Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Cell Co-kultur Mønster med vandig tofasesystemer

doi: 10.3791/50304 Published: March 26, 2013

Summary

Vandige tofasesystemer ble brukt til samtidig mønster flere populasjoner av celler. Denne raske og enkel metode for celle mønster utnytter faseseparasjon av vandige oppløsninger av dekstran og polyetylenglykol og grenseflatespenningen som eksisterer mellom de to polymer-løsninger.

Abstract

Cell mønster teknologier som er rask, enkel å bruke og rimelig vil være nødvendig for den fremtidige utviklingen av høy gjennomstrømning celle-analyser, plattformer for å studere celle-celle interaksjoner og vev konstruerte systemer. Denne detaljerte protokollen beskriver en fremgangsmåte for generering av co-kulturer av celler ved hjelp av oppløsninger av biokompatible dekstran (DEX) og polyetylenglykol (PEG) som fase-separat når kombinert ovenfor terskelkonsentrasjon. Celler kan mønstret i en rekke konfigurasjoner med denne metoden. Cell uttrekk mønster kan utføres ved å skrive dråper av DEX på et substrat og dekker dem med en oppløsning av PEG som inneholder celler. Grenseflatespenningen dannet mellom to polymer-løsninger forårsaker celler å falle rundt utsiden av DEX dråpene og danner en sirkulær clearing som kan brukes for migrasjon analyser. Cell øyer kan mønstret ved å dispensere en celle-rik DEX fase inn en PEG løsning eller ved å dekke DEXDroplet med en oppløsning av PEG. Co-kulturer kan dannes direkte ved å kombinere celle eksklusjon med DEX øya mønster. Disse metodene er kompatible med en rekke væskehåndtering tilnærminger, inkludert manuell micropipetting, og kan brukes med praktisk talt alle vedheftende celletype.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vandige tofasesystemer (ATPSs) form når oppløsninger av to uforenlige polymerer er blandet sammen ved høye nok konsentrasjoner. Faseatskillelse påvirkes av en rekke faktorer som inkluderer molekylvekten og polaritet av polymerene, Oppløsningenes temperatur, pH og ionisk innholdet av den vandige 1 oppløsningsmiddel, 2. Punktet der de to polymerløsninger separate bestemmes av fysiokjemiske egenskaper av den valgte fase system, men vanligvis skjer ved lave polymer konsentrasjoner (mindre enn 20% vekt / vekt) under ikke-denaturerende betingelser, slik ATPSs skal brukes for bioteknologi applikasjoner 3-9.

Langt den mest omfattende studert ATPS er polyetylenglykol (PEG) / dekstran (DEX) system. De ATPS dannet av disse billig og biokompatible polymerer ble opprinnelig beskrevet for rensing av biomolekyler ved hjelp av molekylær partisjonering 2, 10. Partisjoneringoppstår når ytterligere molekyler eller partikler som ikke bidrar til fase systemet er blandet med PEG og DEX. Basert på deres relative affiniteter for enten DEX eller PEG, vil molekyler eller partikler fortrinnsvis bor innenfor en av de to faser eller på grensesnittet. En annen egenskap ved PEG / DEX ATPS er eksistensen av grenseflatespenning mellom de to polymer faser. ATPSs dannet av PEG og DEX generelt vise grenseflatesoner spenninger som er mye lavere enn andre væske-væske tofasesystem som olje og vann, men de grenseflatespenningen strekkreftene fortsatt utøve effekter på små partikler som for eksempel virus, celler og protein aggregater 2 , 11-13. Til slutt, siden høyere molekylvekt PEG og DEX separat ved lave konsentrasjoner (mindre enn 5% vekt / vekt for høymolekylære polymerer varianter) i nærvær av fysiologiske konsentrasjoner av salter, er det få eller ingen skadelige effekter på pattedyrceller innarbeidet i disse systemer14-16.

Nylig har de grenseflatespenningen egenskaper og partisjonering effekter av ATPSs blitt brukt av vårt laboratorium for celle mønster 14, 16-20. Dette ble oppnådd ved micropatterning en tettere DEX løsning på cellekultur substrater i nærvær av PEG. Når celler blir innlemmet i PEG fasen, de utelukkes fra å komme inn DEX dråpene grunnet PEG / DEX fasegrensespenningen 20. Når celler blir mønstret i DEX fasen blir de fastholdt i overflaten av cellekultur substratet ved fasegrensespenningen og partisjonering 16, 17, 19.

