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Neuroscience

एक चोट की जांच केंद्रीय तंत्रिका तंत्र मरम्मत प्रतिमान Published: March 28, 2013 doi: 10.3791/50306
Automatic Translation
1, 1
1Neurodevelopment Group, School of Biosciences, University of Birmingham

Summary

एक चोट ड्रोसोफिला लार्वा वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड का उपयोग करने के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के उत्थान और मरम्मत की जांच प्रतिमान वर्णित है. समय चूक और निश्चित नमूनों में confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर, उद्देश्यपूर्ण विकसित सॉफ्टवेयर और आनुवंशिकी के साथ मात्रात्मक विश्लेषण के साथ संयुक्त, छुरा CNS उत्थान और मरम्मत के आणविक तंत्र की जांच करने के लिए किया जाता है.

Abstract

एक प्रयोगात्मक विधि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) प्रणाली चोट फल मक्खी ड्रोसोफिला का उपयोग करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए विकसित किया गया है. समझ और पशुओं में मरम्मत के उत्थान के जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण सवाल है. क्षतिग्रस्त मानव सीएनएस को पुनर्जीवित नहीं है, और समझ कैसे पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए एक चिकित्सा तंत्रिका विज्ञान के मुख्य लक्ष्यों में से एक है. ड्रोसोफिला की शक्तिशाली आनुवंशिक टूलकिट CNS उत्थान की समस्या से निपटने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

CNS उदरीय तंत्रिका कॉर्ड (VNC, हड्डीवाला रीढ़ की हड्डी के बराबर) के लिए एक घाव स्वयं एक टंगस्टन सुई के साथ लागू किया जाता है. VNC बाद में समय चूक में फिल्माया जा सकता है और 24 घंटे के लिए स्कैनिंग लेजर confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए समय पर घाव के विकास का पालन करें. वैकल्पिक रूप से, यह संवर्धित किया जा सकता है तो तय है और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ न्यूरॉन और glial कोशिकाओं कल्पना immunofluorescence का उपयोग दाग. उपयुक्त मार्कर का उपयोग, चाचोट का एक परिणाम के रूप में सेल आकारिकी और सेल राज्य में nges देखे जा सकते हैं. ImageJ और जानबूझकर विकसित प्लग इन, मात्रात्मक और सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है समय और सेल प्रसार और कोशिका मृत्यु में चोट के प्रभाव पर घाव के आकार में परिवर्तन को मापने के. बड़े नमूना आकार के इन तरीकों विश्लेषण की अनुमति देते हैं. वे ड्रोसोफिला की शक्तिशाली आनुवंशिकी के आणविक CNS उत्थान और मरम्मत अंतर्निहित तंत्र की जांच के साथ जोड़ा जा सकता है.

Introduction

पशुओं में पुनर्जनन यह पता चलता है कि जब जीव विकास का आदेश दिया है और पूरा कोशिकाओं भावना, और कैसे एक जीव की संरचनात्मक अखंडता हासिल की है और बनाए रखा है. कोशिकाओं के इन रहस्यमय क्षमताओं को समझना जीव विज्ञान में बहुत रुचि है. पुनर्जनन को बढ़ावा देने चिकित्सा तंत्रिका विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्यों में से एक है. मनुष्यों में क्षतिग्रस्त केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) पुनर्जीवित नहीं करता है. रीढ़ की हड्डी में चोट के कृंतक मॉडल समझने के लिए कैसे कोशिकाओं को चोट करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि, नैतिक चिंताओं, उच्च लागत और धीमी गति से पशुओं के जीवन चक्र प्रगति विवश.

फल मक्खी ड्रोसोफिला विकासात्मक जीव विज्ञान और तंत्रिका विज्ञान में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल जीव है. अपने शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों और कम जीवन चक्र के लिए धन्यवाद, ड्रोसोफिला recurrently जीन मानव और रोग की समझ के लिए प्रासंगिकता के साथ और कार्यों जीन नेटवर्क की खोज करने के लिए प्रेरित किया है. विकासवादी चुनाव के प्रचुर मात्रा में सबूत हैमनुष्य के लिए मक्खियों से जीन समारोह की servation.

हाल के वर्षों में, तंत्रिका तंत्र की चोट के लिए कई मानदंड ड्रोसोफिला में स्थापित किया गया है. कुछ हानिकारक परिधीय नसों है कि विंग या एक संवेदी और मोटर axons 2 सहित परिधीय नसों के axotomy साथ चलाने के मिलकर बनता है. हालांकि, परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका प्रणाली को कई मायनों में अलग है, और यह सर्वविदित है कि कई जानवरों में परिधीय तंत्रिका तंत्र CNS नहीं कर सकते हैं जबकि पुनर्जीवित कर सकते हैं. इस प्रकार, CNS के लिए CNS उत्थान, प्रत्यक्ष चोट को समझने के लिए अधिक उपयुक्त है. एक सुई के साथ छुरा चोट सफलतापूर्वक ड्रोसोफिला वयस्क मस्तिष्क के लिए लागू किया गया है 3,4 चोट के जवाब की जांच की. एक और दृष्टिकोण का प्रयोग, अयाज एट अल कटे सुसंस्कृत वयस्क दिमाग में एक Piezo शक्ति microdissector के साथ CNS axons, और 4 5 दिनों के लिए उनके उत्थान का विश्लेषण किया. बाद में इन प्रयोगात्मक सेट यू के लाभps है कि वे दिमाग है, जो बेशक महान ब्याज की है पर ध्यान केंद्रित है. नुकसान यह है कि मस्तिष्क VNC, जो मोटर और संवेदी नियंत्रण के साथ ही सौदों की तुलना में एक बहुत अधिक जटिल है. वयस्क दिमाग पर कार्य करना भी अधिक समय लगता है. लार्वा 4 दिनों में प्रयोगों के लिए तैयार है, जबकि यह वयस्क eclosion के लिए 10 दिनों के बारे में लेता है, और फिर उनकी परिपक्वता के लिए अतिरिक्त 5 दिनों. वयस्क मस्तिष्क भी अधिक संभालना मुश्किल है, क्योंकि यह मोटी छल्ली, जो को दूर करने के लिए मुश्किल है में समझाया है. VNC कार्यात्मक हड्डीवाला रीढ़ की हड्डी के बराबर किया जा रहा है की आगे आकर्षण है.

ड्रोसोफिला लार्वा व्यापक रूप से 6-9 तंत्रिका विज्ञान के लिए एक मॉडल जीव के रूप में प्रयोग किया जाता है. हालांकि सख्ती से लार्वा बोल एक विकास के चरण में है, यह भी एक पूरी तरह कार्यात्मक जानवर माना जा सकता है. लार्वा हरकत, स्वाद, गंध और nociception, और सीखने और स्मृति सहित कई होश है. इस प्रकार, लार्वा VNC wCNS चोट के लिए आदर्श मॉडल के रूप में चुना है.

