Summary
וקטורים ויראליים לאפשר למניפולצית גן ממוקדת. אנחנו מדגימים את שיטה לביטוי גנים מותנים או אבלציה בחוט שדרת העכבר, באמצעות הזרקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית, אתר בולט של קשר הסינפטי בין afferents החושיים הראשוניים ועצב של מערכת העצבים המרכזית.
Abstract
הזרקת Intraparenchymal של וקטור ויראלי מאפשרת מניפולציה גנטית מותנית באוכלוסיות שונות של תאי עצב או באזורים מסוימים של מערכת העצבים המרכזית. אנחנו מדגימים את טכניקת הזרקת stereotaxic המאפשרת ביטוי ממוקד גן או השתקה בקרן האחורית של חוט שדרת העכבר. הליך הכירורגים קצר. זה דורש laminectomy של חוליה אחת, לספק להתאוששות מהירה של בעל החיים שאינם פגומה ותנועתיות של עמוד השדרה. הזרקה מבוקרת של נפח השעית וקטור קטן במהירות ושימוש נמוך של microsyringe עם צינורית זכוכית משופעת למזער את הפגיעה ברקמות. התגובה החיסונית המקומית לווקטור תלוי במאפיינים הפנימיים של הווירוס מועסק; בניסיון שלנו, זה קל וקצר ימים, כאשר וירוס אדנו הקשורים בשימוש. גן כתב כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר מאפשר פיזור המרחבי ניטור של הווקטור, ואת היעילות והסלולרי specificity של transfection.
Introduction
טכנולוגיות מתקדמות של מניפולציה גנטית מותנית בעכבר מאפשרות גישות רבות פנים לחקר מסלולים וקשרים סינפטיים תפקודיים במערכת העצבים המרכזית. Transgenes עשוי להיות מוסדר על ידי effectors מולקולה קטנה כגון דוקסיציקלין פועלת על transactivator טטרציקלין מבוקר, אשר יכול להיות מתוכנן לתפקד כמדכא או activator של שעתוק גנים, או טמוקסיפן הכרת תחום מוטצית יגנד מחייב של קולטן אסטרוגן 1 . שינוי בלתי הפיך transgene מושגת בדרך כלל על ידי חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) recombinases. Cre (רקומבינציה סיבות) וFLP (אנזים רקומבינציה flippase) לזרז את הכריתה, היפוך או טרנסלוקציה של מקטעי דנ"א המוקפים loxP (לוקוס של x המעבר מעל, P1) או FRT (יעד ההכרה flippase) אתרים בהתאמה 1. יישומים כוללים הפעלת גן או השתקה וחומצה ריבונוקלאית מושרה (RNA) הפרעות
= "Jove_content"> עם זאת, הגבלת מניפולציה גנטית לאוכלוסיות שונות של תאי עצב או באזורים מסוימים של עניין לא יכולה להיות מושגת על ידי מיקוד גנטי לבד אם אמרגן ספציפי לאוכלוסיית הנוירון של ריבית אינו ידוע או שאינו באו לידי ביטוי בכל תאי העצב באזור של עניין. בחוט השדרה, עיצובים ניסיוניים עשויים לדרוש הגבלה המרחבי של המניפולציה הגנטית לקטע אחד או שתיים craniocaudal. הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי שמבטא Cre או FLP מאפשר הגבלת רקומבינציה גן לאזורים בחוט השדרה של עכברים שבברי DNA הם מוקפים אתרי FRT loxP או, מה שמכונה אללים floxed או flrted. בניגוד לארגון מחדש דנ"א מכונן, אשר יגרום מהכלאת החיות עם עכברים המבטאים recombinase, אסטרטגיה זו גם מספקת שליטה זמנית על הפעלת גן או השתקה. וקטורים ויראליים קידוד floxed או פלירטט transgenes להציע אופציה הפוכה של מניפולציה גנטית בעכברים המבטאות את corresponding מורד recombinase של אמרגן נוירון ספציפי. כמה וקטורים רקומביננטי עם זיקה לנוירונים זמינים 4. קיבולת גבוהה אדנווירוס (פחדן), וירוס adeno-משויך, וירוס הרפס סימפלקס וlentivirus משמשים וקטורי neurotropic. בחירת הווירוס המתאים לשאלת מחקר היא חלק מכריע בעיצוב ניסיוני. גודל transgene, מסלול משלוח, סגולי של הזיהום לנוירונים בניגוד לתאי גליה, יעילות זיהום, תופעות לוואי רעילות דלקתיות וצריכות להילקח בחשבון 4.