I motsetning til andre metoder for celle mønster, er ATPS celle mønster lett å lære og krever bare rudimentær kunnskap om polymerer selv, og muligheten til å utføre cellekultur og bruke en micropipettor. Andre metoder for celle mønster ofte innebære spesialisert utstyr og opplæring som ikke er lett oversettes til the biovitenskap. For eksempel har noen metoder (microcontact utskrift eller blekkutskrifter) mønster celler indirekte ved å bruke mønstre av celle lim biomolekyler til en kultur substrat som senere tjene som områder for celleadhesjon 21, 22. Selv indirekte tilnærminger er nyttige for enkelte celletyper, krever de en høy grad av dyktighet og brukerens spesialisert utstyr for å fabrikkere den mønster-verktøyet, og kan mangle spesifisitet avhengig bestemt celletype / biomolekyl mønster. Alternativt, kan cellene deponeres med høy mønster spesifisitet ved hjelp av direkte mønster tilnærminger som inkluderer laminær mønster, stenciling og blekkutskrifter 23-26. Men disse teknikkene krever også bruker kunnskap og spesialutstyr, og kan skade celler under trykkeprosessen. Selv om disse metodene generelt produsere presise mønstre av celler, for celle mønster til å være et nyttig verktøy i life science, må det være kostnadseffektivt ennd enkel å implementere.

Her rapporterer vi en detaljert protokoll for å generere mønstret cellekulturer ved hjelp av ATPSs beskrevet i våre tidligere publiserte applikasjoner. Med bare micropipettors, kan brukerne lage celle eksklusjon soner eller celle øyer for migrasjon analyser. Dette oppnås ved hjelp av PEG / DEX fasegrensespenningen som enten beholder cellene i DEX fase eller utelukker celler avsatt i PEG fase fra DEX. Ved å kombinere disse to grunnleggende mønster teknikker, er det mulig å raskt generere co-kulturer av celler som for eksempel lever-fibroblast celle co-kulturer. Mønster metoder, ATPS parametere og forventede resultater er beskrevet i detalj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Fase System karakterisering: Bestemme Grenser for faseseparasjon

  1. Forbered løsninger inneholdende PEG og DEX i ønsket buffer eller cellekulturmedium som vist i figur 1 (lilla prikker) i 15 ml eller 50 ml koniske rør. Heretter vil PEG og DEX referere til 35 kD PEG og 500 kDa DEX, men vil kritiske konsentrasjoner endres avhengig av to polymerer som brukes. Registrere massen av PEG og DEX i hver løsning. Høy konsentrasjon polymerløsninger kan ta flere timer å oppløse. Virvling kan brukes for serumfrie løsninger. For medier som inneholder proteiner eller serum, plasserer rørene på en rock scenen til både polymerer er fullt oppløst. Registrere vekten av mediet som brukes til å løse opp polymerer og ta oppmerksom på de innledende konsentrasjoner.
  2. Når polymerene er fullstendig oppløst, bør løsninger vises skyet. Dette er den første indikasjon på at faseseparasjon har funnet sted. Å bekrefte dette, lapolymer-løsninger å hvile i en vertikal stilling ved romtemperatur i 20 min. Sentrifugering ved 1000 xg kan brukes til å akselerere faseatskillelse prosessen. Den tettere bunn fase vil være DEX-rik og toppen fase vil være PEG-rik.
  3. Sakte legger ekstra buffer eller media til rørene. Små trinn bør brukes for ikke å overshoot faseatskillelse punktet.
  4. Når løsningen blir klart og ikke lenger fase skiller etter sentrifugering, har terskelen for faseseparasjon nådd. Registrere endelige vekten av røret.
  5. Bruke tidligere innspilte vektene for polymerene, sammen med den endelige vekten etter tilsetting medier, bestemme% vekt / vekt av hvert de to polymerer ved hvilken fase separasjon ikke lenger forekommer.
  6. Plott disse verdiene som% vekt / vekt PEG på y-aksen og% vekt / vekt DEX på x-aksen. Dette plottet, kjent som binodal kurve, kan brukes til å bestemme terskelen konsentrasjonen for faseseparasjon for ulike concentrations av PEG / DEX i et bestemt cellekulturmedium.