लारवल और पोटा संबंधी VNCs और dissected किया जा सकता है सुसंस्कृत डिश में अभी भी 24 10 घंटा के लिए सेलुलर अखंडता को बनाए रखना है. यह सुझाव दिया है कि चोट VNC, जो तब के लिए समय व्यतीत हो जाने में समय की इस अवधि से अधिक दर्ज किया जा सकता, या सभ्य और किसी भी इस अवधि के भीतर वांछित समय बिंदु पर तय करने के लिए लागू किया जा सकता है.

यहाँ, हम CNS चोट ड्रोसोफिला लार्वा VNC के प्रयोग के लिए एक प्रयोगात्मक प्रतिमान उपस्थित थे. VNC 1 लार्वा से dissected है, और छुरा चोट स्वयं एक टंगस्टन सुई के साथ लागू किया जाता है. VNC तो एक गिलास नीचे coverslip पर रखा जाता है, और समय चूक स्कैनिंग लेजर confocal माइक्रोस्कोपी के साथ फिल्माया. वैकल्पिक रूप से, VNCs समय का एक वांछित अवधि के लिए संवर्धित किया जा सकता है, और चोट के सेलुलर प्रभाव निश्चित immunostaining और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग नमूनों में विश्लेषण किया जा सकता है. घाव क्षेत्र, मापा जा सकता है और सेल परमाणु के मात्रात्मक विश्लेषणmber (सेल प्रसार और कोशिका मृत्यु) जानबूझकर विकसित सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है. बड़े नमूना आकार को आसानी से संभाला जा सकता है सांख्यिकीय मान्य परिणामों में जिसके परिणामस्वरूप. इन तरीकों में सफलतापूर्वक किया गया है ड्रोसोफिला की शक्तिशाली आनुवंशिकी के साथ संयुक्त करने के लिए एक जीन glial CNS 11 चोट पुनर्योजी प्रतिक्रिया अंतर्निहित नेटवर्क खोज.

Protocol

1. लार्वा का संग्रह मंचन

  1. प्लेस एक बेलनाकार Perspex पिंजरे में 15 महिला और 15 पुरुष वयस्क मक्खियों और अगर अंगूर का रस खमीर के एक छोटे से स्कूप 25 पर 3 घंटे के लिए पेस्ट डिग्री सेल्सियस के साथ पूरक के साथ एक पेट्री डिश पर अंडे देना थाली एक दिन में 3-4 बार बदलें, और पहली थाली (/ ओ एन अंडे रखना से अर्थात्) त्यागें. यह भी पहले ही दिन से प्लेटों त्यागें. पर दूसरे दिन से, में 25 अंडे डिग्री सेल्सियस के साथ प्लेटों रखने अंडे एकत्रित करने की 7 दिनों के बाद, एक नए माता पिता मक्खियों के सेट अप के साथ शुरू करते हैं.
  2. बाद के बारे में 24 घंटा, अंडे से लार्वा हैच. Thinned तूलिका के साथ या संदंश की एक जोड़ी के साथ लार्वा hooking, अंगूर अगर से एक मानक मक्खी भोजन (10 मिलीग्राम) (चित्रा 1 ए) युक्त शीशी 35 लार्वा हस्तांतरण.
  3. 25 में 3 दिनों के लिए लार्वा (अंडे बिछाने के बाद 96 घंटा, AEL) युक्त शीशियों रखें डिग्री सेल्सियस

2. संस्कृति के लिए लारवल वेंट्रल तंत्रिका डोरियों के विच्छेदन

  1. हो साफएनसीएच और 70% इथेनॉल के साथ हाथ. 4 धुंधला हो जाना ब्लॉक, संदंश की 2 जोड़े और 70% इथेनॉल के साथ एक सुई भिगोएँ, और शुष्क हवा.
  2. निम्नलिखित मीडिया के साथ 4 धुंधला हो जाना ब्लॉक तैयार: के लिए स्वच्छ और आसुत जल (DW) के साथ एक पूल साफ लार्वा को शील्ड के 2 मिलीग्राम और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन, Ecdysone मुक्त (एम 3 पुनश्च के साथ गाया M3 कीट मध्यम के साथ एक दूसरा ) मध्यम लार्वा टुकड़े करना, M3 PS dissected उदरीय तंत्रिका डोरियों (VNCs) पूल के लिए माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ एक तिहाई, और एम 3 पुनश्च मध्यम के 2 मिलीलीटर VNCs चाकू के साथ एक चौथाई. अभिकर्मकों के सभी जाना चाहिए आरटी पूर्व गरम.
  3. 96 घंटा AEL लार्वा युक्त शीशी के लिए पानी जोड़ें. फिर, एक रंग का उपयोग करते हुए, धीरे शीशी से लार्वा के साथ एक गीला कागज तौलिया पर भोजन फैल गया. एक धुंधला DW बंद भोजन धोने वाले ब्लॉक 10 लार्वा स्थानांतरण. DW 6 बार बदलें. तो एम 3 पुनश्च मध्यम के साथ की जगह.
  4. एक धुंधला ब्लॉक M3 पुनश्च मध्यम के 2 मिलीलीटर युक्त एक लार्वा के स्थानांतरण.
  5. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत diध्यान एक लार्वा मस्तिष्क ssect मानक तरीकों 12 का उपयोग करते हुए, लेकिन ऊतकों को नुकसान को कम करने के लिए, निम्नलिखित तरीके से आगे बढ़ने से विशेष ध्यान रखना. लार्वा पृष्ठीय ओर रखें, और संदंश के 2 जोड़ी के साथ पूर्वकाल अंत (प्रत्येक हाथ में) से एक तिहाई से कम पृष्ठीय पक्ष पकड़. Whilst पूर्वकाल खंड पकड़े, दूर संदंश के साथ पीछे के अंत खींच, और epidermis आंसू. मस्तिष्क और VNC पूर्वकाल आधे के पीछे किनारे से दिखाई जानी चाहिए. ध्यान से मस्तिष्क और शरीर में वसा, पेट, और epidermis को हटाने के द्वारा VNC जटिल अलग. जब VNCs बहुत ज्यादा क्षतिग्रस्त हो रहे हैं, VNCs पूरी तरह या आंशिक रूप से भी चोट छुरा बिना पतित जाएगा. खाते में निम्न अंक ले लो:
  • पुल imaginal और वक्ष VNC से डिस्क परिधीय नसों आंसू के रूप में इस VNC नुकसान होगा या नहीं. परिधीय नसों में कटौती करने के लिए, एक दूसरे के करीब रखा संदंश के दो जोड़े के साथ परिधीय नसों पकड़, और फिर के लिए साथ नसों खींचceps. Imaginal डिस्क और मुंह भागों को नहीं छोड़ा जा सकता VNC करने के लिए संलग्न कर सकते हैं.
  • अंगूठी ग्रंथि और लसीका ग्रंथि मस्तिष्क के लिए जुड़ी छोड़ दें.
  • मस्तिष्क, जहां बहुत ज्यादा नहीं खाना निहित है निकटतम बिंदु पर पेट कट.
  1. एक P20 pipetman का उपयोग कर के साथ टिप काट और एक छोटे से चौड़ी करके, एक धुंधला ताजा एम 3 पुनश्च माध्यम युक्त ब्लॉक VNC का हस्तांतरण. VNC, 1 विंदुक स्थानांतरित ऊपर और नीचे केवल विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया मध्यम क्रम में टिप करने के लिए चिपके से VNC को रोकने से पहले.

