Summary
Un paradigma de lesión utilizando el cable de Drosophila larval nervio ventral para investigar la regeneración del sistema nervioso central y la reparación es descrito. Stabbing seguido por microscopía confocal de barrido láser en especímenes de lapso de tiempo y fijo, combinada con el análisis cuantitativo con el software desarrollado a propósito y la genética, se utilizan para investigar los mecanismos moleculares de la regeneración del SNC y reparación.
Abstract
Un método experimental ha sido desarrollado para investigar las respuestas celulares a sistema nervioso central (CNS) lesión utilizando la mosca de la fruta Drosophila. Entendimiento reparación y regeneración de los animales es una cuestión clave en la biología. El SNC humanos dañados no se regenera, y la comprensión de cómo promover la regeneración es una de las metas principales de la medicina neurociencia. El potente conjunto de herramientas genética de Drosophila se puede utilizar para hacer frente al problema de la regeneración del SNC.
Una lesión de la médula nervio del SNC ventral (VNC, equivalente a la médula espinal vertebrado) se aplica manualmente con una aguja de tungsteno. El VNC posteriormente puede ser filmado en intervalos de tiempo mediante microscopía láser confocal de barrido para un máximo de 24 horas para seguir el desarrollo de la lesión con el tiempo. Alternativamente, puede obtenerse un cultivo, después se fijaron y se tiñeron mediante inmunofluorescencia para visualizar las neuronas y las células gliales con microscopía confocal. Usando marcadores apropiados, changes en la morfología celular y estado de la célula como resultado de la lesión puede ser visualizada. Con ImageJ y desarrollado a propósito plug-ins, los análisis cuantitativos y estadísticos pueden llevarse a cabo para medir los cambios en el tamaño de la herida en el tiempo y los efectos de las lesiones en la proliferación celular y la muerte celular. Estos métodos permiten el análisis de muestras de gran tamaño. Se pueden combinar con la genética de Drosophila poderosos para investigar los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración y reparación del SNC.
Introduction
La regeneración en animales revelan que las células detectan cuando el crecimiento del organismo se ordena y completa, y cómo la integridad estructural de un organismo se logra y se mantiene. La comprensión de estas habilidades misteriosas de las células es de gran interés en la biología. Promover la regeneración es una de las metas principales para el uso médico neurociencia. En los seres humanos, el dañado sistema nervioso central (SNC) no se regenera. Modelos de roedor de lesión de la médula espinal se utilizan para entender cómo las células responden a la lesión. Sin embargo, las preocupaciones éticas, los altos costos y el ciclo de vida de los animales lento limitan el progreso.
La mosca de la fruta Drosophila es un organismo modelo ampliamente utilizado en la biología del desarrollo y la neurociencia. Gracias a sus poderosas herramientas genéticas y ciclo de vida corto, la Drosophila ha recurrentemente llevó al descubrimiento de funciones de genes y redes de genes con relevancia para la comprensión de los seres humanos y la enfermedad. Hay abundante evidencia de la evolución conconservación de la función de genes de las moscas a los humanos.
Durante los últimos años, varios paradigmas de lesiones del sistema nervioso han sido establecidas en Drosophila. Algunos consisten en daños en los nervios periféricos que se ejecutan a lo largo del ala o axotomía de los nervios periféricos, incluyendo sensorial y motor axones 1 2. Sin embargo, los sistemas nerviosos periférico y central difieren en muchos aspectos, y es bien sabido que en muchos animales del sistema nervioso periférico pueden regenerarse mientras que el SNC no puede. Por lo tanto, para entender la regeneración del SNC, daño directo al sistema nervioso central es más apropiado. Daño punzante con una aguja ha sido aplicado con éxito al cerebro adulto Drosophila para investigar la respuesta a la lesión 3,4. Con otro enfoque, Ayaz et al. Cercenadas axones del sistema nervioso central en los cerebros adultos cultivadas con microdissector Piezo poder, y analizaron su regeneración durante 4 días 5. La ventaja de estos u grupo experimental despuésps es que se centran en el cerebro, que es sin duda de gran interés. La desventaja es que el cerebro es mucho más complejo que el VNC, que trata sólo con el motor y el control sensorial. Trabajo en el cerebro adulto es también más tiempo. La larva está listo para experimentos en 4 días, mientras que se tarda unos 10 días para la eclosión de adultos, y luego otros 5 días para su maduración. El cerebro adulto es también más difícil de manejar, ya que está encapsulado en cutícula gruesa, que es difícil de quitar. El VNC tiene la atracción adicional de ser funcionalmente equivalente a la médula espinal de vertebrados.