2. Konfigurasjon 1: Exclusion Mønster (96-brønners plate Format)

  1. Forbered separate løsninger av 5,0% vekt / vekt PEG-og 12,8% vekt / vekt DEX i cellekulturmedium. Bruk ATPS løsninger av minst to ganger det kritiske punktet for å sikre at en ATPS gjenstår etter polymerene likevekt med hensyn til hverandre. Det er en liten mengde av fluks av DEX inn PEG-rike fase og omvendt, derfor arbeider for nær den kritiske konsentrasjonen kan resultere i tap av det fasesystem som konsentrasjoner falle under kritisk punkt. Likeledes kan overføre cellekultur parabolen til en fuktighet-og temperaturkontrollert inkubator alter Det tofasede egenskaper og gjøre de to løsningene blandbar. Merk: Noen celler kan gi bedre resultater med andre ATPS formuleringer. Akseptable formuleringer kan bli valgt basert på de binodal kurvene fastsatt fra del 1.
  2. Høste cellene som skal brukes for uttrekk patterning. Bestem det totale antallet / konsentrasjon av celler tilgjengelig. Valgfritt: merke cellene med CellTracker eller andre ikke-cytotoksiske etiketter for fluorescens mikroskopi.
  3. Pellet cellene og resuspender pelleten i et egnet volum av 5,0% PEG for å oppnå ønsket antall celler for uttrekk. For eksempel krever en brønn av en 96-brønns plate 37 500 fibroblastceller skal resuspenderes i 200 pl av PEG for å produsere konfluens følgende dagen. Skalere disse tallene som passer for andre celletyper og kultur substrat størrelser.
  4. Ved hjelp av en micropipettor, dispensere 0,5 pl dråper av DEX på en tørr celle kultur underlaget. Større volum dråper produsere større eksklusjon soner. Dråper varierer i størrelse 0,1 til 1 pl anbefales for utelukkelse micropatterning. Valgfritt: DEX dråpene kan deponeres 24 hr forhånd og tillatt å dehydrere ved romtemperatur. Dette kan produsere renere mønstre.
  5. Dispenser 200fil av PEG cellesuspensjon inn than godt til å dekke DEX dråper.
  6. Plasser i en fuktet inkubator i 12 timer ved 37 ° C, 5% CO 2. Pass på at parabolen ikke vippes under håndtering og at den er plassert på et nivå inkubator sokkel for å unngå å forstyrre mønstre.
  7. Fjern PEG løsning og vask tre ganger med 200 ul kulturmedium.
  8. Legg frisk kultur medium og gå tilbake til inkubatoren.
  9. Overvåke kulturene jevne å observere cellebevegelse inn eksklusjon sonen.

3. Konfigurasjon 2: Island Mønster (96-brønners plate Format)

  1. Forbered løsninger av 5,0% vekt / vekt PEG-og 12,8% vekt / vekt DEX i cellekulturmedium, som ovenfor.
  2. Høste cellene som skal brukes for øya mønster. Bestem det totale antallet / konsentrasjon av celler tilgjengelig.
  3. Pellet og resuspender cellene i et egnet volum av 12,8% DEX å oppnå den ønskede konsentrasjon av celler for øya mønster. Konsentrasjoner av 5000 ceLLS / ul eller mindre er anbefalt for sterkt tilhenger celletyper. For celler som har problemer med å feste eller celler som løst overholder, konsentrasjoner på opp til 10.000 celler / mikroliter kan vurderes.
  4. Arbeider raskt for å unngå uttørring, pipette 0,5 ul dråper av DEX på en tørr cellekultur substrat, som beskrevet ovenfor. Ikke la dråpene tørke. Valgfritt: 200 ul av PEG løsning kan tilsettes til brønnen på forhånd. DEX dråpene kan deretter bli satt inn i PEG-løsning hvor de vil synke til bunnen og kontakte kulturen overflaten. Dette kan produsere renere øya mønstre.
  5. Dekk DEX dråper med 200 pl PEG.
  6. Plasser i en fuktet inkubator i 12 timer ved 37 ° C, 5% CO 2. Pass på at parabolen ikke vippes under håndtering og at den er plassert på et nivå inkubator sokkel for å unngå å forstyrre mønstre.
  7. Fjern PEG løsning og vask tre ganger med 200 ul kulturmedium.
  8. Legg frisk kulturmedium og tilbake til inkubatoren.
  9. Overvåke kulturer jevne mellomrom for å observere celle bevegelse og spredning utover fra øyene.