3. ड्रोसोफिला लारवल VNC चोट छुरा

इस खंड का वर्णन कैसे VNCs छुरा चोट करने के लिए, और समय व्यतीत हो जाने के विश्लेषण और immunostaining के लिए वार - VNCs तैयार. के बाद छुरा संस्कृति शर्तों और अवधि 5 अनुभाग (समय चूक विश्लेषण के लिए) और धारा 6 (immunostaining के लिए) में वर्णित हैं.

  1. बाद पर्याप्त VNCs pooling (समय चूक के लिए 4-5और immunostaining के लिए 24 से अधिक), स्थानांतरण VNC एक साफ धुंधला हो M3 पुनश्च युक्त ब्लॉक करने के लिए.
  2. ओरिएंट VNC इतना है कि पृष्ठीय neuropile विदारक माइक्रोस्कोप (चित्रा 1 बी) के तहत दृश्य में है. यह VNCs जब ऑप्टिक lobes जुड़ी में झूठ के लिए सबसे प्राकृतिक उन्मुखीकरण है.
  3. चाकू स्वयं विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे एक टंगस्टन सुई का उपयोग, पृष्ठीय ओर से लगभग एक सही कोण पर और VNC के पेट आधे (चित्रा 1 बी) के लिए लक्ष्य है.

निम्नलिखित करने के लिए विशेष ध्यान रखना:

  • केवल एक बार चाकू.
  • सुई जब तक चाकू के कांच के नीचे हिट. हालांकि, सुई टिप नुकसान नहीं करने के लिए सावधान रहना.
  • सुई धारक के स्टेम छुरा के दौरान मध्यम नहीं छूना चाहिए.
  • विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे घाव दिखाई नहीं है.

नोट: वार चोट असंबंधित अध: पतन

प्रक्रियाछुरा घाव से VNC अलग भीतर सेलुलर अध: पतन में परिणाम कर सकते हैं. Neuropile में छेद में पतन का परिणाम है, और कभी कभी छेद गैर छुरा घोंपा नमूनों प्रांतस्था में मनाया गया है. अध: पतन neuropile व्यापक या प्रभावित अध: पतन को प्रभावित करने के साथ नमूने भी VNC सतह खारिज कर दिया जाना चाहिए. अध: पतन के रूप में पहचाना जा सकता है:

  • छाती / पार्श्व उदर छुरा के 22 घंटा, क्षेत्र में विशेष रूप से किसी न किसी सतह. चरम मामलों में, VNC protruded लग रहा है.
  • छेद या वक्ष neuropile में vacuoles, जो प्रतिदीप्ति immunostaining साथ पृष्ठभूमि संकेत में छेद के रूप में दिखाई दे सकते हैं.

4. सुई और संदंश का रखरखाव

  • नियमित जांच है कि सुई टिप काफी तेज है. सुई टिप तुला या कुंद यह कई प्रयोगों के लिए उपयोग करने के बाद हो सकता है. इस मामले में, एक Arkansas पत्थर या बराबर का उपयोग टिप पैनापन.
  • संदंश के सुझावों चाहिएपूरी तरह से पूरा करने के लिए. युक्तियों का उपयोग के साथ क्षतिग्रस्त हो सकता है. इस मामले में, एक Arkansas पत्थर या बराबर का उपयोग टिप समायोजित.

5. छुरा घोंपा VNCs की संस्कृति और समय चूक रिकॉर्डिंग

13 G9 - रहने वाले VNC, एक GFP प्रोटीन जाल लाइन है कि सभी axons लेबल में axonal neuropile कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और सभी glial कोशिकाओं (midline glia को छोड़कर) कल्पना glial repoGAL4 ड्राइवर को UASdsRed व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है S197Y 14 संवाददाता. पार G9 UASdsRedS197Y के लिए मक्खियों; repoGAL4 मक्खियों, संतान लार्वा से VNCs हरी axons और लाल glia कि ऊतक रहने में दर्ज किया जा सकता है के साथ प्राप्त कर रहे हैं.

  1. पूलिंग 4-5 VNCs बाद, स्थानांतरण 1 एक साफ धुंधला हो जाना ब्लॉक एम 3 पी एस के 2 मिलीग्राम, और VNC के पेट आधे वार युक्त VNC के रूप में धारा 3 में संकेत दिया.
  2. एक पाली एल lysin लेपित 3.5 मिमी गिलास नीचे पेट्री पकवान एम 3 के 1 मिलीलीटर युक्त छुरा घोंपा VNC स्थानांतरणपुनश्च. VNCs पृष्ठीय पक्ष नीचे रखें. धीरे VNC धक्का संदंश की एक जोड़ी के फ्लैट की ओर का उपयोग करने के लिए VNC डिश के लिए छड़ी करने के लिए अनुमति देते हैं.
  3. धीरे M3 पुनश्च 15% से 7.5% के लिए FBS की अंतिम एकाग्रता प्रतिपादन FBS 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  4. स्कैनिंग लेजर confocal माइक्रोस्कोपी छवियों का उपयोग कर मोल. VNC स्कैन, अपनी पूरी मोटाई भर में एक श्रृंखला Z अनुभाग एकत्रित. हम एक तापमान नियंत्रित पर्यावरण कक्ष के साथ एक Leica SP2 औंधा confocal खुर्दबीन इस्तेमाल किया. किसी भी बराबर confocal खुर्दबीन काम करना चाहिए, लेकिन यह स्कैनिंग के लिए सेटिंग्स के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. हमारे समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी के लिए सेटिंग के रूप में इस प्रकार थे: पर्यावरण चैम्बर के तापमान: 25 ° C, 4 बार ज़ूम के साथ 20X उद्देश्य, 512x512 पिक्सेल संकल्प के साथ स्कैनिंग मोड xyzt,, Z = 1 सुक्ष्ममापी कदम और 1 घंटे या 2 - घंटे के अंतराल.
  • Leica SP2 confocal खुर्दबीन स्कैनिंग के लिए फ़ाइल आकार में एक सीमा है. इन सेटिंग्स के साथ, 8-9 timepoints स्कैन किया जा सकता है. साथअन्य confocal सूक्ष्मदर्शी, यह करने के लिए 24 घंटे की अवधि से अधिक यानी लंबे समय के अंक के लिए छवि ढेर, अधिग्रहण संभव होना चाहिए.

