che vengono poi rivestiti con PEG b). Una volta che le cellule allegare, le soluzioni ATPS può essere lavato e sostituito con terreno di coltura (c, d). Immagini di fluorescenza per monocolture sono state colorate con coloranti CellTracker dopo patterning. Per co-colture, le cellule sono state colorate con coloranti CellTracker separatamente prima di patterning. Cellule HeLa sono state utilizzate per generare i tre formati di coltura. Figura 3
Figura 3. Patterning esclusione e patterning isola può essere utilizzato per valutare la migrazione e la proliferazione cellulare. A) esclusione patterned cellule HeLa 1 giorno dopo patterning. B) esclusione patterned cellule HeLa 3 giorni dopo patterning. C) cellule proliferano e migrano, riducendo significativamente le dimensioni del zona di esclusione. d) Isola con motivi cellule HeLa 1 giorno dopo patterning. e) Isola di fantasia-cellule HeLa 3 giorni dopo patterning. f) Le cellule proliferano e migrano verso l'esterno, espandendo significativamente la dimensione dell 'isola. Le immagini sono state quantificate utilizzando il software ImageJ per misurare la compensazione delle cellule e delle cellule insulari, prima e dopo la migrazione. Le barre rappresentano dire± SEM di almeno tre osservazioni indipendenti.

Figura 4
Figura 4. Cellule del fegato / fibroblasti culture possono essere generati utilizzando esclusione ATPS co-coltura patterning. A) Queste colonie mantengono la loro organizzazione per almeno 4 giorni di coltura. B) isole multiple possono essere disposti in un piatto unico con un potenziale di multiplex o high-throughput saggi. c) Rispetto ai non-co-coltura modelli isola, di co-coltura di cellule di visualizzare livelli leggermente più elevati di produzione di albumina (colorazione marrone) come risulta evidente dal confronto qualitativo delle vetrate albumina co-colture contro monocolture. Albumina è una proteina prodotta dalle cellule del fegato. Pertanto, questo risultato suggerisce che la funzione delle cellule del fegato è aumentata quando co-coltura con fibroblasti usando ATPS.

a) disegno formato DEX 3,2% DEX 6,4% DEX 12,8%
PEG 2,5% x x x
PEG 5,0% x / ✓
PEG 10,0% x / ✓
b) Morfologia DEX 3,2% DEX 6,4% DEX 12,8%
PEG 2,5%
PEG 5,0% & # X2713;
PEG 10,0% x x x
c) Siero Precipitazioni DEX 3,2% DEX 6,4% DEX 12,8%
PEG 2,5%
PEG 5,0%
PEG 10,0% x x x

Tabella 1. ATPS formulazioni a) che possono essere utilizzati per patterning sono indicati da segni di spunta, quelle che non sono indicati da segni x. B) Formulazioni che mantengono normale morfologia cellulare e le proprietà di fissaggio sono indicati bsegni di spunta y, quelle che non possono sono indicati da segni di x. c) Formulazioni che hanno portato la precipitazione di proteine ​​del siero sono indicati con segni di x.

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Discussion

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Il metodo delle celle ATPS micropatterning richiede competenze molto poco al di là di idoneità all'uso di tecniche di coltura cellulare e può essere rapidamente padronanza. I vantaggi di questo sistema è che è poco costoso, rapido e compatibile con una varietà di tipi cellulari e formati coltura. Per queste ragioni, il nostro protocollo deve essere facilmente adottato dagli scienziati della vita, in particolare quelli che studiano la proliferazione cellulare, la migrazione e la chemiotassi, e l'influenza delle interazioni juxtacrine e paracrino tra le popolazioni di cellule. I saggi qui presentati possono essere facilmente quantificati a livello di popolazione cellulare utilizzando le procedure standard di analisi delle immagini disponibili nel software come ImageJ.

Per generare modelli coerenti si consiglia le seguenti precauzioni. Primo, la punta della pipetta usata per erogare la soluzione DEX deve essere cambiato dopo ogni gocciolina DEX è depositato per fornire volumi goccioline più coerenti. Poiché la soluzione DEX è relativamente viscoso, È anche importante evitare il deposito DEX eccesso che potrebbe essere presente sulla superficie esterna della punta della pipetta e per assicurare che l'intero volume di uscite DEX punta. Secondo, le goccioline può muoversi se PEG viene aggiunto troppo vigorosamente o se il piatto è inclinato. Interruzione DEX può essere minimizzato tenendo il piatto su una superficie piana e consentendo la soluzione PEG a coprire gradualmente le goccioline dall'alto senza consentire grandi forze del menisco PEG per rimuovere parte della goccia. Droplet interruzione si verifica più frequentemente con grandi gocce DEX, così goccioline di 0,5 microlitri o meno dovrebbe essere usato se possibile. Oltre a questi problemi tecnici connessi con le soluzioni di erogazione, ci sono delle trappole pochissimi associati a questa tecnica, purché idonee pesi molecolari polimeriche e le concentrazioni vengono utilizzati.