4. Konfigurasjon 3: Utestenging Co-kulturer (96-brønners plate Format)

  1. Forbered løsninger av 5,0% vekt / vekt PEG-og 12,8% vekt / vekt DEX i cellekulturmedium, som ovenfor.
  2. Høste cellene som skal brukes for uttrekk og øya mønster. Bestemme det totale antallet / konsentrasjon av celler tilgjengelig for hver celletype. Valgfritt: Noen celle motstandere kan vise dramatisk forskjellige spredning indekser. For å hindre at ekskluderte celler fra overpopulating øya mønstrede celler (spesielt for langsiktige kulturer), behandle celler brukes for utelukkelse med mitomycin C i 2 timer eller strålebehandling dem før høsting. Dette vil forhindre spredning. Fluorescent CellTracker fargestoffer kan brukes til å skille de to cellepopulasjoner om nødvendig.
  3. Pellet cellene og resuspender pelleten for exclusion patterning i et egnet volum av 5,0% PEG for å oppnå ønsket antall celler, som ovenfor. Resuspender pelleten for øya patterning i et egnet volum av 12,8% DEX å oppnå den ønskede konsentrasjon av celler, som ovenfor.
  4. Ved hjelp av en micropipettor, dispensere 0,5 ul dråper av DEX cellesuspensjon på en tørr cellekultur substrat. Ikke la dråpene tørke.
  5. Dekk DEX dråper med 200 pl PEG cellesuspensjonen.
  6. Plasser i en fuktet inkubator i 12 timer ved 37 ° C, 5% CO 2. Pass på at parabolen ikke vippes under håndtering og at den er plassert på et nivå inkubator sokkel for å unngå å forstyrre mønstre.
  7. Fjern PEG løsning og vask tre ganger i 200 ul kulturmedium.
  8. Legg frisk kultur medium og gå tilbake til inkubatoren.
  9. Overvåke co-kulturer å observere samspill mellom celle populasjoner. Valgfrie: Kontrollene kan være forberedt ved å utføre eksklusjon eller øy mønster individually, av co-kultur som ikke interagerer og ved å blokkere trasé av interesse i en eller begge cellepopulasjoner før eller etter mønster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Å velge en passende kombinasjon av PEG og DEX for celle mønster er det viktig å bestemme binodal kurven. Denne kurven delineates de punkter hvor en ATPS kan form og kan variere for et gitt sett av polymerer basert på temperatur, pH og ionisk innhold. For dyrking celler som krever tilpassede medium formuleringer kan det være nødvendig for å eksperimentelt bestemme binodal kurve. Dette oppnås ved å generere en serie av ATPSs som er langt fra den binodal og varierende i deres PEG og DEX innholdet (Figur 1, lilla sirkler). Når en ATPS er til stede, vil polymerløsninger vises skyet når de blandes, og vil stabilisere seg i separate faser hvis venstre uforstyrret. Ved å legge ekstra oppløsningsmiddel til polymeren blandingen vil ATPS nærmer 0% PEG / 0% DEX. På et tidspunkt, vil blandingen ikke lenger fase separat. PEG / DEX konsentrasjon der dette skjer representerer et punkt på kurven binodal; ovenfor det punktet en ATPS kan danne og under dette punktet kan det ikke. Kurvene i Figur 1 representerer binodals for tre vanlige cellekulturmedier med og uten 10% føtalt bovint serum (FBS). Konsentrasjonene på som et ATPS dannes er litt høyere i nærvær av FBS.

I våre tidligere rapporter har vi brukt ATPSs basert på et kritisk punkt (punktet på binodal der like volumer av PEG og DEX form etter likevekt) med 2,5% PEG 35 kDa/3.2% DEX 500 kDa. Resultatene fra våre binodal data er i umiddelbar nærhet til dette kritiske punktet verdi. Vi testet ni fasesystem kombinasjoner for mønster, som vist i Tabell 1. Siden rene løsninger av PEG og DEX likevekt med hensyn til deres polymer konsentrasjoner etter at de er kombinert, noen av disse løsningene ikke danne stabile ATPSs, og var derfor ikke nyttig for mønstring (tabell 1a, x merkene). Andre polymerkombinasjoner produsert gjenkjennelige mønstre, Men var ikke ensartet nok for eksperimentering (tabell 1a x / ✓ merker). Nyttige polymer formuleringer dannet eksklusjon soner eller øyer som var nesten blottet for celler i de ikke-mønstrede regioner (Tabell 1a, ✓ merker).