כאן אנו מתארים את זריקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית של חוט השדרה, טכניקה שאנו נוקטים לויסות גנים מותנות במחקר שלנו על נוירוביולוגיה של כאב. הקרן הגבתה מקבלת קלט מביא מהנוירונים חושיים עיקריים כוללים נוירונים nociceptive. interneurons המקומי לעבד את המידע לפני נוירונים הקרנה להעביר אותו מקרן האחורית למוח 5. אנחנו מדגימים את הזיהום של נוירונים קרן אחורית ברמה מגזרית שדרת L4 עם וירוס neurotropic אדנו-משויך (rAAV) שמבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGfp) תחת אמרגן ציטומגלווירוס constitutively פעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ההליך כירורגי תאר אושר על ידי בעלי החיים וטיפול המוסדי ועדת שימוש (IACUC) מאוניברסיטת קולומביה.
1. הכנת הציוד והשעית חלקיקי וירוס
- לנקות ולחטא את הציוד, לעקר את מכשירי ניתוח ואת הקוצים לחרוץ V שישמשו לתיקון החוליה L1.
- משוך וpipettes זכוכית פוע. אנו משתמשים pipettes בעלי קוטר קצה של 40 מיקרומטר והם משופעים בזווית של 20 מעלות. לעקר את pipettes הזכוכית.
- הגדרת מסגרת stereotaxic, הר microsyringe המזרק על מניפולטור ולהתחבר למזרק הבקר.
- צרף אחד מpipettes הזכוכית לשימוש בערכת microsyringe הולמת הדחיסה.
- הסר את הבוכנה מmicrosyringe ולמלא את המזרק עם שמן מינרלים. השמן האדום O (1 - (2,5-דימתיל-4-(2,5-dimethylphenylazo) phenylazo)-2-naphthol) ניתן יהיה להוסיף לשמן המינרלים להגדיל visibility. החזר את הבוכנה ולדחוף אותו לכל אורך הדרך עד לקצה. זהירות להימנע מיצירת בועת אוויר.
- הכן את השעית חלקיקי הנגיף בארון בטיחות ביולוגי. הפשר את הווירוס הקפוא על קרח, ורגע לפני השימוש, לדלל אותו עם סטרילי שנאגר מלוח פוספט לריכוז החלקיקים הרצויים.
- הכנס microsyringe לתוך המחזיק במזרק.
- 5 μl פיפטה של השעית הווירוס על גבי יריעת פלסטיק קטנה, למשל Parafilm. הנמך את קצה פיפטה זכוכית לירידה ומשוך את הבוכנה למלא microsyringe. יצירת בועת אוויר קטנה בקצה פיפטה כדי למנוע ממנה הסתימה.
2. Laminectomy
- הכן את אזור הניתוח על ידי ניגוב ספסל וכרית חימום עם חומר חיטוי.
- הרדם את העכבר. אנו משתמשים בהרדמת משאיפת עם isoflurane (3% במהלך אינדוקציה, 2% -3% במהלך תחזוקה).
- הנח חומר סיכה על כל עין כדי להגן על העיניים מפני התייבשות במהלךפעולה.
- לגלח את הפרווה מהגב התחתון לצוואר של העכבר ולחטא את העור עם לסירוגין מגבונים של חיטוי אקטואלי כגון כלורהקסידין או povidone-יוד ו70% אתנול. לבודד את האתר נקי מחיידקים, שהוכן עם וילון כירורגית ולחדור אתר החתך עם bupivacaine (0.25%, 1:10 מדוללים עם תמיסת מלח פיזיולוגית).
- חתוך העור בקצה הזנב של כלוב הצלעות לאורך קו האמצע (2-3 סנטימטר) ולהפריד את fascia מכסה את עמוד שדרה.
- כי חוט השדרה מפסיק לגדול מוקדם יותר במהלך התפתחות לאחר לידה מעמוד השדרה, קטע שדרת L4 טמון מתחת לחוליה הראשונה (L1). חולית L1 נמצא זנב לחוליה שמחזיקה את הזוג האחרון של צלעות. לזהות ולחשוף את החוליה L1 ידי הסרה את השרירים והרצועות בעמוד השדרה הקטנים צמודות למשטח הגב שלה.
- מעט להרים ולהחזיק L1 חוליה עם כ מלקחי Adson. השתמש במלקחי Laminectomy ייעודיים להסרת portio הגבהn של החוליה (עמוד שדרה וlamina) ולחשוף את חוט השדרה. להימנע מהפגיעה בחוט השדרה.
- העבר את העכבר על גבי צלחת החימום במסגרת stereotaxic. לנטר את הטמפרטורה של העכבר במהלך המבצע הבא.
3. הזרקה
- תקן החוליה L1 עם קוצים לחרוץ V. את הקוצים חייבים לייצב את עמוד השדרה, כך שהחוליה לא זזה במהלך נשימה.
- הבא microsyringe קרוב יותר, כך שקצה פיפטה הוא מעל אתר laminectomy. מנמיך את הבוכנה, עד שאתה רואה את השעית וירוס יציאת פיפטה. הסר את האגל בקצה כותנת סטרילי.
- מקם את קצה פיפטה במקורי ביותר חלק מחוט השדרה החשופה. מרכז פיפטה לעיל מענית החציון האחורית, ואז להעביר את הקצה רוחבי 500 מיקרומטר. הנמך את הקצה אל פני השטח של החוט ולנקב את דורת מאטר, או אם אתה עובד עם כוס טפטפה unbeveled, השתמש צינורית פלדה משופעת לנקב דURA. הנמך את הקצה של 300 מיקרומטר זכוכית פיפטה לתוך חוט השדרה.
- הזרק μl 1 מתוך השעית וירוס בשיעור של 200 nl / דקה.
- בסופו של הזריקה, לחכות לפחות 2 דקות לפני לאט חוזר בי פיפטה.
- חזור על שלבים 3.3-3.5 בזנב ביותר החלק מחוט השדרה החשופה כדי להשיג הפצה מלאה של וקטור ויראלי בL4 קטע שדרה. שני אתרי ההזרקה נמצאים מקורי וזנב של L4 המגזר, כדי למנוע ניזק לרקמות באזור היעד.
4. סגירת פצעים
- שחרור החוליה L1 ממהדקי חריץ V ולהסיר את העכבר ממסגרת stereotaxic.
- לתפור fascia עם 5.0 vicryl. Fascia הסגור מספק כיסוי לאתר laminectomy.
- סגור את העור עם תפרי ניילון או סיכות ניתוחיות.
5. טיפול לאחר הניתוח
- העבר את העכבר לכלוב התאוששות עם מצעים רכים, nonparticular. מניח אותו על לאהוא הצד לנשימה נוחה. פקח את החיה עד שהוא ערני לחלוטין, נודד ומתחיל לשתות.
- אנו מספקים שיכוך כאבים לאחר ניתוח במשך 72 שעות ביום זריקות תת עורית של carprofen (5.0 מ"ג / ק"ג).
- פקח על התאוששות לאחר ניתוח על ידי בדיקה יומית במשך 3 הימים הראשונים, ולאחר מכן בכל יום אחר, או 3 ימים בשבוע עד לניסוי הושלם.
- הסרת תפרי העור או סיכות 7 עד 10 ימים לאחר הניתוח, כאשר ריפוי פצע הוא מוחלט.
- להרדימו לאחר השלמת הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תשואות transfection מוצלחות ביטוי גנים בתאי עצב חזק של קרן האחורית הזרקה (איור 1), שאינו מרבה הקרן האחורית של הצד הנגדי, הקרן הבטנית וגרעיני השורש הגבו.
איור 1. Transfection של נוירונים קרן אחורית. () ביטוי של eGfp כתב הניאון (ירוק) בקרן האחורית השמאלית של חוט שדרת L4, שבועות לאחר הזרקת stereotaxic של rAAV-eGfp (סרוטיפ AAV2 / 8, 10 9 עותקי הגנום / μl). הנוירונים היו immunostained לחלבון גרעינים עצבי (NeuN, אדום). חץ עומד בראש נקודה לתאי גליה transfected פזורים בעמודה הגבי. סרגל קנה מידה, 150 מיקרומטר. (ב ') כ 80% מתאי העצב בקרן הגבתה המדיאלי היו נגועים. סרגל קנה מידה, 20 מיקרומטר. נוגדן חד שבטי כנגד NeuN (EMD Millipore) שמש בדילול 1:2,000 לimmunostaining.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הזרקת הווקטור Stereotaxic מאפשרת מיקוד תאי עצב בחוט שדרה עבור יישומים כגון מיפוי רשת עצבית המבוסס על הנגיף מתפשט transsynaptic 6,7 או נתיחת optogenetic 8, הדרכת האקסון במהלך רגנרציה מפציעת 9,10, או טיפול גנטי למניעה או הטיפול של 11 ניוון מוחיה, 12. וקטורים נגיפיים שמשו במשך מניפולציה גנטית בחוט השדרה ללמוד מסלולים חושיים, מוטוריים ואוטונומי 9,10,13-15. העכבר הוא אורגניזם המודל הנפוץ ביותר במחקרים שכלל זריקת stereotaxic של וקטור ויראלי במוח או בחוט השדרה, אבל הטכניקה הייתה מועסקת במינים אחרים כולל 16 פרימטים לא אנושיים.