Sebbene patterning ATPS può essere facilmente eseguita utilizzando una micropipetta (come presentato qui), ci sono una varietà di più sophisticated approcci che possono essere utilizzati per generare rapidamente modelli di più matrici complesse geometriche (ad esempio robot di manipolazione dei liquidi e di espulsione delle gocce acustico), come presentato nei nostri studi precedenti 14, 15, 20. È anche possibile generare goccioline DEX molto più piccoli in volume da espellere DEX pneumaticamente attraverso orifizi capillari o azionando un orifizio in un microcanale per produrre goccioline scorrono DEX rivestite da PEG 19. Questi approcci possono essere di interesse per coloro che cercano di produrre saggi di co-coltura o la migrazione ad alto rendimento o multiplex. Inoltre, utilizzando approcci microfluidici, è possibile eseguire esperimenti con un piccolo numero di cellule, o con cellule in un microcanale in cui gli effetti del flusso di fluido e pura può essere esaminato. Tuttavia, questi metodi avanzati non sono richiesti per la maggior parte delle applicazioni.

Acquosa bifase patterning di cellule è semplice e facilmente adattabile ad una tipica cellulaimpostazione della lingua. Questo metodo consente a qualsiasi ricercatore con accesso a un laboratorio tipica coltura cellulare (accesso ad una cappa, CO 2 incubatore, e micropipette) ed i polimeri di cui sopra per le cellule modello riproducibile in monocoltura e co-coltura. Il nostro laboratorio ha dimostrato questa capacità stampando array di celle di studiare la migrazione cellulare in un saggio di guarigione delle ferite e per esaminare gli effetti di segnalazione juxtacrine e paracrina nella differenziazione delle cellule embrionali 16, 17, 20. Altri metodi, compreso patterning di matrice extracellulare 28, stampa a getto d'inchiostro 29, e patterning dal flusso laminare in dispositivi microfluidici 25, 26 sono stati utilizzati per localizzare le cellule. Questi metodi sono altri approcci efficaci al raggiungimento di ben definiti modelli di cellule e che spesso può raggiungere a cella singola precisione. Tuttavia, questi metodi richiedono anche altamente specializzate attrezzature e / o l'accesso ai servizi per camere bianche per fabbricare i timbri utilizzati per print proteine ​​della matrice extracellulare o producono dispositivi microfluidici. La loro connessione con alimentatori, pompe siringa e altri componenti esterni, ostacola anche la loro attuazione a causa dei costi connessi con le attrezzature e l'abilità dell'utente necessaria per azionarlo.

In termini di applicazioni future ci aspettiamo che il nostro metodo sarà utile per sviluppare sistemi di coltura che consentono alta produttività analisi del movimento e della proliferazione cellulare, nonché inquirenti interazioni cellulari tra le popolazioni cellulari multipli. A questo punto, i nostri rapporti sono concentrati sull'esame interazione di solo pochi tipi di cellule modellati contemporaneamente. Tuttavia, è concepibile che molte sottopopolazioni di cellule potrebbe essere coltivate con uno strato alimentatore comune per esaminare l'impatto di segnalamento e paracrine juxtacrine di molti tipi di cellule coltivate insieme in una configurazione singola coltura cellulare. Infine, applicazioni di ingegneria dei tessuti spesso richiesto localizzazione spaziale diuno o più tipi di cellule. Può essere possibile adattare la nostra tecnica per l'uso in cellule patterning per produrre fisiologicamente più rilevanti modelli di malattia ingegnerizzati tessuto o alle cellule reticolo su materiali impiantabili per applicazioni cliniche.

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Disclosures

Gli autori non hanno concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Coulter, Beyster Fondazione, l'opportunità di ricerca di laurea (UROP) programma estivo per ATA e un National Science Foundation Graduate Student Research Fellowship (Grant non DGE 0718128, ID:. 2010101926) per JBW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran 500,000 kDa Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3 ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM Gibco, Carlsbad, CA
RPMI Gibco, Carlsbad, CA
F12 Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum Gibco, Carlsbad, CA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase
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Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems. J. Vis. Exp. (73), e50304, doi:10.3791/50304 (2013).More

Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems. J. Vis. Exp. (73), e50304, doi:10.3791/50304 (2013).

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