Med 10% PEG, la vi merke til at cellemorfologi var unormalt runde og spindel-lignende etter 24 timer, med celler som viser en redusert evne til å feste til kultur overflaten (Tabell 1b, x merker). Morfologi og vedlegg var normalt for 2,5% og 5% PEG (Tabell 1b, ✓ merker). Vi observerte at serum utfelt fra kultur medium ved høye PEG konsentrasjoner (Tabell 1c, x merker), noe som tyder på at unormal celle morfologi og vedlegg i 10% PEG kan være relatert til problemer med serum-tilgang. Tillegg er PEG kjent for å forstyrre plasmamembraner 27. Selv om disse effekter er kun observert ved høye konsentrasjoner av molecular vekt PEG, er det best å bruke den laveste PEG konsentrasjon som produserer pålitelig mønster.

Samsvar med våre tidligere rapporter, konkluderte vi med at 5% PEG/6.4% DEX og 5% PEG/12.8% DEX var godt egnet for celle mønster, med 12,8% DEX produsere mer ensartede mønstre. Forventede resultater for tre mønster formater ved hjelp Cell Tracker-merkede HeLa-celler er vist i figur 2. Ved å følge hver mønster tilnærming, er det mulig å skape ensartede mønstre av hver type, med svært få celler utenom de mønstrede områder.

Bruke eksklusjon og øya mønster er det mulig å vurdere proliferasjonen og migreringen av mønstrede celler (figur 3). I løpet av tre dager, fylt HeLa celler utelukkelse soner (figur 3a-c). Øy-mønstrede celler utvidet utover fra de innledende mønstre (Tall 3d-f). Disse endringene kan kvantifiseres ved hjelpstandard imageJ måleverktøy (Tall 3 c, f). Det er viktig å merke seg at når flere cellepopulasjoner er co-kultivert (figur 2, Format 3), kan en cellepopulasjon ut-spredning og erstatte den andre. Utelukkelse mønster og øya mønster kan være nyttige verktøy for å vurdere om dette vil være et problem. I situasjoner hvor dramatiske forskjeller i spredning indeks oppstå, er det anbefalt at en cellepopulasjon behandles ved bestråling eller kjemiske faktorer å begrense spredning. Dette er spesielt nyttig i situasjoner hvor en celletype brukes som en støtte-cellen i et langsommere voksende mer følsom celletype.

Vi demonstrert dette prinsippet ved å dyrke HepG2 celler, en leverkreft cellelinje som vanligvis brukes til å modellere hepatocytter biologi, med NIH 3T3 fibroblast som ble arrestert med mitomycin C (figur 4). Over tid, HepG2 cellene opprettholde sin lokalisering end koloni form (figur 4a). Ved å plassere mange dråper i samme plate og omgi dem med fibroblaster er det mulig å dyrke disse cellene i et format som er potensielt nyttig for multipleksede studier (figur 4b). Cell island monokulturer kan brukes med dette formatet som en kontroll for påvirkning av parakrine faktorer (figur 4c).

Figur 1
Figur 1. Den polymer konsentrasjoner ved hvilken en ATPS kan danne kan ekstrapoleres fra eksperimentelt bestemte binodal kurver. Denne binodal kurve ble konstruert ved hjelp av blakningspunkt metoden ved å legge ytterligere oppløsningsmiddel for å måle de punkter hvor to-fase blandinger av varierende PEG / DEX-konsentrasjoner (lilla sirkler) ikke lenger var i stand til fase separating. Binodals ble bestemt for DMEM, F12 og RPMI med og uten serum. Datapunkter ble utstyrt med en tre parameter rasjonell funksjon. N = 3 for hvert datapunkt.

Figur 2
Figur 2. Ved dispensering ATPS løsninger bort polystyren plater, kan tre formater for celle patterning bli produsert. Prosedyren begynner ved å pipettere DEX dråper a) som deretter belagt med PEG b). Når cellene feste, kan ATPS løsningene vaskes bort og erstattet med dyrkingsmedium (c, d). Fluorescens bilder for monokulturer var farget med CellTracker fargestoffer etter mønster. For co-kulturer, ble cellene farget separat med CellTracker fargestoffer før mønster. HeLa-celler ble brukt til å generere alle tre kultur formater. Figur 3
Figur 3. Utelukkelse mønster og øya mønster kan brukes til å vurdere cellemigrering og proliferasjon. A) Eksklusjonskriterier mønstrede HeLa celler 1 dag etter mønster. B) Utelukkelse mønstrede HeLa celler 3 dager etter mønster. C) celler som sprer og migrere, betydelig redusere størrelsen på eksklusjon sonen. d) Island-mønstrede HeLa celler en dag etter mønster. e) Island-mønstrede HeLa celler tre dager etter mønster. f) Celler sprer og migrere utover, vesentlig utvide størrelsen på øya. Bilder ble kvantifisert ved hjelp ImageJ programvare for å måle celle clearing og celle øya områder før og etter overføringen. Søylene representerer mener± SEM av minst tre uavhengige observasjoner.