6. संस्कृति और छुरा घोंपा और फिक्स्ड VNCs Immunostaining

  1. एक ऊतक 24 अच्छी तरह से संस्कृति एम 3 अच्छी तरह से प्रति PS 7.5% FBS 500 μl युक्त थाली तैयार है.
  2. एक ऊतक 24 अच्छी तरह से संस्कृति डिश के लिए अधिक से अधिक 24 VNCs के विच्छेदन दोहराएँ.
  3. टिप काट साथ pipetman P20 का उपयोग करके, पूल से 12 गैर छुरा घोंपा VNCs संस्कृति डिश हस्तांतरण, अच्छी तरह से प्रति 1 VNC के प्रयोग से.
  4. चाकू के पूल में VNCs के बाकी के रूप में धारा 3 में वर्णित है. एक एक अच्छी तरह से प्रत्येक छुरा घोंपा VNC स्थानांतरण.
  5. एक वांछित अवधि के लिए प्रयोग के आधार पर 24-अच्छी तरह से 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पकवान प्लेस. सेल अखंडता को कम से कम 24 घंटे के लिए अनछुए है.
  6. संस्कृति के बाद, टिप काट साथ pipetman P20 का उपयोग करके 4% एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में formaldehyde पीईएम के 250 μl में 12 VNCs हस्तांतरण. फिर, fixative सावधानी से pipetted है, देखभाल लिए VNCs नुकसान नहीं है. लगानेवाला करने के लिए नमूनों को कवर करने के लिए पर्याप्त की एक छोटी राशि प्रत्येक ट्यूब में रहना चाहिए. बाद में, ताजा लगानेवाला जोड़ने के लिए, और धीरे आरटी पर 50 मिनट के लिए आंदोलन.
  7. 0.3% Triton एक्स पीबीएस के साथ 2 बार कुल्ला, और फिर 0.3% पर Triton एक्स आरटी पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए 2 बार धोने.
  8. आरटी पर 1 घंटा के लिए 10% 0.3% Triton एक्स पीबीएस में सामान्य बकरी सीरम के साथ incubating द्वारा ब्लॉक VNCs. नमूने में कम से कम एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  9. 20 से अधिक घंटे के लिए 4 में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ VNCs सेते डिग्री सेल्सियस
  10. 0.3% Triton एक्स पीबीएस के साथ 2 बार कुल्ला, तो 0.3% पर Triton एक्स आरटी पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए 3 बार धो लो.
  11. 4 में अधिक से अधिक 16 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ VNCs सेते डिग्री सेल्सियस
  12. 0.3% Triton एक्स पीबीएस के साथ 2 बार कुल्ला, तो कमरे आरटी में 0.3% Triton एक्स पीबीएस के साथ 10 मिनट (अगर फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग अंधेरे में) के लिए 3 बार धो लो.
  13. 50% कम से कम एक के लिए पीबीएस: 50% ग्लिसरॉल के साथ PBS बदलेंघंटे.
  14. फिर 80% ग्लिसरॉल साथ बदलें: कम से कम एक घंटे के लिए 20% पीबीएस.
  15. एक माइक्रोस्कोपी गिलास स्लाइड पर वायलनचेलो टेप के 2 परतों (लगभग 0.06 मिमी) पर किए गए एक खिड़की में एक VNC माउंट. उन्मुखीकरण समायोजित, और खिड़की पर एक coverslip (18x18 मिमी) जगह. दो VNCs इस पद्धति का उपयोग करके स्लाइड पर रखा जा सकता है.

प्राथमिक एंटीबॉडी के एक किस्म का उपयोग, विभिन्न सेलुलर प्रतिक्रियाओं (जैसे सेल नंबर और सेल आकार में परिवर्तन) विश्लेषण किया जा सकता है और चोट करने के लिए.

7. ImageJ और plugins की एक रेंज का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण

यदि VNC असंबंधित अध: पतन छुरा नहीं है, घाव आकार की परवाह किए बिना विश्लेषण के लिए नमूना में गिना जाना चाहिए. घाव आकार के रूप में छुरा मैन्युअल रूप से किया जाता है, हर बार अलग है. सांख्यिकीय छुरा, जब भी संभव हो के प्रभाव का विश्लेषण इस प्रकार यह महत्वपूर्ण है.

  1. आकार माप घाव. घाव के आकार 15 की मरम्मत की सूचक है.छुरा घाव GFP अभिव्यक्ति से विहीन के रूप में दिख रहा है. घाव क्षेत्र चूक आज़ादी से उपलब्ध ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा मापा जा सकता है, के रूप में इस प्रकार है:
    1. ImageJ का प्रयोग, "फाइल" मेनू से confocal छवियों के एक ढेर को खोलने के लिए, "आयात" और यहाँ से "छवि अनुक्रम" का चयन करें का चयन करें. यह एक ढेर में व्यक्तिगत छवियों के संग्रह को बंद हो जाएगा.
    2. अगला एक "Hyperstack" में "छवि" मेनू करने के लिए जा रहा द्वारा "ढेर" बदलने के लिए, "Hyperstack" का चयन करें, तो चुनें "Hyperstack ढेर".
    3. "छवि" मेनू से "गुण" का उपयोग करके voxel आकार सेट. Leica SP2 confocal खुर्दबीन का उपयोग डेटा में हासिल कर ली है, voxel आकार स्कैनिंग सॉफ्टवेयर से प्राप्त किया जा सकता है, और छवियों के साथ एक साथ मेटाडाटा पाठ फ़ाइल से बचाया. हमारे रूप में धारा 3 में वर्णित सेटिंग के साथ, पिक्सेल आयाम xy = 0.३६६२११ सुक्ष्ममापी और z = .९९,७०९ सुक्ष्ममापी हैं.
    4. एक समय बिंदु में सभी स्लाइस की जांच करके, बहुभुज चयन उपकरण पट्टी में उपकरण के साथ घाव क्षेत्र की अधिकतम रूपरेखा आकर्षित. यह वह जगह हैब्याज के क्षेत्र (आरओआई).
    5. आरओआई प्रबंधक "विश्लेषण" मेनू के लिए जा रहा ROI जोड़ें, नीचे स्क्रॉल और "उपकरण", तो "आरओआई प्रबंधक", फिर "जोड़ें" का चयन करें.
    6. हर समय अंक के लिए इस दोहराएँ.
    7. प्रत्येक रॉय के क्षेत्र आकार प्राप्त आरओआई प्रबंधक में "उपाय" बटन पर क्लिक करें.
  2. VNC आंदोलन के समय चूक रिकॉर्डिंग के दौरान सुधार. है "Stackreg" और "Turboreg" 16 plugins (ImageJ वेबसाइट से http://rsbweb.nih.gov/ij/ ): इन plugins समय व्यतीत हो जाने के दौरान छोटा सा नमूना आंदोलनों को सही करने की अनुमति. सभी समय अंक के माध्यम से एक बराबर प्रतिनिधि ऑप्टिकल अनुभाग के साथ एक ढेर और निर्माण plugins लागू होते हैं. यह समय पर घाव कैसे परिवर्तन कल्पना करने में मदद करता है. इन तरीकों और अनुदेश मैनुअल पर जानकारी अनुसंधान समूह है कि इन plugins विकसित से उपलब्ध हैं. ( http://bigwww.epfl.cएच / / thevenaz stackreg /).
  3. Glial कोशिकाओं के स्वचालित गिनती. DeadEasy glia "(प्लगइन www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ): इस ड्रोसोफिला लार्वा VNC में रेपो पॉजिटिव glial कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए और glial में परिवर्तन की जांच करने के लिए विकसित किया गया था संख्या 17 चोट छुरा की वजह से. प्लग में सही 0.1% झूठी सकारात्मक और 4.3% झूठी नकारात्मक 17 के एक त्रुटि के साथ काम करता है. इस प्लग में, 1 लेबल विरोधी रेपो एंटीबॉडी के साथ immunofluorescence का उपयोग नमूना में सभी glia (midline को छोड़कर) का उपयोग करें. तो प्लग स्थापित ImageJ में confocal छवियों का एक ढेर खोलने और प्लग में चलाते हैं. यह glial कोशिकाओं स्वचालित रूप से मायने रखता है के बारे में 30 सेकंड में.
  4. स्वचालित apoptotic कोशिकाओं की गिनती. "DeadEasy कस्पासे लार्वा प्लग में ( www.bioscienc) es-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html 18: यह विरोधी cleaved - Caspase3 साथ लेबल की कोशिकाओं की संख्या गिनने के लिए विकसित किया गया था, और एक नए संस्करण के लार्वा VNCs लिए अनुकूलित किया गया था. चोट छुरा क्रमादेशित कोशिका मृत्यु 11 में वृद्धि का कारण बनता है. इस प्लग में, विरोधी cleaved कस्पासे 3 एंटीबॉडी के साथ immunofluorescence का उपयोग नमूना में पहली लेबल apoptotic कोशिकाओं का उपयोग करें. तो प्लग स्थापित ImageJ में confocal छवियों का एक ढेर खोलने और प्लग में चलाते हैं. यह apoptotic कोशिकाओं स्वचालित रूप से मायने रखता है के बारे में 30 सेकंड में.

8. अभिकर्मकों

  1. संस्कृति मध्यम: शील्ड और गाया M3 कीट मध्यम, 7.5% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन और 1% स्ट्रेप्टोमाइसिन.
  2. 0,01% बाँझ DW में पाली एल lysin.
  3. लगानेवाला: 4% formaldehyde, PEM में अल्ट्रा शुद्ध (0.1 एम पाइप, 2 मिमी EGTA, 1 मिमी MgSO 4) समाधान.
  4. Immunostaining के लिए अवरुद्ध समाधान: 10% 0.3% Triton एक्स पीबीएस में सामान्य बकरी सीरम.
  5. एंटी - Glutamine synthetase2 एंटीबॉडी: 1:250 समाधान को रोकने में.
  6. विरोधी GFP एंटीबॉडी 1:1,000 समाधान को रोकने में.
  7. विरोधी रेपो एंटीबॉडी: 1:250 समाधान को रोकने में.
  8. विरोधी ELAV एंटीबॉडी: 1:250 समाधान को रोकने में.
  9. विरोधी cleaved कस्पासे 3 एंटीबॉडी: 1:1,000 समाधान को रोकने में.
  10. माध्यमिक एंटीबॉडी: 1:250 समाधान को रोकने में.

Representative Results

यहां हम बताते हैं कैसे ड्रोसोफिला लार्वा VNC के छुरा चोट का प्रदर्शन करने के लिए और समय चूक का उपयोग कर और confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी immunostaining चोट सेलुलर प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण.

समय चूक डेटा के लिए, घाव GFP नकारात्मक असर G9 axonal मार्कर (2 चित्रा) नमूनों की neuropile भीतर एक क्षेत्र के रूप में देखे है. फौरन बाद छुरा, छोटे GFP नकारात्मक क्षेत्रों, जो छेद या vacuoles की तरह लग रहे हैं, को दिखाई शुरू (2A चित्रा). ऐसे GFP-नकारात्मक क्षेत्रों में आम तौर पर लगभग 6 से 8 घंटे के लिए छुरा (2A चित्रा) के बाद विस्तार. बाद में, GFP नकारात्मक क्षेत्रों हटना और भी गायब हो सकता है (चित्रा 2B). छुरा के बाद 22 घंटा, घाव द्वारा कब्जा कर लिया क्षेत्र आम तौर पर अधिकतम छुरा (2A आंकड़े, बी) के बाद 6 से 8 घंटे में क्षेत्र की तुलना में छोटे है. इसी तरह glial प्रक्रियाओं में नकारात्मक क्षेत्र DsRed शुरू भी बढ़ जाती है, लेकिन Shrinछुरा के बाद 22 घंटे के द्वारा ks. दिलचस्प है, अक्सर DsRed सकारात्मक glial प्रक्रियाओं में उनके लापता होने के लिए (चित्रा 2C) पहले neuropile GFP नकारात्मक छेद भरने.

निश्चित नमूनों, ठीक glial प्रक्रियाओं और उनके चोट के जवाब में immunostaining का उपयोग समय व्यतीत हो जाने के छवियों के साथ तुलना में बेहतर संकल्प के साथ देखे जा सकते हैं. यह उदाहरण के लिए किया जा सकता है, repoGAL4 glial ड्राइवर का उपयोग करने के लिए सभी glial कोशिकाओं (midline glia को छोड़कर) कल्पना मक्खियों में एक झिल्ली सीमित रिपोर्टर (जैसे यूएएस - mCD8GFP) की अभिव्यक्ति को प्रेरित. यह भी विरोधी GS2, जो neuropile से जुड़े glial कोशिकाओं (आंकड़े 3A, बी) लेबल के रूप में अन्य glial मार्करों, के साथ जोड़ा जा सकता है. यहां हम बताते हैं कि हालांकि उदरीय तंत्रिका कॉर्ड पृष्ठीय ओर से छुरा घोंपा है, एक गड्ढा औदरीयता (चित्रा 3A arrowheads) में चोट परिणाम छुरा. छुरा अधिक गंभीर वें neuropile और neuropile से जुड़े glial कोशिकाओं को प्रभावित होता हैएक सतह और प्रांतस्था glial कोशिकाओं (3B चित्रा). Glial प्रक्रियाओं neuropile में अव्यवस्थित दिखाई देते हैं, जबकि वे अभी भी प्रांतस्था में संगठन की तरह बनाए रखने के लिए अपने जाल. GS2 सकारात्मक सेलुलर मलबे है, जो मलबे के टुकड़े के रूप में सामान्य कोशिकाओं से अलग है में चोट परिणाम बहुत छोटे हैं और एक सेल शरीर जुड़ा नहीं है. यह neuropile जुड़े glial कोशिकाओं (3B चित्रा) के नुकसान का पता चलता है. Degenerating neuropile से जुड़े glial कोशिकाओं भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 15 के द्वारा मनाया गया. विरोधी cleaved - कस्पासे 3 + apoptosis धुंधला हो neuropile से जुड़े glial 15 कोशिकाओं में मनाया जाता है, दिखा वे चोट छुरा पर apoptosis गुजरना. भी Neuropile जुड़े glial कोशिकाओं neuronal मलबे 15, और GS2 phagocytose + संकेत भी glial प्रक्रियाओं द्वारा apoptotic न्यूरॉन्स के घिराव प्रकट हो सकता है के लिए दिखाया गया है. Cleaved कस्पासे + apoptotic कोशिकाओं प्रांतस्था में भी मनाया जाता है, जिनमें से कुछ कम से कम ELAV + न्यूरॉन्स के अनुरूप (

अचल नमूनों का प्रयोग और immunostaining प्रसार और apoptosis में प्रभाव के रूप में भी इस तरह की चोट के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का मात्रात्मक विश्लेषण में सक्षम बनाता है. इस के लिए, हम जानबूझकर दो प्लग - इन्स ImageJ, DeadEasy कस्पासे लार्वा और DeadEasy Glia, विकसित करने के लिए स्वचालित रूप से glial कोशिकाओं और apoptotic कोशिकाओं की संख्या की गिनती, क्रमशः. वे लार्वा VNCs पर काम करने की पुष्टि की है और बहुत सही कर रहे हैं. इन का प्रयोग, यह संभव है कि रेपो पॉजिटिव glial छुरा चोट से 22 (4A चित्रा) घंटा 15 वजह से कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि का पालन. वहाँ भी 6 घंटे के बाद छुरा 15 (4B चित्रा) विरोधी cleaved कस्पासे-3 apoptotic कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि हुई है. ड्रोसोफिला सीएनएस में चोट के जवाब में glial प्रसार और apoptosis में इस तरह की वृद्धि हड्डीवाला CNS में चोट की प्रतिक्रिया की याद ताजा करती है.

इस समर्थक के एक महत्वपूर्ण पहलूtocol VNC dissections की गुणवत्ता है. यह विच्छेदन के समय में क्या VNCs क्षतिग्रस्त किया गया है या प्रक्रिया में नहीं बताना मुश्किल है. कोमल dissections प्रदर्शन के लिए विशेष रूप से देखभाल करने के लिए यह महत्वपूर्ण है. हालांकि, खराब गुणवत्ता के नमूने को अनिवार्य रूप से उत्पादित किया जाएगा और यह जरूरी है कि बाद के चरणों में इन की पहचान कर रहे हैं और त्याग. हमारे हाथ में, VNC अध: पतन चोट करने के लिए असंबंधित हो प्रकट होता है, लेकिन इसके बजाय किसी न किसी विच्छेदन की वजह से है. हम चोट के घाव में एक महत्वपूर्ण आकार नहीं मनाया गया है, और हम सभी घायलों नमूने कि अपमानित नहीं कर रहे हैं का विश्लेषण. जब VNCs उनकी ईमानदारी को बनाए रखने, VNC सतह चिकनी और चमकदार लग जाता है, और neuropile में कोई छेद (चित्रा 5A) मनाया जाता है. VNCs की गिरावट VNC उदर और पार्श्व क्षेत्रों (चित्रा 5 ब) के किसी न किसी सतह से 24 घंटे के बाद विच्छेदन द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है. छुरा चोट से संबंधित neuropile की गिरावट भी हो सकते हैं, और यह neuropile ज के रूप में मान्यता प्राप्त हैपृष्ठभूमि संकेत में immunostained नमूनों के oles. अध: पतन के इन संकेतों के साथ नमूने (चित्रा 5C) खारिज कर दिया जाना चाहिए. हमारे हाथ में, विच्छेदन और बरकरार है और छुरा घोंपा नियंत्रण में चोट मक्खियों (YW) के लिए सफलता की दर लगभग 70 दोनों% हैं. इस दर प्रयोगों प्रदर्शन व्यक्ति के कौशल के साथ अलग अलग, और जीनोटाइप के साथ.

चित्रा 1
चित्रा 1. योजनाबद्ध के ड्राइंग लार्वा मचान और छुरा चोट (ए) 0 दिन में मक्खियों को 3 घंटे के लिए एक अंगूर का रस पेट्री डिश में अंडे देना करने के लिए अनुमति दी जाती है. 1 दिन, रची 1 instar लार्वा (L1) एकत्र कर रहे हैं और मानक खमीर भोजन, जहां वे एक और 3 दिनों के लिए रखा जाता है युक्त शीशियों में रखा गया है. 4 दिन, लार्वा भोजन शीशी से एकत्र कर रहे हैं, और छुरा प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया (बी) के लार्वा केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के पार्श्व दृश्य.उदरीय तंत्रिका कॉर्ड के पेट क्षेत्र पृष्ठीय ओर से एक सुई के साथ छुरा घोंपा है. पूर्वकाल छोड़ दिया करने के लिए है, और सही करने के लिए पीछे.

चित्रा 2
चित्रा 2. VNC घाव की प्रगति समय चूक GFP लेबल axons और DsRed लेबल glial कोशिकाओं के साथ रहते VNCs पर Confocal माइक्रोस्कोपी. जीनोटाइप:. UASDsRed /; G9 + /; repoGAL4 / + (ए) घाव axonal neuropile पर प्रतिदीप्ति की कमी के द्वारा मान्यता प्राप्त है. छुरा के बाद, GFP नकारात्मक छेद दिखाई देते हैं, उसके बाद आकार और संख्या में बढ़ रही है. छुरा चोट के बाद हर समय बिंदु से 5 ऑप्टिकल वर्गों के अनुमानों (बी) axonal छुरा के बाद 9 घंटा से neuropile घाव सिकुड़ती. इन छवियों को चोट छुरा के बाद अलग अलग समय बिंदुओं से एक ऑप्टिकल वर्गों हैं. प्रत्येक नमूने में समकक्ष पदों, ea से ही टुकड़ा नंबर की पहचानसमय चूक डेटा के ढेर में चर्चा समय बिंदु चुना गया था. तुलना करके पैटर्न छुरा से नहीं प्रभावित क्षेत्र में G9 और repoGAL4> UASmCD8GFP के साथ कल्पना, स्लाइस z अक्ष में समकक्ष पदों से किया जा रहा है के रूप में सत्यापित किया गया. में धराशायी लाइनों (ए, बी) घाव के किनारे (सी) neuropile पर घावों की उच्च वृद्धि से संकेत मिलता है. GFP नकारात्मक छेद DsRed पॉजिटिव glial प्रक्रियाओं के साथ भर गए थे, और बाद में गायब हो गया (तीर). क्षैतिज दृश्य. पूर्वकाल ऊपर.

चित्रा 3
चित्रा 3. VNC घाव के सेलुलर लक्षण वर्णन सभी glial (midline glia को छोड़कर) कोशिकाओं विरोधी GFP और विरोधी GS2, एक neuropile संबद्ध glial सेल मार्कर के साथ दाग के लिए एक झिल्ली सीमित GFP संवाददाता असर VNCs. जीनोटाइप / + +; UASmCD8GFP + /; repoGAL4 / + (ए) VNCs एक प्रकार का गुबरैला से वार किया गयासाल की तरफ हो रहा है, लेकिन यह एक गड्ढा औदरीयता (तीर) का कारण बनता है. एक ऑप्टिकल वर्गों के बाण के दृश्य, पृष्ठीय और पूर्वकाल बाईं (ए, बी). चोट छुरा प्रांतस्था और सतह glial कोशिकाओं की तुलना में अधिक neuropile से जुड़े गंभीर रूप से glial कोशिकाओं को प्रभावित करता है. GS2 सकारात्मक सेलुलर मलबे में चोट परिणाम (बी में arrowheads) (बी) एक ऑप्टिकल वर्गों की क्षैतिज दृश्य, पूर्वकाल ऊपर. Arrowheads GS2 करने के लिए बिंदु + सेल मलबे. (सी) apoptotic मार्कर विरोधी cleaved - कस्पासे 3 और neuronal मार्कर विरोधी ELAV दिखा रहा है कि चोट पर प्रांतस्था में कोशिकाओं को मरने के कुछ न्यूरॉन्स की Colocalisation. एनपी, neuropile, cx, प्रांतस्था.

चित्रा 4
चित्रा 4. Glial कोशिकाओं और apoptotic कोशिकाओं का उपयोग कर DeadEasy स्वचालित की गिनती (ए) 'DeadEasy लारवल glia' का उपयोग करने के उदाहरण रेपो सकारात्मक गिनती.glial कोशिकाओं. वाम: VNC ventral halves विरोधी रेपो एंटीबॉडी के साथ दाग, मध्य: DeadEasy लारवल प्लग द्वारा की पहचान की कोशिकाओं दिखा glia से उत्पादन, सही: मर्ज. सही पर नंबर रेपो पॉजिटिव के बारे में 30 सेकंड में ऑप्टिकल confocal वर्गों की एक पूरी ढेर में गिना स्वतः कोशिकाओं की संख्या में हैं. छुरा घोंपा VNCs में glia बढ़ जाती है की संख्या (बी) 'DeadEasy कस्पासे लार्वा' का उपयोग का उदाहरण. वाम: 5 ऑप्टिकल confocal विरोधी cleaved कस्पासे 3 एंटीबॉडी के साथ दाग वर्गों के अनुमानों, मध्यम: उत्पादन प्लग द्वारा की पहचान की कोशिकाओं दिखा, सही: विलय. सही पर नंबर कस्पासे पॉजिटिव के बारे में 30 सेकंड में ऑप्टिकल confocal वर्गों की एक पूरी ढेर में गिना स्वतः कोशिकाओं की संख्या में हैं. apoptotic कोशिकाओं की संख्या में छुरा घोंपा VNC बढ़ जाती है.

चित्रा 5
चित्रा 5. Degenerat के उदाहरणआयन (एक). एक स्वस्थ VNC. अध: पतन के कोई संकेत नहीं हैं (बी) छाती की ओर एक छुरा घोंपा नमूना में degenerating (तीर). Asterisk घाव साइट को इंगित करता है. (सी) में छेद वक्ष (सफेद arrowhead) neuropile और प्रांतस्था (नारंगी arrowhead) एक गैर छुरा घोंपा VNC में है. क्षतिग्रस्त neuropile और व्यापक vacuolization के साथ नमूने को खारिज कर दिया जाना चाहिए. यहाँ VNCs neuropile जुड़े glial विरोधी आबनूस मार्कर के साथ दाग थे. क्षैतिज देखने के लिए, पूर्वकाल ऊपर.

Discussion

हम ड्रोसोफिला लार्वा CNS चोट छुरा चोट, मरम्मत और उत्थान के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है. लारवल VNCs dissected और वार, जिसके बाद वे समय चूक माइक्रोस्कोपी के साथ फिल्माए गए हैं या प्रतिदीप्ति immunostaining के लिए तय glia और न्यूरॉन्स, apoptosis या कोशिका विभाजन की कल्पना कर रहे हैं. समय पर घाव की प्रगति को मापा जा सकता है. इस विधि जानबूझकर चोट पर और मरम्मत के दौरान सेल नंबर में परिवर्तन की मात्रात्मक और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए विकसित सॉफ्टवेयर के साथ है.

हम 96 घंटे AEL (और इन या तय किया गया और आगे विकसित करने की अनुमति दी है) लार्वा, और फिर वयस्क मक्खी प्यूपा संक्रमण के लिए पहले एक विकास मंच के छुरा घोंपा. 96 घंटा, VNCs छुरा के लिए काफी बड़ी हैं, वे 3 instar मंच के बीच में हैं, और इस तरह के दौर से गुजर रहे हैं अभी तक नहीं प्यूपीकरण, और तंत्रिका तंत्र पहले से ही पूरी तरह से विज्ञापन के लिए कार्यात्मक इसी तरहult. यह थोड़ा बाद लार्वा में वार करने के लिए संभव हो सकता है और सटीक समय अनुसंधान प्रश्न के अनुरूप करने के लिए चुना जाना चाहिए. हालांकि, संबोधित प्रश्नों पर निर्भर करता है, यह आम तौर पर कुछ समय के लिए चोट करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का पालन VNCs संस्कृति के लिए आवश्यक हो जाएगा. 120 घंटा AEL प्यूपीकरण के बाद शुरू होता है कुछ समय, एक समय था जब CNS remodeled है और इस तरह सबसे अच्छा बचा है. इस प्रकार लार्वा में प्लस संस्कृति छुरा के लिए समय खिड़की बल्कि प्रतिबंधित है. लार्वा का प्रयोग अभी भी वयस्कों का उपयोग करने पर एक महान तकनीकी लाभ: इसी तरह वयस्क के लिए whilst, तंत्रिका तंत्र पहले से ही पूरी तरह कार्यात्मक, चोट के जवाब का विश्लेषण करने में काफी आसान है और लार्वा में तेजी है.

जब और दिमाग और विच्छेदित और एक बराबर संवर्धन के बिना एक थाली में बाद के समय बिंदु पर dissected VNCs एक डिश में संवर्धित VNCs के आकार आकारिकी की तुलना, यह प्रतीत होता है कि विकास संस्कृति में vivo में की तुलना में धीमी है. अन्य मामलों में,विकास संस्कृति में आम तौर पर, ऊतक अखंडता संरक्षित है और कोशिकाओं को जीवित कई प्रतिक्रियाएं दिखा रहे हैं पर किया जाता है. घाव विस्तार, neuropile मरम्मत और glial प्रसार 22 घंटा के बाद छुरा के भीतर जगह ले लो. इससे पता चलता है कि चोट के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं संस्कृति में जगह लेने के लिए और सबसे अधिक संभावना नहीं करने के लिए एक दिन से अधिक समय के लिए explants को बनाए रखने की जरूरत है. अगर लंबी अवधि के संस्कृति वांछित थे, प्रोटोकॉल आगे एक संस्कृति प्लेट 5 डालने का उपयोग कर के रूप में अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है.

यह degenerating लोगों से अच्छी गुणवत्ता के नमूनों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन कुछ कौशल लेता है और अनिवार्य रूप से कुछ नमूनों में अध: पतन हो जाएगा. VNC एक 'फूलगोभी' उपस्थिति है कि ऊतक अखंडता (चित्रा 5 ब) की एक टूटने को दर्शाता है प्राप्त कर सकते हैं. छुरा, अध: पतन भी VNC के vacuolization की स्वतंत्र रूप से मान्यता प्राप्त है जो बरकरार, गैर छुरा घोंपा नमूनों में मौजूद हो सकता है (चित्रा 5C कर सकते हैं

इस प्रोटोकॉल में, हम मक्खियों के एक प्रोटीन ट्रापलाइन glial पारंपरिक प्रणाली GAL4 यूएएस का उपयोग करने की प्रक्रिया के दृश्य करने के लिए समानांतर में neuropile कल्पना का फायदा उठाया. ये उपकरण भी अन्य बाइनरी ऐसे Le रूप में अभिव्यक्ति प्रणालियों के साथ संयुक्त किया जा सकता हैXa 19 और 20 क्यू - प्रणाली, जो GAL4 से स्वतंत्र हैं. इस चोट के जवाब में axons और glial प्रक्रियाओं के बीच उदाहरण के लिए बातचीत का विश्लेषण, सक्षम होगा. आगे यह 21 dendrites या कैल्शियम 22 आमद के लिए पत्रकारों के रूप में अन्य आनुवंशिक उपकरण के साथ संयोजन के द्वारा, इस विधि glial कोशिकाओं, neuronal axons और CNS में dendrites की चोट की प्रतिक्रिया के पीछे कोशिका जीव विज्ञान के विश्लेषण के लिए एक महान अवसर प्रदान करता है. अंत में, इस विधि के मानक आनुवंशिकी, परिवर्तन और जीन की अभिव्यक्ति के साथ संयुक्त किया जा सकता है, चोट और उत्थान के लिए प्रतिक्रिया में जीन समारोह का परीक्षण करने के लिए.

इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक एक जीन पुनर्योजी CNS 11 चोट glial प्रतिक्रिया अंतर्निहित नेटवर्क की खोज करने के लिए प्रेरित किया है. जीन समारोह की विकासवादी संरक्षण को देखते हुए, इन सेलुलर घटनाओं और फल मक्खियों में जीन कार्य unraveling माँ की समझ में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की संभावना हैmmalian CNS चोट और उत्थान के लिए प्रतिक्रिया.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और इस काम के पाठ्यक्रम में उनके विचार - विमर्श के लिए हमारी प्रयोगशाला के अन्य सदस्यों के लिए मेई एन लिम धन्यवाद. यह काम यामादा विज्ञान फाउंडेशन और रॉयल सोसाइटी छोटी यात्रा फैलोशिप और यूरोपीय संघ मैरी क्यूरी इंटरनेशनल इनकमिंग फैलोशिप के.के. GRR, और बीबीएसआरसी परियोजना अनुदान (BB/H002278/1) और वेलकम ट्रस्ट उपकरण अनुदान (073228/Z/03/Z) द्वारा वित्त पोषित किया गया था आह

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Staining block Brunel Microscope
Forceps No. 5 Fine Science Tools e.g. 11251-20
Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch Roboz Surgical Instrument RS-6065
Needle holder Roboz Surgical Instrument RS-6060
Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps Fine Science Tools 29000-00
35 mm Petri dish with 27 mm glass base Iwaki 3930-035
Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber Leica
Reagent
Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) Sigma S3652-500 ml
Penicillin and streptomycin Invitrogen 15070-063
Phosphate-buffered saline (PBS) See 12
FBS Sigma F7524
Poly-L-lysin Sigma P1399-25mg
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences 04018-1
Mouse anti-glutamine synthetase antibodies Millipore MAB302
Rabbit anti-GFP antibodies Life technologies A11122
Mouse anti-REPO antibodies Developmental Studies Hybridoma bank 8D12
Rat anti-ELAV antibodies Developmental Studies Hybridoma bank 7E8A10
Rabbit anti-active caspase 3 antibodies Abcam ab13847
Normal goat serum Vector Laboratories S-1000
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 Life technologies A11034
Anti-mouse Alexa Fluor 647 Life technologies A21236
Anti-rat Alexa Fluor 647 Life technologies A21247

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References

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एक चोट की जांच केंद्रीय तंत्रिका तंत्र मरम्मत प्रतिमान<em&gt; ड्रोसोफिला</em
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Kato, K., Hidalgo, A. An Injury… More

Kato, K., Hidalgo, A. An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila. J. Vis. Exp. (73), e50306, doi:10.3791/50306 (2013).

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