הזרקת הווקטור Stereotaxic לתוך חוט שדרת העכבר היא בטוחה; ההליך כירורגי שתואר כאן מחייב laminectomy יחיד באזור הזריקה כדי שבעל החיים מתאוששים בלי instability בתנועות עמוד השדרה שלה. הזרקה והסרה איטית של הצינורית הן מלאים בתוך 10 דקות, כל התהליך כולל הכנת עור וסגירת פצע נמשך כ 40 דקות. אנו מספקים הרדמה לאחר ניתוח במשך 72 שעות עם carprofen, סם משכך כאבים נוגדים דלקת לא סטרואידיות.
כדי למזער את טראומת רקמות, אנו מעסיקים cannulas הזכוכית משך בקוטר טיפ של 40 מיקרומטר. קצה צינורית משופעת חד מקל הכנסה לתוך חוט השדרה, המצדיק את ההשקעה במטחנת micropipette. שימוש במטחנה מאפשר גם שמירה על זווית שיפוע עקבית בכל ניסוי, הפחתת וריאציה של תוצאות ההזרקה. אנחנו מעדיפים שליטה אוטומטית של מהירות הזריקה מעל 17 היתר ידניים לחלוקה שווה של השעית חלקיקי הנגיף בקרן האחורית וכדי להפחית את הסיכון של טעות בהזרקה. לא פחות קריטי הוא חילוץ איטי של הצינורית, שאמור להיות יזם 2-5 דקות לאחר שסיים את injectiעל מנת להימנע מהסקת השעית וירוס גיבוי וגרימת דליפת extraspinal.
במידה והפצה של transfection intraspinal תלויה במינון המוזרק חלקיקים ותכונות פנימיות של וקטור ויראלי כגון סרוטיפ ויעילות זיהום. דילול החלקיקים האופטימלי יש לקבוע באופן אמפירי עבור כל וירוס וסרוטיפ ועשוי להשתנות בין קבוצות שונות של אותו הנגיף. יעילות של שניהם זיהום ותמרת דנ"א יכולה גם להשתנות בהתאם לאוכלוסייה הממוקדת של תאי עצב 18,19. AAV משיג העברת גנים בתאי עצב, ללא תופעות לוואי והפתוגני חיסוניות מינימאליות 20. מניסיוננו, הזיהום של נוירונים קרן אחורית יושלם בתוך 1-2 שבועות ויציבים. אנו צפינו בתגובות microglial קלות באתרי הזרקה אך אלה נפתרו בתוך שבוע אחד.
אנו ממליצים להשוות זנים שונים של וקטורים המבטאים את גן כתב כגון eGfp צוות ההערכהuate שיעורי transfection, לקבוע את מרווחי הזמן בין ההזרקה וtransfection היציב ולקבוע אם הזיהום הוא מוגבל לתאי עצב. הספציפיות תהיינה תלויות בזיקת התא של הווקטור, גן transfected והאמרגן שלה. חוקרים לומדים מסלולים חושיים צריכים גם לבחון תאי עצב גנגליון שורש הגבו לביטוי פוטנציאל של גן הכתב, שיכול לנבוע מזיהום של הנוירונים האלה במסופים המרכזיים שלהם בקרן הגבתה או מזיהום של הנוזל השדרתי 19.
בארצות הברית, השימוש בוקטורים ויראליים למניפולציה גנטית מוסדר בהנחיות NIH למחקר מעורב מולקולות DNA רקומביננטי (http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html). הנחיות אלה קובעות דרישות להכשרת חוקר, מיגון אישי, כלת וקטור ויראלי, decontamination, סילוק חומרים מזוהמים כגון מזרקים משומשים וcannulas ודיור חיה לאחר ההזרקה. חוקרים צריכים לעבוד עם IACUC המקומי או גוף מקביל של פיקוח מוסדי לקבוע הכללים והחוקים החלימו על המחקר שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים Bakhos א טנוס, Ph.D., מנהל פיתוח וקטור וההפקה במרכז למדעי מוח בית החולים כלליים מסצ'וסטס, Charlestown, מסצ'וסטס, שספק לנו את וקטור rAAV-eGfp, וג'ון בנג לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01 NS050408 (לי.ס.) מהמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