Figur 4
Figur 4. Leveren celle / fibroblast kulturer kan være generert ved hjelp ATPS eksklusjon co-kultur mønster. A) Disse koloniene opprettholde sin organisasjon i minst 4 dager i kultur. B) Flere øyer kan kledd i en enkelt tallerken med potensial for multiplekset eller high-throughput analyser. c) sammenlignet med ikke-co-kulturperler øya mønstre, co-dyrkede celler viser litt høyere nivåer av albumin produksjon (brune flekker) som fremgår av kvalitativ sammenligning av albumin farget co-kulturer versus monokulturer. Albumin er et protein produsert av leverceller. Derfor antyder dette resultatet at funksjonen av leverceller forsterkes ved samtidig dyrket med fibroblast hjelp ATPS.

a) mønster dannet DEX 3,2% DEX 6,4% DEX 12,8%
PEG 2,5% x x x
PEG 5,0% x / ✓
PEG 10,0% x / ✓
b) Morfologi DEX 3,2% DEX 6,4% DEX 12,8%
PEG 2,5%
PEG 5,0% & # X2713;
PEG 10,0% x x x
c) Serum Nedbør DEX 3,2% DEX 6,4% DEX 12,8%
PEG 2,5%
PEG 5,0%
PEG 10,0% x x x

Tabell 1. A) ATPS formuleringer som kan brukes for mønstring angis med Hakene, de som ikke kan angis med x merkene. B) Formuleringer som beholder normal cellemorfologi og festepunk egenskaper angis by haker, de som ikke kan vises med x karakterer. c) formuleringer som resulterte i utfelling av serumproteiner er merket med X Marks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den ATPS celle micropatterning metoden krever svært lite kompetanse utover ferdigheter i cellekultur teknikker og kan raskt mestret. Fordelene med denne fremgangsmåten er at det er billig, hurtig og er kompatibel med en rekke celletyper og kultur formater. Av disse grunner, bør vår protokoll lett vedtatt av livet forskere, spesielt de som studerer celle proliferasjon, migrasjon og chemotaxis, og påvirkning av juxtacrine og parakrine samspill mellom celle populasjoner. Analysene som presenteres her kan lett kvantifiseres på cellen befolkningsnivå ved hjelp av standard bildeanalyse prosedyrer tilgjengelig i programvare som ImageJ.

For å generere konsistente mønstre anbefaler vi følgende forholdsregler. Først, bør pipettespissen brukes til å dispensere DEX løsningen endres etter hvert DEX dråpe er avsatt til å gi mer konsistente dråpe volumer. Siden DEX løsningen er forholdsvis viskøs, Er det også viktig å unngå deponering overflødig DEX som kan være tilstede på den ytre overflaten av pipettespissen, og for å sikre at hele volumet av DEX utganger spissen. Sekund, kan dråpene flytte hvis PEG legges for kraftig eller hvis parabolen står på skrå. DEX avbrudd kan minimeres ved å holde tallerken på en plan overflate og tillater PEG løsning dekker gradvis dråpene ovenfra uten å tillate store styrker fra PEG menisken å løsne del av dråpene. Droplet avbrudd forekommer oftere med store DEX dråper, så dråper på 0,5 pl eller mindre bør brukes hvis mulig. Bortsett fra disse tekniske problemer involvert med utlevering løsningene, er det svært få fallgruvene forbundet med denne teknikken, forutsatt at hensiktsmessige polymer molekylvekt og konsentrasjoner brukes.