La larva de Drosophila se utiliza ampliamente como un organismo modelo para la neurociencia 6-9. Aunque en sentido estricto la larva se encuentra en una fase de desarrollo, sino que también puede ser considerado un animal completamente funcional. La larva tiene locomoción, múltiples sentidos, incluyendo el olfato, el gusto y la nocicepción y el aprendizaje y la memoria. Por lo tanto, la larva VNC wcomo escogido como el modelo ideal para la lesión del SNC.
VNCs mortalidad de las larvas puede ser diseccionado y se cultivaron en una placa, que conserva la integridad celular durante un máximo de 24 horas 10. Esto sugiere que la lesión podría ser aplicado a la VNC, que entonces podrían ser registrados en intervalos de tiempo para durante este período de tiempo, o se cultivan y se fija en cualquier punto de tiempo deseado dentro de este período.
A continuación, presentamos un paradigma experimental de lesión del SNC utilizando la Drosophila larval VNC. El VNC es primero disecados de la larva y la lesión punzante se aplica manualmente con una aguja de tungsteno. El VNC se coloca entonces sobre un cubreobjetos de vidrio de fondo, y filmada con láser de lapso de tiempo microscopía confocal de barrido. Alternativamente, los VNCs pueden cultivarse durante un período de tiempo deseado, y los efectos celulares de la lesión pueden ser analizados en las muestras fijadas mediante inmunotinción y microscopía confocal. El área de la herida puede ser medida, y el análisis cuantitativo de células numbre (proliferación celular y la muerte celular) puede llevarse a cabo con el software desarrollado a propósito. Muestras de gran tamaño se pueden manejar fácilmente, resultando en resultados estadísticamente validados. Estos métodos se han combinado con éxito con la genética de Drosophila poderosas para descubrir una red de genes subyacentes de la respuesta glial regenerativa a una lesión del SNC 11.
Protocol
1. Recolección de larvas por etapas
- Lugar 15 mujeres y 15 moscas adultas macho en una jaula cilíndrica de metacrilato para poner los huevos en un plato de Petri con agar y jugo de uva complementado con una pequeña cucharada de levadura de pasta durante 3 horas a 25 ° C. Cambie la placa de 3-4 veces al día, y descartar la primera placa (es decir, de la O / N huevo-lay). Deseche también las placas desde el primer día. Desde el segundo día, mantener las placas con los huevos a 25 ° C. Después de 7 días de recolección de huevos, comience con un nuevo montaje de moscas de los padres.
- Después de aproximadamente 24 horas, larvas eclosionan de los huevos. Al conectar las larvas con una brocha o más delgado con un par de pinzas, transferir 35 larvas del agar de uva a un vial que contiene alimentos mosca estándar (10 ml) (Figura 1A).
- Mantener los viales que contienen las larvas durante 3 días (96 horas después de la puesta de huevos, AEL) a 25 ° C.
2. Disección de larvas cordones nerviosos ventrales de Cultura
- Limpie sernch y manos con 70% de etanol. Remojar 4 bloques de tinción, 2 pares de pinzas y una aguja con 70% de etanol, y dejar secar al aire.
- Preparar a 4 cuadras de tinción con los siguientes medios: uno con agua destilada (DW) para limpiar y para las larvas de la piscina limpia, una segunda con 2 ml de Escudo y Sang medio M3 insecto con 1% de penicilina y estreptomicina, Ecdysone gratuito (M3 PS medio) para diseccionar las larvas, y una tercera con 2 ml de medio M3 PS a la piscina disecados cordones nerviosos ventrales (VNCs), y un cuarto con 2 ml de medio M3 PS para apuñalar a los VNCs. Todos los reactivos deben ser pre-calentó a TA.
- Añadir agua al vial que contiene 96 h AEL larvas. Después, usando una espátula, se extendió suavemente alimentos con larvas del vial sobre una toalla de papel húmeda. Transferir 10 larvas a un bloque de tinción que contiene DW para lavar los alimentos. Reemplace DW 6 veces. Luego reemplazar con M3 medio PS.
- Transferir una de las larvas a un bloque de tinción que contiene 2 ml de medio M3 PS.
- Bajo un microscopio de disección, dissect un cerebro de larvas cuidadosamente usando métodos estándar 12, pero para minimizar el daño tisular, tener especial cuidado al proceder de la siguiente manera. Coloque el lado dorsal larva, y mantenga el lado dorsal en un tercio desde el extremo anterior con 2 pares de pinzas (una en cada mano). Mientras sostiene la sección anterior, alejarse del extremo posterior con las pinzas, y rasgar la epidermis. El cerebro y la VNC debe ser visible desde el borde posterior de la mitad anterior. Cuidadosamente aislar el cerebro y complejo VNC mediante la eliminación de la grasa corporal intestino, y la epidermis. Cuando los VNCs se dañan demasiado, los VNCs degenerará, total o parcialmente, incluso sin lesión punzante. Tome en cuenta los siguientes puntos:
- No tirar o romper los discos imaginales y los nervios periféricos del tórax VNC ya que podría dañar el VNC. Para cortar los nervios periféricos, mantenga los nervios periféricos con dos pares de pinzas colocados cerca uno del otro, y luego tire de los nervios con el deceps. Discos imaginales y piezas bucales se puede dejar conectado al VNC.
- Deja la glándula anillo y la glándula linfática adherida al cerebro.
- Cortar el intestino en el punto más cercano al cerebro, donde se contiene alimentos no mucho.
- Mediante el uso de un Pipetman P20 con la punta cortada y se abrieron un poco, transfiera el VNC a un bloque que contiene manchas frescas M3 medio PS. Antes de transferir el VNC, primero pipeta arriba y abajo de sólo el medio utilizado para la disección a fin de evitar la VNC se pegue a la punta.
3. Stabbing Lesión en el VNC larvas de Drosophila
En esta sección se describe cómo realizar lesión punzante a los VNCs y preparar apuñalado-VNCs para realizar un análisis cronológico y inmunoticción. Punzantes Post-condiciones de cultivo y la duración se describen en la sección 5 (para realizar un análisis cronológico) y en la sección 6 (para inmunoticción).
- Después de reunir suficientes VNCs (4-5 para time-lapsey más del 24 por inmunoticción), la transferencia de un VNC a un bloque de tinción limpia que contenga M3 PS.
- Oriente el VNC para que el neuropile dorsal está a la vista bajo el microscopio de disección (Figura 1B). Esta es la orientación más natural para VNCs para tumbarse en cuando está unido a los lóbulos ópticos.
- Puñalada manualmente utilizando una aguja de tungsteno bajo el microscopio de disección, desde el lado dorsal prácticamente en ángulo recto y el objetivo para el medio abdominal de la VNC (Figura 1B).
Tome una atención particular a lo siguiente:
- Puñalada sólo una vez.
- Puñalada hasta que la aguja toca el fondo de la copa. Sin embargo, tenga cuidado de no dañar la punta de la aguja.
- El vástago del soporte de la aguja no debe tocar el medio durante punzante.
- La herida no es visible bajo el microscopio de disección.
Nota: Puñalada degeneración de la lesión no relacionada
El procedimientopuede resultar en la degeneración celular dentro de la VNC distinta de la lesión punzante. La degeneración en los agujeros en la neuropile, y de vez en cuando los agujeros se han observado en la corteza de los especímenes no apuñalados. Las muestras con degeneración que afecta a la degeneración neuropile o extendida que afecta también la superficie VNC debe ser desechado. La degeneración puede ser identificado de la siguiente manera:
- Superficie de fricción, especialmente en el área lateral / ventral del tórax, a las 22 h de la puñalada. En casos extremos, la VNC se ve que sobresale.
- Los agujeros o vacuolas en la neuropile torácica, que puede ser visible como agujeros en la señal de fondo con inmunotinción de fluorescencia.
4. Mantenimiento de la Aguja y Pinzas
- Rutinariamente comprobar si la punta de la aguja es lo suficientemente nítida. La punta de la aguja puede ser doblada o poco afilada después de usarlo durante varios experimentos. En este caso, afilar la punta usando una piedra de Arkansas o equivalente.
- Las puntas de las pinzas debecumplir perfectamente. Las puntas pueden dañarse con el uso. En este caso, ajuste la punta con una piedra de Arkansas o equivalente.
5. Cultura y time-lapse de grabación de VNCs apuñalado
Para visualizar la neuropile axonal en el VNC vivo, una proteína GFP línea de trampas que etiqueta todos los axones G9 - 13 - pueden ser utilizados, y para visualizar todas las células gliales (excepto la glía línea media) el controlador glial repoGAL4 se puede utilizar para expresar la UASdsRed S197Y 14 reportero. Al cruce G9 vuela a UASdsRedS197Y;; repoGAL4 moscas, larvas de VNCs progenie se obtienen con los axones y células gliales rojo verde que se pueden grabar en el tejido vivo.
- Después de la puesta en común VNCs 4-5, transferencia 1 VNC a un bloque de tinción limpia que contenga 2 ml de M3 PS, y apuñalar a la media abdominal of the VNC como se indica en la sección 3.
- Transferir la apuñaló VNC a un poli-L-lisina recubierto de 3,5 mm de vidrio plato de fondo Petri que contiene 1 ml de M3PS. Coloque el lado dorsal VNCs abajo. Empuje suavemente el VNC usando el lado plano de un par de pinzas para que el VNC para pegarse al plato.
- Suavemente añadir 1 ml de FBS M3 PS 15% hace que la concentración final de FBS al 7,5%.
- Adquirir imágenes mediante microscopía confocal de barrido láser. Escanear la VNC, recogiendo una serie Z-sección a lo largo de todo su espesor. Se utilizó un Leica SP2 confocal microscopio invertido con una temperatura ambiental cámara controlada. Cualquier microscopio confocal equivalente debería funcionar, sin embargo, puede requerir la optimización de la configuración de la exploración. Los ajustes para el tiempo de lapso de microscopía confocal fueron las siguientes: Temperatura de la cámara ambiental: 25 ° C; 20X objetivo con 4 veces el zoom; modo de escaneo xyzt, con una resolución de 512x512 píxeles, z = 1 pasos micras y 1 hora-o 2 - intervalos de una hora.
- El microscopio confocal Leica SP2 tiene una limitación de tamaño de archivo de escaneado. Con estos ajustes, 8-9 puntos de tiempo se pueden escanear. Conotros microscopios confocales, que debería ser posible adquirir pilas de imagen para los puntos de tiempo más largos, es decir, en el lapso de hasta 24 horas.
6. Cultura y inmunotinción de VNCs apuñalado y Fijo
- Preparar una placa de cultivo tisular de 24 pocillos que contiene 500 l de M3 PS 7,5% de FBS por pocillo.
- Repita la disección de más de 24 VNCs para una placa de cultivo tisular de 24 pocillos.
- Mediante el uso de la Pipetman P20 con la punta de corte, transferir 12 VNCs no apuñalados desde la piscina a la placa de cultivo, utilizando un VNC por pocillo.
- Puñalada el resto de VNCs en la piscina como se describe en la sección 3. Transfiera cada VNC apuñaló a un pozo cada uno.
- Colocar el plato 24-bien en la incubadora de 25 ° C para una duración deseada dependiendo del experimento. Integridad celular se altera por lo menos durante 24 hr.
- Después del cultivo, transferir los 12 VNCs en 250 l de PEM formaldehído 4% en un tubo de 1,5 ml mediante el uso de la Pipetman P20 con la punta de corte. Entonces, la fixatiHe sido cuidadosamente con pipeta a cabo, teniendo cuidado de no dañar los VNCs. Una pequeña cantidad de fijador suficiente para cubrir las muestras deben permanecer en cada tubo. A continuación añadir el fijador fresco, y agitar suavemente durante 50 min a RT.
- Enjuague 2 veces con Triton X 0,3% de PBS, y luego lavar 2 veces durante 10 minutos con 0,3% Triton X PBS a TA.
- VNCs bloque por incubación con suero de cabra normal al 10% en 0,3% de Triton X PBS durante 1 hora a TA. Las muestras se pueden almacenar a 4 ° C durante al menos un mes.
- Incubar VNCs con anticuerpos primarios durante más de 20 horas a 4 ° C.
- Enjuague 2 veces con 0,3% Triton X PBS, luego lavar 3 veces durante 10 minutos con 0,3% Triton X PBS a TA.
- Incubar VNCs con anticuerpos secundarios durante más de 16 horas a 4 ° C.
- Enjuague 2 veces con 0,3% Triton X PBS, luego lavar 3 veces durante 10 minutos con 0,3% Triton X PBS en la sala de RT (en la oscuridad si usando anticuerpos secundarios fluorescentes).
- Reemplazar PBS con 50% de glicerol: 50% de PBS durante por lo menos unhoras.
- Luego reemplazar con 80% de glicerol: 20% de PBS durante al menos una hora.
- Montar un VNC en una ventana hecha en 2 capas de cinta de cello (aproximadamente 0,06 mm) sobre un portaobjetos de vidrio microscopía. Ajuste la orientación, y colocar un cubreobjetos (18x18 mm) a través de la ventana. Dos VNCs se puede montar en un portaobjetos utilizando este método.
Usando una variedad de anticuerpos primarios, diferentes respuestas celulares a la lesión se puede analizar (por ejemplo, cambios en el número de células y la forma de la célula).
7. Analizar datos usando ImageJ y una serie de Plugins
Si el VNC no tiene punzante degeneración no relacionado, la muestra debe ser contado en el análisis, independientemente del tamaño de la lesión. Como punzante se realiza manualmente, el tamaño de la lesión difiere cada vez. Por lo tanto es importante analizar estadísticamente el efecto de apuñalamiento, siempre que sea posible.
- Heridas medición del tamaño. El tamaño de la herida es un indicador de reparación 15.La lesión punzante es visible como carente de expresión GFP. Área de lesión se puede medir utilizando los datos de lapso software ImageJ libremente disponible, como sigue:
- Uso ImageJ, abra una pila de imágenes confocal de menú "Archivo", seleccione "Importar" y desde allí seleccionar "secuencia de imágenes". Esto a su vez la colección de imágenes individuales en una pila.
- Siguiente cambiar la "pila" en un "HyperStack", vaya a "Imagen" del menú, seleccione "HyperStack", luego seleccione "Stack para HyperStack".
- Ajuste el tamaño de voxel mediante el uso de "Propiedades" del menú "Imagen". En los datos adquiridos utilizando el microscopio confocal Leica SP2, el tamaño de vóxel se puede obtener a partir de la exploración de software, y desde el archivo de metadatos de texto guardado junto con las imágenes. En nuestro medio, como se describe en la Sección 3, dimensiones en píxeles son XY = 0,366211 m y Z = 0,99709 micras.
- Mediante el examen de todas las rebanadas en un punto de tiempo, dibuja el contorno máximo de la zona de la lesión con la herramienta de polígono de selección en la barra de herramientas. Este es elRegión de interés (ROI).
- Agregue el retorno de la inversión ROI con el gerente, vaya a "Analizar" del menú, desplácese hacia abajo y seleccione "Herramientas", luego "Administrador de retorno de la inversión", luego "añadir".
- Repita este proceso para los todos los puntos de tiempo.
- Haga clic en la "Medida" en el administrador de retorno de la inversión para obtener el tamaño del área de cada ROI.
- Corrección de movimiento VNC durante las grabaciones time-lapse. "Stackreg" y "plugins" Turboreg 16 (desde el sitio web ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ): estos plugins permiten corregir los movimientos pequeños de la muestra durante el lapso de tiempo. Construir una pila con una sección equivalente óptico representante a través de todos los puntos de tiempo y aplicar los plugins. Esto ayuda a visualizar cómo cambia la lesión con el tiempo. Los detalles sobre estos métodos y el manual de instrucciones están disponibles en el grupo de investigación que ha desarrollado estos plugins. ( http://bigwww.epfl.ch / Thevenaz / stackreg /).
- Recuento automático de células gliales. "Glia DeadEasy" plugin ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ): este fue diseñado para contar el número de REPO-positivas las células gliales en el VNC Drosophila larval y para examinar el cambio en glial número de lesiones causadas por arma blanca 17. El plug-in funciona con precisión, con un error de 0,1% de falsos positivos y falsos negativos 4,3% 17. Para utilizar este plug-in, la primera etiqueta toda la glia (excepto la línea media) en la muestra utilizando inmunofluorescencia con anticuerpos anti-REPO. A continuación, instale el plug-in en ImageJ, abra una pila de imágenes confocal y ejecutar plug-in. Cuenta células gliales automáticamente en unos 30 segundos.
- Recuento automático de células apoptóticas. "Larvas caspasa DeadEasy" plug-in ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18: Este fue diseñado para contar el número de células marcadas con anti-troceados-Caspase3, y una nueva versión fue adaptado para las VNCs larvales. Stabbing lesión provoca un aumento en la muerte celular programada 11. Para utilizar este plug-in, las células apoptóticas primera etiqueta en la muestra mediante inmunofluorescencia con anti-troceados-caspasa-3 anticuerpos. A continuación, instale el plug-in en ImageJ, abra una pila de imágenes confocal y ejecutar plug-in. Cuenta células apoptóticas automáticamente en unos 30 segundos.
8. Reactivos
- Medio de cultivo: Shield y Sang medio de insecto M3, 7,5% de suero bovino fetal, 1% de penicilina y estreptomicina al 1%.
- 0,01% de poli-L-lisina en estéril DW.
- Fijador: 4% de formaldehído, Ultra puro en PEM (0,1 TUBOS M, 2 mM EGTA, 1 mM MgSO 4) solución.
- Solución de bloqueo para la inmunotinción: 10% de suero normal de cabra en 0,3% de Triton X PBS.
- Anti-glutamina sintetasa2 anticuerpos: 1:250 en solución de bloqueo.
- Los anticuerpos anti-GFP: 1:1,000 en solución de bloqueo.
- Anticuerpos anti-REPO: 1:250 en solución de bloqueo.
- Elav anti-anticuerpos: 1:250 en solución de bloqueo.
- Lucha contra exfoliados caspasa 3 anticuerpos: 1:1000 en solución de bloqueo.
- Anticuerpos secundarios: 1:250 en solución de bloqueo.
Representative Results
Aquí mostramos cómo realizar lesión punzante al VNC larvas de Drosophila y analizar las respuestas celulares a la lesión utilizando time-lapse microscopía de fluorescencia y confocal inmunotinción.
Para los datos de lapso de tiempo, la lesión es visualizada como una zona GFP-negativa dentro de la neuropile de especímenes que llevan el marcador G9 axonal (Figura 2). Poco después de apuñalar, GFP-negativos pequeñas áreas que se ven como agujeros o vacuolas, empiezan a aparecer (Figura 2A). Tal GFP-negativos áreas generalmente ampliar hasta alrededor de 6 a 8 horas después de apuñalar (Figura 2A). Posteriormente, las áreas negativas GFP-retráctil y puede incluso desaparecer (Figura 2B). Por 22 hr después de apuñalar, el área ocupada por la herida es generalmente más pequeña que el área máxima fue de 6 a 8 horas después de la punzante (Figuras 2A, B). Del mismo modo el área de DsRed-negativo en los procesos gliales inicialmente aumenta demasiado, pero Shrinks por 22 horas después del apuñalamiento. Curiosamente, a menudo DsRed-positivas procesos gliales llenar los agujeros GFP-negativos en la neuropile antes de su desaparición (Figura 2C).
Usando inmunoticción en muestras fijadas, finas procesos gliales y su respuesta a la lesión puede ser visualizado con mejor resolución que las imágenes time-lapse. Esto puede hacerse, por ejemplo, utilizando el controlador de repoGAL4 glial para inducir la expresión de un reportero membrana anclada (por ejemplo UAS-mCD8GFP) en moscas para visualizar todas las células gliales (excepto la glía línea media). Esto también se puede combinar con otros marcadores gliales, tales como anti-GS2, que las etiquetas de neuropile asociadas a las células gliales (figuras 3A, B). Aquí nos muestran que a pesar de que el cordón nervioso ventral es apuñalado por el lado dorsal, punzante lesión resulta en un hueco ventral (Figura 3a, puntas de flecha). Stabbing parece afectar más severamente el día glial neuropile y neuropile asociada a las célulasuna superficie de células de la corteza y gliales (Figura 3B). Procesos gliales parecen desorganizados en el neuropile, mientras que todavía mantiene su malla como organización en la corteza. Lesión resulta en GS2-positivo restos celulares, que es distinta de las células normales como fragmentos de desechos son mucho más pequeños y no conectado a un cuerpo de la célula. Esto revela daño neuropile asociados a células gliales (Figura 3B). Degenerando neuropile asociadas a las células gliales, también se observaron por microscopía electrónica 15. Anti-troceados-caspasa 3 + tinción apoptosis se observa en neuropile asociadas a las células gliales 15, demostrando que someterse a la apoptosis a puñaladas lesión. Neuropile células gliales asociadas también se muestra a fagocitar los desechos neuronal 15, y GS2 + señal también podría revelar el entrampamiento de neuronas apoptóticas por procesos gliales. Cleaved-caspasa + células apoptóticas se observan también en la corteza, al menos, algunas de las cuales corresponden a Elav + neuronas ( Uso de muestras fijas y inmunotinción también permite el análisis cuantitativo de las respuestas celulares a las lesiones, tales como efectos en la proliferación y la apoptosis. Para ello, hemos desarrollado a propósito ImageJ dos plug-ins, Larva caspasa DeadEasy y Glia DeadEasy, a contar automáticamente el número de células gliales y las células apoptóticas, respectivamente. Ellos han sido validados para trabajar en VNCs larvas y son muy precisos. El uso de estos, es posible observar un aumento en el número de REPO-positivas las células gliales causado por lesión punzante, por 22 hr (Figura 4A) 15. También hay un aumento en el número de anti-troceados-caspasa-3 células apoptóticas por 6 horas después de la punzante (Figura 4B) 15. Tal incremento en la proliferación glial y la apoptosis en respuesta a una lesión en el SNC de Drosophila es una reminiscencia de la respuesta de lesión en el SNC de vertebrados. Un aspecto crucial de esta protocol es la calidad de la disecciones VNC. Es difícil decir en el momento de la disección si los VNCs han sido dañados o no en el proceso. Es importante tener especial cuidado en realizar disecciones suaves. Sin embargo, las muestras de mala calidad, inevitablemente se producirá, y es esencial que estos están identificados en las etapas posteriores y se desecha. En nuestras manos, la degeneración VNC no parece estar relacionada a la lesión, pero en cambio causado por la disección áspera. No hemos observado un tamaño crítico en la herida lesión, y se analizan todas las muestras de heridas que no se degradan. Cuando VNCs mantener su integridad, la superficie tiende a VNC un aspecto liso y brillante, y sin agujeros en la neuropile se observó (Figura 5A). La degradación de VNCs puede ser reconocido por 24 horas después de la disección de la superficie rugosa de las áreas VNC ventral y lateral (Figura 5B). La degradación de la neuropile no relacionado con lesiones punzante también puede ocurrir, y se reconoce como neuropile holes en la señal de fondo de las muestras inmunoteñidas. Las muestras con estos signos de degeneración debe ser desechado (Figura 5C). En nuestras manos, la tasa de éxito para la disección y lesiones en el control intacto y apuñalado (yw) las moscas están en torno al 70%. Esta tasa variará con la habilidad de la persona que realiza los experimentos, y con el genotipo. 
Figura 1. Dibujo esquemático de las larvas de estadificación y punzante lesión. (A) En el día 0, las moscas se permite que ponen huevos en una placa de Petri zumo de uva durante 3 horas. Al día 1, las larvas eclosionadas primera estadio (L1) se recogen y se colocan en viales que contienen alimentos de levadura estándar, donde se mantienen durante otros 3 días. Al día 4, las larvas se recogen de vial de alimentos, y se utiliza para los experimentos agudos. (B) Vista lateral de la larva del sistema nervioso central.La región abdominal del cordón nervioso ventral es apuñalado con una aguja desde el lado dorsal. Anterior es a la izquierda, y posterior a la derecha. 
Figura 2. Time-lapse progresión de la lesión VNC. Microscopía confocal en vivo con VNCs axones GFP-etiquetados y DsRed-etiquetados células gliales. Genotipo:. UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / + (A) La lesión es reconocido por la falta de fluorescencia en el neuropile axonal. Después de apuñalar, GFP-negativos aparecen agujeros, a partir de entonces cada vez mayor en tamaño y número. Proyecciones de 5 secciones ópticas de cada punto de tiempo después de apuñalar a una lesión. (B) Las lesiones axonales encoge neuropile de 9 horas después de la puñalada. Estas imágenes son únicas secciones ópticas de diferentes puntos de tiempo después de apuñalar a una lesión. Para identificar posiciones equivalentes en cada muestra, el número mismo segmento de eapunto ch tiempo en la pila de datos de lapso de tiempo fue elegido. Mediante la comparación de los patrones visualizados con G9 y repoGAL4> UASmCD8GFP en la zona no afectada por el apuñalamiento, las rodajas se verificado como de las posiciones equivalentes en el eje Z. Las líneas de trazos en (A, B) indicar el borde de la herida. (C) de alta magnificación de las heridas en la neuropile. GFP-negativos agujeros estaban llenos de DsRed-positivas procesos gliales, y posteriormente desaparecido (puntas de flecha). Vista horizontal. Hasta anterior. 
Figura 3. Caracterización celular de lesión VNC. VNCs provistos de una membrana reportero GFP tethered para todas las células gliales (excepto las células de la línea media) teñidas con anti-GFP y anti-GS2, un marcador neuropile asociada a células gliales. Genotipo:. + / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / + (A) VNCs fueron apuñalados de la dorlado sal, pero esto hace mella ventralmente (puntas de flecha). Vista sagital de secciones ópticas individuales, dorsal izquierda y anterior. (A, B) Stabbing lesión afecta más severamente neuropile asociada a las células gliales que las células de la corteza y la superficie gliales. Lesión resulta en GS2-positivo restos celulares (puntas de flecha en B). (B) Vista horizontal de secciones ópticas individuales, hasta anterior. Las puntas de flecha apuntan a GS2 + restos celulares. (C) colocalización del marcador anti-apoptótica troceados-caspasa-3 y el marcador neuronal anti-Elav que muestra que después de la lesión algunas de las células que mueren en la corteza son neuronas. np, neuropile; cx, corteza. 
Figura 4. Recuento automático de células gliales y las células apoptóticas utilizando DeadEasy. (A) Ejemplo de uso de 'glia DeadEasy larval' contar REPO positivolas células gliales. Izquierda: VNC mitades ventral teñidas con anti-anticuerpos; REPO media: salida de la glía DeadEasy larvas que muestra células identificadas por el plug-in; derecha: se fusionan. Los números de la derecha son el número de células positivas REPO contados de forma automática en una pila completa de ópticas secciones confocales en unos 30 segundos. Aumenta el número de células gliales en los VNCs apuñalado. (B) Ejemplo de uso de 'larva caspasa DeadEasy'. Proyecciones de las 5 secciones ópticas confocales teñidas con anti-cleaved caspasa-3 anticuerpos; medias: Salida izquierda que muestra células identificadas por el plug-in; derecha: Merge. Los números de la derecha son el número de la caspasa-positivas células contadas automáticamente en una pila entera de ópticas secciones confocales en unos 30 segundos. El número de células apoptóticas aumenta en la apuñalado VNC. 
Figura 5. Ejemplos de degeneration. (A) Un saludable VNC. No hay señales de degeneración. (B) El lado del tórax está degenerando (puntas de flecha) en una muestra apuñalado. El asterisco indica lugar de la lesión. (C) Los agujeros en la neuropile torácica (punta de flecha blanca) y la corteza (naranja punta de flecha) en un no-apuñaló VNC. Las muestras con vacuolización dañado neuropile y extenso debe ser desechada. Aquí VNCs se tiñeron con la neuropile marcador asociado anti-glial Ebony. Vista horizontal, hasta anterior.
Discussion
Hemos establecido un protocolo para apuñalar lesión en el SNC de Drosophila de larvas para investigar las respuestas celulares a las lesiones, la reparación y la regeneración. VNCs larvas se diseccionaron y apuñalado, tras lo cual se filmó con microscopía de time-lapse o fijada para la inmunotinción de fluorescencia para visualizar la glía y neuronas, la apoptosis o la división celular. La progresión de la lesión con el tiempo se puede medir. Este método está acompañado por el software desarrollado a propósito para el análisis cuantitativo y estadístico de los cambios en el número de células después de la lesión y durante la reparación.
Nos apuñaló 96 horas larvas AEL (y estos se fijaron bien o permitido desarrollar otra forma), una etapa de desarrollo antes de la transición a pupa y luego mosca adulta. A las 96 h, VNCs son lo suficientemente grandes para punzante, que están en el medio de tercera etapa instar, y por lo tanto no están sometidos a la pupación todavía, y el sistema nervioso ya es totalmente funcional similar a la de la adULT. Podría ser posible para apuñalar a un poco más tarde en las larvas y el momento preciso debe ser elegido para satisfacer la pregunta de investigación. Sin embargo, en función de las preguntas planteadas, generalmente será necesario cultivar los VNCs durante algún tiempo para observar las respuestas celulares a la lesión. Algún tiempo después de 120 aperturas pupación hr AEL, un período en el SNC es remodelado y por lo tanto es mejor evitar. Así, la ventana de tiempo para apuñalar a la cultura más en la larva es bastante restringido. Uso de las larvas aún tiene una gran ventaja técnica sobre el uso de los adultos: mientras que, de manera similar a la de adultos, el sistema nervioso es ya completamente funcional, el análisis de la respuesta a la lesión es considerablemente más fácil y más rápido en las larvas.
Al comparar el tamaño y la morfología de los cerebros y VNCs disecados y se cultivaron en una placa a VNCs que se hayan diseccionado en un punto de tiempo equivalente más tarde sin cultivar en un plato, parece que el desarrollo es más lento en su cultivo que in vivo. En otros aspectos,desarrollo lleva a cabo normalmente en la cultura, la integridad del tejido se conserva y las células están vivas mostrando múltiples respuestas. Expansión de heridas, la reparación y la proliferación glial neuropile tener lugar dentro de 22 horas después de la puñalada. Esto muestra que las respuestas celulares a lesiones tienen lugar en la cultura y hay más probabilidades hay necesidad de mantener los explantes durante más de un día. Si la cultura a largo plazo se desea, el protocolo puede requerir una mayor optimización, tales como el uso de un inserto de placa de cultivo 5.
Es importante para identificar las muestras de buena calidad de los degeneración. Optimización de este protocolo tiene cierta habilidad y degeneración inevitablemente se producirá en algunos ejemplares. El VNC puede adquirir un 'coliflor' apariencia que refleja una ruptura de la integridad del tejido (Figura 5B). Degeneración también es reconocido por la vacuolización de la VNC independientemente del apuñalamiento, que puede estar presente en intacta, no apuñalados muestras (Figura 5C
En este protocolo, que se aprovechó de una línea de trampas de moscas de la proteína para visualizar el neuropile en paralelo a la visualización de los procesos gliales utilizando el tradicional GAL4-UAS sistema. Estas herramientas también se podría combinar con otros sistemas binarios de expresión tales como la LexA 19 y Q-sistema 20, que son independientes de GAL4. Esto permitiría el análisis de las interacciones, por ejemplo entre los axones y procesos gliales, en respuesta a una lesión. Por más que la combinación con otras herramientas genéticas como reporteros de dendritas 21 o la entrada de calcio 22, este método proporciona una gran oportunidad para analizar la biología de las células detrás de la respuesta lesión de las células gliales, axones y dendritas neuronales en el sistema nervioso central. Finalmente, este método se puede combinar con la genética estándar, las mutaciones y la sobre expresión de genes, para probar la función de genes en respuesta a una lesión y regeneración.
Este protocolo ha dirigido con éxito para el descubrimiento de un gen de red subyacente en la respuesta regenerativa glial a la lesión del SNC 11. En vista de la conservación evolutiva de la función de genes, desentrañando los eventos celulares y las funciones de genes en moscas de la fruta puede proporcionar importantes conocimientos sobre la comprensión de la maCNS mmalian respuesta a la lesión y regeneración.
Disclosures
No existe conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Mei Ann Lim para la lectura crítica del manuscrito y otros miembros de nuestro laboratorio para sus debates a lo largo del curso de este trabajo. Este trabajo fue financiado por la Fundación Científica Yamada y Royal Society Becas corta visita y la Unión Europea Marie Curie Fellowship GRR Internacional Entrante a KK, y BBSRC Proyecto Grant (BB/H002278/1) y Wellcome Trust Equipo Grant (073228/Z/03/Z) a AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Staining block | Brunel Microscope | ||
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
| Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
| Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
| Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
| 35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
| Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
| Reagent | |||
| Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
| FBS | Sigma | F7524 | |
| Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
| Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
| Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
| Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
| Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
| Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
| Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
| Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 | |
References
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