Selv ATPS mønster kan enkelt utføres ved hjelp av en mikropipette (som presentert her), er det en rekke av mer sophisticated tilnærminger som kan brukes for å raskt generere mønstre av mer komplekse geometriske arrays (f.eks væskehåndtering roboter og akustisk dråpe ejeksjonspunkter), som presentert i våre tidligere studier 14, 15, 20. Det er også mulig å generere DEX dråper som er mye mindre i volum med pneumatisk mate DEX gjennom kapillære åpninger eller ved påvirkning en åpning i en microchannel å produsere flytende DEX dråper er skjermet av PEG 19. Disse tilnærmingene kan være av interesse for de som ønsker å produsere høy gjennomstrømming eller multipleksede co-kultur eller migrasjon analyser. I tillegg, ved bruk microfluidic tilnærminger, er det mulig å utføre forsøk med en lite antall celler, eller til celler i en microchannel hvor virkningene av fluidstrøm og ren kan undersøkes. Imidlertid er disse avanserte metoder ikke nødvendig for de fleste anvendelser.

Vandig tofase-mønster av celler er enkel og lett tilpasses til en typisk cellekultur innstillingen. Denne metoden lar enhver forsker med tilgang til en typisk celle kultur lab (tilgang til en hette, CO 2 inkubator, og mikropipetter) og de ​​nevnte polymerer til reproduserbart mønster celler i monokultur og co-kultur. Vår lab har vist denne evnen ved å skrive matriser av celler for å studere celle migrasjon i en sårtilheling analysen og for å undersøke effekten av juxtacrine og paracrine signalering i differensieringen av embryonale celler 16, 17, 20. Andre metoder, som fordelingen av ekstracellulær 28 matrisen, blekkutskrifter 29 og patterning etter laminærstrømning i microfluidic enheter 25, har 26 også blitt brukt for å lokalisere celler. Disse andre metodene er effektive metoder for å oppnå veldefinerte mønstre av celler og kan ofte oppnå encellede presisjon. Men disse metodene krever også høyt spesialisert utstyr og / eller tilgang til renrom fasiliteter for å dikte stemplene brukes til print ekstracellulære matrix proteiner eller produserer MicroFluidics enheter. Deres tilknytning til strømforsyninger, sprøyte pumper og andre eksterne komponenter hindrer også deres implementering på grunn av kostnadene forbundet med utstyret og bruker ferdigheter som kreves for å betjene den.

I form av fremtidige applikasjoner forventer vi at vår metode vil være nyttig for utvikling av kultur-systemer som muliggjør høy throughput analyse av celle bevegelse og proliferasjon, samt undersøke celle-celle interaksjoner mellom flere cellepopulasjoner. Til dette punktet, har våre rapporter fokusert på å undersøke samspillet av bare noen få typer av mønstrede celler på en gang. Imidlertid kan det tenkes at flere subpopulasjoner av celler kunne dyrkes med en felles mater lag å undersøke virkningen av parakrine og juxtacrine signalisering av mange celletyper vokst sammen i en enkelt celle kultur oppsett. Endelig tissue engineering applikasjoner ofte nødvendig romlig lokalisering aven eller flere celletyper. Det kan være mulig å tilpasse vår teknikk for bruk i mønster celler for å produsere mer fysiologisk relevante vev konstruerte sykdom modeller eller mønster celler i implanterbare materialer for kliniske applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Coulter Foundation, Beyster Foundation, Undergraduate Research Opportunity (UROP) sommerprogram for ATA og en National Science Foundation Graduate Student Research Fellowship (Grant ingen DGE 0718128, ID:. 2010101926) for JBW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dextran 500,000 kDa Pharmacosmos, Denmark
Polyethylene Glycol 35,000 kDa Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
Hela ATCC, Manassas, VA
HepG2 C3A ATCC, Manassas, VA
NIH 3T3 ATCC, Manassas, VA
Cell Tracker Invitrogen, Carlsbad, CA
DMEM Gibco, Carlsbad, CA
RPMI Gibco, Carlsbad, CA
F12 Gibco, Carlsbad, CA
Fetal Bovine Serum Gibco, Carlsbad, CA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hatti-Kaul, R. Aqueous two-phase systems : methods and protocols. Methods in biotechnology. xiii, Humana Press. 440 (2000).
  2. Albertsson, P. A. k Partition of cell particles and macromolecules: separation and purification of biomolecules, cell organelles, membranes, and cells in aqueous polymer two-phase systems and their use in biochemical analysis and biotechnology. 3rd ed, Wiley. 346 (1986).
  3. Yamada, M., et al. Continuous cell partitioning using an aqueous two-phase flow system in microfluidic devices. Biotechnol. Bioeng. 88, (4), 489-494 (2004).
  4. Soohoo, J. R., Walker, G. M. Microfluidic aqueous two phase system for leukocyte concentration from whole blood. Biomed. Microdevices. 11, (2), 323-329 (2009).
  5. Hahn, T., Hardt, S. Concentration and size separation of DNA samples at liquid-liquid interfaces. Anal. Chem. 83, (14), 5476-5479 (2011).
  6. Hatti-Kaul, R. Aqueous two-phase systems. A general overview. Mol. Biotechnol. 19, (3), 269-277 (2001).
  7. Hustedt, H., Kroner, K. H., Menge, U., Kula, M. -R. Protein recovery using two-phase systems. Trends in Biotechnology. 3, (6), 139-144 (1985).
  8. Keating, C. D. Aqueous Phase Separation as a Possible Route to Compartmentalization of Biological Molecules. Acc Chem. Res. 45, (12), 2114-2124 (2012).
  9. Helfrich, M. R., et al. Partitioning and assembly of metal particles and their bioconjugates in aqueous two-phase systems. Langmuir. 21, (18), 8478-8486 (2005).
  10. Diamond, A. D., Hsu, J. T. Prote. Partitioning in PEG/Dextran Aqueous Two-Phase Systems. AIChE Journal. 36, (7), 1017-1024 (1990).
  11. Y-T,, Zhu, Z. -Q. Modeling of interfacial tension of aqueous two-phase systems. Chemical Engineering Science. 54, (4), 433-440 (1999).
  12. Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. Concentration dependence of the interfacial tension for aqueous two-phase polymer solutions of dextran and polyethylene glycol. Langmuir. 28, (8), 3831-3839 (2012).
  13. Rha, C. Interfacial Tension of Polyethylene Glycol/Potassium Phosphate Aqueous Two-Phase Systems. Physics and Chemistry of Liquids: An International Journal. 38, (1), 25-34 (2000).
  14. Fang, Y., et al. Rapid Generation of Multiplexed Cell Cocultures Using Acoustic Droplet Ejection Followed by Aqueous Two-Phase Exclusion Patterning. Tissue Eng. Part C. Methods. 18, (9), 647-657 (2012).
  15. Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, (9), 736-741 (2009).
  16. Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, (24), 2628-2631 (2010).
  17. Tavana, H., et al. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. (2011).
  18. Tavana, H., Takayama, S. Aqueous biphasic microprinting approach to tissue engineering. Biomicrofluidics. 5, (1), 13404 (2011).
  19. Frampton, J. P., et al. Precisely targeted delivery of cells and biomolecules within microchannels using aqueous two-phase systems. Biomed. Microdevices. 13, (6), 1043-1051 (2011).
  20. Hossein Tavana, K. K., Bersano-Begey, T., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Rehydration of Polymeric, Aqueous, Biphasic System Facilitates High Throughput Cell Exclusion Patterning for Cell Migration Studies. Advanced Functional Materials. 21, (15), 2920-2926 (2011).
  21. Falconnet, D., et al. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27, (16), 3044-3063 (2006).
  22. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Eng. 13, (8), 1879-1891 (2007).
  23. Ringeisen, B. R., et al. Jet-based methods to print living cells. Biotechnol. J. 1, (9), 930-948 (2006).
  24. Wright, D., et al. Generation of static and dynamic patterned co-cultures using microfabricated parylene-C stencils. Lab Chip. 7, (10), 1272-1279 (2007).
  25. Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, (10), 5545-5548 (1999).
  26. Berthier, E., et al. Pipette-friendly laminar flow patterning for cell-based assays. Lab Chip. 11, (12), 2060-2065 (2011).
  27. Davidson, R. L., O'Malley, K. A., Wheeler, T. B. Polyethylene glycol-induced mammalian cell hybridization: effect of polyethylene glycol molecular weight and concentration. Somatic Cell Genet. 2, (3), 271-280 (1976).
  28. Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
  29. Moon, S., Lin, P., Keles, H. O., Yoo, S., Demirci, U. Title Cell Encapsulation by Droplets. J. Vis. Exp. (8), e316 (2007).
Cell Co-kultur Mønster med vandig tofasesystemer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems. J. Vis. Exp. (73), e50304, doi:10.3791/50304 (2013).More

Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems. J. Vis. Exp. (73), e50304, doi:10.3791/50304 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter