Summary
Intracellular सीए
Abstract
शुक्राणु विशेष रूप से, तक पहुंचने को समझते हैं और अंडे के साथ फ्यूज करने के लिए डिज़ाइन पुरुष प्रजनन कोशिकाओं रहे हैं. इन कार्यों को करने के लिए, शुक्राणु कोशिकाओं के एक लगातार बदलते माहौल का सामना करने के लिए और कई शारीरिक बाधाओं को दूर करने के लिए तैयार रहना चाहिए. Transcriptionally और translationally चुप सार में होने के नाते, इन गतिशील कोशिकाओं पूरबी खुद को विविध संकेतन तंत्र पर गहराई से भरोसा करते हैं और एक निर्देशित फैशन में तैरना, और अंडे खोजने के लिए अपनी यात्रा के दौरान पर्यावरण की स्थिति को चुनौती देने के साथ संघर्ष किया. विशेष रूप से, सीए 2 + की मध्यस्थता संकेत कई शुक्राणु कार्यों के लिए निर्णायक है: गतिशीलता, कैपेसिटेशन (अग्रपिण्डक प्रतिक्रिया के लिए शुक्राणु तैयार करता है कि एक जटिल प्रक्रिया) और अग्रपिण्डक प्रतिक्रिया (शुक्राणु अंडे विलय की अनुमति देता है कि एक exocytotic घटना) की सक्रियता. इस आयन के intracellular उतार चढ़ाव पर नज़र रखने के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग के आवेदन, संवेदनशीलता के अपने आसानी के कारण उल्लेखनीय महत्व का है, और डेट की चंचलताection. एक एकल डाई लोडिंग प्रोटोकॉल का उपयोग हम शुक्राणु सीए 2 + गतिशीलता की निगरानी के लिए चार अलग fluorometric तकनीकों का उपयोग. प्रत्येक तकनीक दोनों एकल कक्ष और सेल की आबादी के स्तर पर डेटा पैदा करने, स्थानिक और / या अस्थायी समाधान के लिए सक्षम बनाता है कि विशिष्ट जानकारी प्रदान करता है.
Introduction
सीए 2 + कोशिकाओं में संकेत पारगमन मार्ग की एक सार्वभौमिक दूसरा दूत है. Intracellular सीए 2 + (सीए 2 + झ) उत्तेजनीय और गैर उत्तेजनीय दोनों कक्षों में कई मौलिक शारीरिक प्रक्रियाओं के नियमन में भाग लेता है. 2 सीए का महत्व और सार्वभौमिकता + दूसरा दूत के रूप में संकेत पारगमन घटनाओं के दौरान सेल के भीतर सूचना के प्रसारण में अपनी spatio-अस्थायी बहुमुखी प्रतिभा से ली गई है. सीए 2 + डी नोवो या सेल, इसके intracellular एकाग्रता ([सीए 2 +] मैं) के भीतर अपमानित संश्लेषित नहीं किया जा सकता अलग सेलुलर लगातार बफर, पृथक, compartmentalize कि तंत्र और / के माध्यम से बहुत सख्त सीमा के भीतर बनाए रखा या 2 सीए जमा है जबकि +. इस आयन की एकाग्रता में परिवर्तन सेल 1 भीतर अत्यधिक स्थानीयकृत क्षेत्रों में पाए जाते हैं, और इस तरह के उतार चढ़ाव का गूढ़ रहस्य एक डी पाने के लिए आवश्यक है सकते हैंसंकेतन तंत्र में (1) उनकी भूमिका, (2) उनकी शारीरिक महत्व, और संकेतन सेल की (3) सामान्य तंत्र की eper समझ. सीए 2 + की मध्यस्थता संकेत शुक्राणु फिजियोलॉजी 2 में विशेष महत्व का है. शुक्राणु गतिशीलता निषेचन की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण कार्यों में से एक है, और वास्तव में, कई शुक्राणु गतिशीलता दोष बाँझपन 3-5 पैदा कर सकता है. + कशाभी आंदोलन में 2 सीए के महत्व 6 में पहचाना गया है, लेकिन, सीए 2 + कशाभी झुकने की विशिष्ट प्रपत्र पर नियंत्रण कैसे की व्यवस्था पूरी तरह से नहीं समझा गया है.
अंडे के साथ fusing पहले, शुक्राणु कैपेसिटेशन, महिला पथ के अंदर शुक्राणु निवास पर निर्भर एक जटिल प्रक्रिया से गुजरना होगा. कैपेसिटेशन के दौरान, शुक्राणु झिल्ली के लिपिड वास्तुकला और संगठन मुख्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली से कोलेस्ट्रॉल को हटाने का एक परिणाम के रूप में, संशोधित कर रहे हैं. साथ ही, कई प्रोटीन टाइरोसीन-भास्वर हैं7 ylated. महत्वपूर्ण बात है, कैपेसिटेशन दौरान वहाँ intracellular पीएच में वृद्धि (पीएच मैं) है और में [सीए 2 +] मैं, और झिल्ली संभावित कुछ प्रजातियों 2 में hyperpolarizes. कैपेसिटेशन ही शुक्राणु (20-40%) के एक subpopulation में जगह लेता है, और इन सभी सेलुलर परिवर्तन में शामिल तंत्र स्पष्ट से दूर हैं. यह आम तौर पर शारीरिक inductors के संपर्क में जब capacitated शुक्राणु का केवल एक subpopulation अग्रपिण्डक प्रतिक्रिया (एआर) से गुजरना स्वीकार किया है कि. एआर भी (बाहरी और भीतरी झिल्ली के साथ विशेष organelle) एक अग्रपिण्डक रखने सभी प्रजातियों में निषेचन के लिए आवश्यक एक सीए 2 + विनियमित घटना है. इस प्रक्रिया के दौरान शुक्राणु के प्लाज्मा झिल्ली के साथ बाहरी acrosomal झिल्ली फ़्यूज़, शुक्राणु सेल अंडा (zona pellucida, या जिला परिषद) के आसपास के glyco-प्रोटीन मैट्रिक्स प्रवेश करने देते हैं कि hydrolytic एंजाइमों को रिहा. एआर भी साथ सूचना का आदान प्रदान एक नया fusogenic शुक्राणु कोशिका की सतह उजागरदोनों gametes के अंतिम संलयन के लिए अंडा प्लाज्मा झिल्ली. ए.आर., प्रोजेस्टेरोन सबसे अधिक उन के बीच अध्ययन से एक होने के लिए प्रेरित कि कई सेलुलर ligands के हैं.
इस काम में हम को मापने के लिए एक सीए 2 + संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई के प्रयोग को शामिल चार विभिन्न तकनीकों उपस्थित [सीए 2 +] मैं प्रोजेस्टेरोन से चालू होने वाले मानव शुक्राणु में बदलाव (हम [2 सीए मापा जिसमें प्रवाह cytometry, के लिए छोड़कर + ] मैं) इन विट्रो कैपेसिटेशन प्रक्रिया में दौरान प्रेरित वृद्धि हुई है. इस विशेष मामले में हम इस्तेमाल Fluo-3 (ए. जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड द्वीप, NY) के साथ एक झिल्ली पारगम्य डाई एक कश्मीर घ = 325 एनएम. इन विट्रो में हम तरीके से तीन के साथ समय के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति परिवर्तन पर नजर रखी, और चौथे तकनीक के साथ हम समय में एक भी भी बिंदु पर प्रतिदीप्ति मूल्यों मापा. कुल मिलाकर वे स्थानिक और लौकिक जोड़कर उपलब्ध कराने के बाद से इन अलग अलग दृष्टिकोण, एक दूसरे के पूरकएकल कक्ष और सेल जनसंख्या दोनों स्तरों पर olution.
सेल जनसंख्या या थोक प्रयोगों
वे अच्छी तरह से स्थापित, सरल कर रहे हैं, और एक ही प्रयोग में कोशिकाओं के लाखों लोगों पर प्रदर्शन माप से जानकारी की औसत के लिए अनुमति देते हैं क्योंकि वे आवश्यकता के साधन भी आसानी से उपलब्ध हैं, लेकिन क्योंकि थोक तकनीक बड़े पैमाने पर न केवल उपयोग किया जाता है.
तकनीक # 1. परम्परागत fluorometry
इस तकनीक को समय के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन पर नज़र रखता है, प्रयोगों 200 से 1,000 μl लेकर नमूना संस्करणों के साथ कांच cuvettes में प्रदर्शन कर रहे हैं. जोड़ा अभिकर्मकों का उचित मिश्रण चुंबकीय सरगर्मी की आवश्यकता है, और प्राप्त इसलिए अस्थायी समाधान सेकंड के क्रम में है. विश्लेषण के नमूने की ठेठ सेल एकाग्रता सीमा 10 5 -10 8 कोशिकाओं / एमएल है.
तकनीक # 2. रूका प्रवाह fluorometry
टीउनकी तकनीक भी समय के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन पर नज़र रखता है, लेकिन अभिकर्मकों तेजी से एक बहुत छोटा सा नमूना मात्रा (25-100 μl से लेकर) युक्त एक रिकॉर्डिंग क्युवेट में (दबाव का प्रयोग करके) एक साथ मिश्रित कर रहे हैं. इसलिए, अभिकर्मकों के homogenization मिसे के क्रम में एक उच्च अस्थायी समाधान सक्षम करने से तात्कालिक है. परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति बनाम समय निशान का विश्लेषण विश्लेषण नमूनों की आम सेल एकाग्रता रेंज है अल्पकालिक प्रतिक्रिया मध्यवर्ती, आदि के बारे में जानकारी प्राप्त करने, प्रतिक्रिया तंत्र की जटिलता elucidating, प्रतिक्रिया दरों के निर्धारण के लिए उपयुक्त हैं 10 5 -10 7 कोशिकाओं / एमएल.
सिंगल सेल प्रयोगों
थोक प्रयोगों कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या का औसत व्यवहार की रिपोर्ट है, लेकिन, एक जनसंख्या अक्सर माप के इस प्रकार के दौरान अनदेखी कर रहे हैं कि विषम गुण प्रदर्शित कर सकते हैं. सिंगल सेल तकनीक इस प्रकार वें पूरक करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंई जानकारी सेल आबादी प्रयोगों से प्राप्त की.
तकनीक # 3. फ्लो
एकल कक्ष माप से उत्पन्न होने वाली जानकारी के महत्व के बावजूद, यह एक पूरी आबादी के लिए सेल विशिष्ट गुणों की गलत एक्सट्रपलेशन को रोकने के क्रम में कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस कारण से, उच्च throughput तकनीक इष्ट हैं और सबसे लोकप्रिय विधि हालत प्रति 10,000 कोशिकाओं पारंपरिक विश्लेषण कर रहे हैं, जिसमें प्रवाह cytometry है. यह उनके आकार (आगे तितर बितर (एफएससी)), विघटन (पक्ष तितर बितर (एसएससी)) और प्रतिदीप्ति तीव्रता (एक एंटीबॉडी के साथ विशिष्ट लेबलिंग, व्यवहार्यता मार्कर, आदि) के अनुसार कोशिकाओं categorizes के रूप में इस विधि विषम आबादी के मल्टी पैरामीट्रिक विश्लेषण सक्षम बनाता है , इस प्रकार की कोशिकाओं के एक समूह के लिए मापदंडों के वितरण के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं. प्रवाह cytometry बल्कि समय पर निर्भर जानकारी 8 से तत्काल प्रदान करता है. आगे और पक्ष बिखराव मूल्यों की गिरफ्तारीकोशिकाओं शामिल है, लेकिन प्रतिदीप्ति माप, नकारात्मक और सकारात्मक प्रतिदीप्ति नियंत्रण के लिए सेलुलर मलबे, धूल, आदि भेदभाव कि एक फाटक के चयन के लिए भी उपयोगी ई भी शामिल किया जाना चाहिए. एक से अधिक प्रतिदीप्ति चैनल का इस्तेमाल किया जाता है, तो मुआवजे के रूप में जाना प्रक्रिया (विवरण देखने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). मुआवजा fluorophores के बीच वर्णक्रमीय ओवरलैप भेदभाव के लिए अनुमति देता है. प्रवाह cytometry भी propidium आयोडाइड धुंधला के माध्यम से आम तौर पर, मृत कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति देता है.
तकनीक # 4. सिंगल सेल इमेजिंग
माइक्रोस्कोपी एकल कक्ष के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक आम तरीका है, यह अच्छी तरह से समय पर निर्भर पढ़ाई के लिए अनुकूल है और यह भी स्थानिक संकल्प प्रदान करता है. एक प्रमुख दोष उच्च throughput विश्लेषण वर्तमान समय में अपनी प्रारंभिक अवस्था में ही है
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Protocol
इस पत्र में हम को मापने के लिए चार ऊपर उल्लिखित तकनीक का उपयोग रिपोर्ट [सीए 2 +] मैं मानव शुक्राणु कोशिकाओं में बदल जाता है. यह अच्छी तरह से इस स्टेरॉयड एक क्षणिक [सीए 2 +] मैं शुक्राणु में वृद्धि है कि उत्पादन की स्थापना की है, जैसा कि हम एक सीए 2 + प्रतिक्रिया को गति प्रदान करने के लिए प्रोजेस्टेरोन का इस्तेमाल किया. विशेष रूप से, मानव शुक्राणु में, प्रोजेस्टेरोन सीधे शुक्राणु कोशिकाओं 10,11 के प्लाज्मा झिल्ली में विशेष रूप से व्यक्त की एक सीए 2 + चैनल (अर्थात् CatSper) सक्रिय. हम भी मापा आराम [सीए 2 +] मैं यह भी व्यापक रूप में वृद्धि [सीए 2 +] मैं कैपेसिटेशन दौरान होता स्वीकार किया है कि यह देखते हुए कि कैपेसिटेशन पहले और बाद में. न्यूनतम प्रतिदीप्ति मूल्य के लिए, हम प्रतिदीप्ति बुझाने + करने के लिए करोड़ 2 इस्तेमाल किया, एक सकारात्मक नियंत्रण की आवश्यकता होती तकनीक के लिए हम + ionophore-ionomycin को सेल में अधिक से अधिक सीए 2 + तेज प्रेरित है, और इस प्रकार, अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया एक सीए 2 इस्तेमाल किया.
1. स्विम अप विधि द्वारा शुक्राणु नमूना तैयार (चित्रा 1 देखें)
का प्रयोग केवल ejaculated (हस्तमैथुन करके प्राप्त) नमूने जिसका विशेषताओं विश्व स्वास्थ्य संगठन प्रयोगशाला मैनुअल (पर उपलब्ध का नवीनतम संस्करण द्वारा स्थापित मानकों को पूरा http://whqlibdoc.who.int/publications/2010/9789241547789_eng.pdf परीक्षा के लिए) मानव वीर्य की और प्रसंस्करण.
- 37 पर एक मशीन के अंदर एक बाँझ कंटेनर और जगह यह (ढीला टोपी के साथ) के अंदर वीर्य का नमूना प्राप्त डिग्री सेल्सियस और सीओ 30 मिनट के दौरान 2 5% / हवा 95%. यह कदम नमूना द्रवीकरण के लिए है.
- साफ कांच की टेस्ट ट्यूब (1.0 x 7.5 सेमी) के तल पर तरलीकृत वीर्य के नमूने की जगह 500 μl aliquots के. लगभग आठ टेस्ट ट्यूब एक औसत आकार के नमूने (4 मिलीलीटर) के लिए आवश्यक हैं.
- हाम के एफ 10 मध्यम से ध्यान परत 1 मिलीलीटर (सु. 2 मिमी साथ pplemented (चित्रा 1 देखें) प्रत्येक वीर्य विभाज्य के शीर्ष पर इन विट्रो में कैपेसिटेशन) को बढ़ावा देने के एल्बुमिन 2 CaCl और 5 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम सुझाव: micropipette की नोक के साथ ट्यूब की दीवार को स्पर्श करें, और धीरे बांटना नमूना ऊपर मध्यम. यह (नमूना और मध्यम) दोनों परतों के मिश्रण के रूप में बचा जाना चाहिए धीरे धीरे यह करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- ध्यान से लगभग एक 30 डिग्री कोण तक ट्यूबों दुबला. यह इस प्रकार ऊष्मायन के दौरान नमूने से मध्यम करने के मानव कोशिकाओं के विस्थापन (तैरने अप) को बढ़ाने, दो तरल पदार्थ के बीच सतह क्षेत्र में वृद्धि होगी.
- 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 / हवा 95% पर एक मशीन के अंदर निर्भर हो गए टेस्ट ट्यूब का समूह रखें.
- बड़ी मात्रा में एक 15 मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए, एक micropipette का प्रयोग सावधानी से एक भी साफ ग्लास ट्यूब (1.0 x 7.5 सेमी में प्रत्येक ट्यूब और पूल सभी एकत्र नमूनों से हैम के एफ 10 मध्यम (अब चलता - फिरता शुक्राणु युक्त) के ऊपरी 700 μl हटानेफाल्कन ट्यूब), बुलबुला गठन से बचने. फिर जगह 10 एक Makler गिनती चैंबर आधार के ऑप्टिकल फ्लैट कांच पर जमा नमूना के μl, और गिलास को कवर (एक बार कवर जगह में है, हटाने या शुक्राणु नमूना की वर्दी प्रसार को बनाए रखने के लिए फिर से कवर करने से बचने) जगह है. यह एक गलत सेल गिनती पर नतीजा होगा के रूप में सदन के अंदर बुलबुला गठन से बचने के लिए सुनिश्चित करें.
- एक यौगिक सूक्ष्मदर्शी (एक 20X उद्देश्य के उपयोग की सिफारिश की है) के तहत निरीक्षण. Makler गिनती चैंबर के कवर गिलास 100 छोटे वर्गों (यानी 10 ग्रिड द्वारा एक 10) से बना एक बड़ा वर्ग है. 10 चौकों की किसी भी पट्टी में कक्षों की गणना. यह संख्या कोशिकाओं / एमएल के लाखों लोगों में उनकी एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है. दो अतिरिक्त 10 वर्ग स्ट्रिप्स में गिनती दोहराएँ, और तीन की गिनती के औसत नोट गणना:. एक Makler गिनती कक्ष (जो विशेष रूप से शुक्राणु कोशिकाओं की गिनती करने के लिए डिज़ाइन किया गया है) उपलब्ध नहीं है, तो किसी भी hemocytometer के चैम्बर में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- नमूना के वित्तीय और प्रक्रियात्मक पहलुओं को समायोजित करेंमें 1x10 7 कोशिकाओं / एमएल एल एकाग्रता हाम के एफ 10 मध्यम पूरक. जब आवश्यक है, 37 पर नमूना सेते डिग्री सेल्सियस और सीओ कैपेसिटेशन बढ़ावा देने के लिए 5 घंटे के लिए 2 5% / एयर 95%.
2. 2 सीए के लिए फ्लोरोसेंट डाई लोड हो रहा है + माप
Intracellular सीए 2 + मापने के लिए उपलब्ध कई फ्लोरोसेंट रंगों के होते हैं, एक उपयुक्त इसकी कश्मीर घ के अनुसार चयन किया जाना चाहिए, और इसके उत्सर्जन और उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (क्रमशः गुणात्मक और मात्रात्मक माप, सिंगल और डबल उत्सर्जन और उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए होना चाहिए, प्रयुक्त) अधिक जानकारी). वर्तमान गुणात्मक आवेदन के लिए हम Fluo इस्तेमाल किया-3, एक एक कश्मीर घ = 325 एनएम के साथ सेल permeant डाई, और क्रमशः एकल उत्सर्जन और उत्तेजना 506/526 एनएम के तरंग दैर्ध्य, 12 हूँ.
- 50 एक 1 मिमी की μl Fluo-3 एक 50 ग्राम डाई शीशी की सामग्री भंग द्वारा शेयर समाधान AM (मेगावाट = 1130 छ / mol) निर्जल DMSO के 44 μl में. तैयार
- एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब का प्रयोग काफी 1 मिमी के साथ शुक्राणु निलंबन की मात्रा (नीचे प्रत्येक विशिष्ट तकनीक के लिए आवश्यक राशि को देखें) मिश्रण Fluo-3 2 माइक्रोन Fluo-3 बजे (यानी की 1 μl के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए शेयर समाधान AM शेयर Fluo-03:00 शुक्राणु निलंबन के हर 500 μl) के लिए जोड़ा है.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और प्रकाश से रक्षा की.
- एक microcentrifuge का उपयोग कर 5 मिनट के लिए 750 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र, महाप्राण और सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और मानव शुक्राणु मध्यम की उपयुक्त मात्रा (नीचे प्रत्येक विशिष्ट तकनीक के लिए आवश्यक एकाग्रता देखें) (HSM में गोली resuspend; मिमी: 120 NaCl, 15 3 NaHCO 2 CaCl, 1 2 MgCl, 10 HEPES, 10 ना लैक्टेट, 5 डी ग्लूकोज, 1 ना पाइरूवेट, = पीएच 7.4) नोट: एक बादल के गठन के बजाय एक गोली कोशिकाओं को इंगित करता है कि अच्छी हालत में.
- कोशिकाओं को अब डाई के साथ लोड कर रहे हैं, और वे लगभग दो घंटे के लिए (37 डिग्री सेल्सियस पर रखा और प्रकाश से सुरक्षित) सक्षम रहते हैं, और निम्न तकनीक से किसी में इस्तेमाल किया जा सकता है.
3. तकनीक # 1. परम्परागत fluorometry (एक बड़े सेल जनसंख्या से जवाब सूचना)
उपकरण: हमारे शुक्राणु आबादी के लिए [2 Ca +] हम चुंबकीय दोषी नियंत्रण के साथ Olis सॉफ्टवेयर (बोगार्ट, जीए, संयुक्त राज्य अमरीका) (सिम Aminco) द्वारा संचालित है और एक नीले एलईडी (करने के लिए मिलकर एक SLM Aminco spectrofluorometer उपयोग मैं माप Luxeon स्टार LXHL- Lumileds से LB3C,) और Fluo-3 के लिए एक 465-505 एनएम बैंड पास फिल्टर (Chroma प्रौद्योगिकी कार्पोरेशन) उत्तेजना AM. एलईडी एक कस्टम निर्मित बिजली की आपूर्ति (7 द्वारा नियंत्रित किया जाता है00 मा). उत्सर्जन प्रकाश spectrofluorometer के monochromator पर 525 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन (λ एम) की स्थापना द्वारा मापा जाता है.
- जगह HSM के 570 μl और एक फ्लैट नीचे ग्लास ट्यूब में शुक्राणु सेल निलंबन के 30 μl (पहले Fluo-3:00 से भरी हुई है और 1x10 8 कोशिकाओं / एमएल प्राप्त करने के लिए HSM में resuspended) (आईडी 8 x 50 मिमी). ट्यूब के अंदर एक चुंबकीय हलचल पट्टी प्लेस और spectrofluorometer के पढ़ने चैम्बर (37 डिग्री सेल्सियस के लिए छोड़ देते हैं) में ट्यूब डालने, सभी अधिग्रहण के समय के दौरान नमूना हलचल.
- उपकरण के सॉफ्टवेयर (इस मामले में Olis सॉफ्टवेयर) का उपयोग कर प्रयोग आरंभ करें और 300 सेकंड के दौरान 0.5 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर प्रतिदीप्ति मूल्यों को प्राप्त करने के लिए आगे बढ़ें. निम्नानुसार एक हैमिल्टन सूक्ष्म सिरिंज का उपयोग कर एक शेयर समाधान (वांछित अंतिम एकाग्रता की तुलना में आम तौर पर 100X अधिक केंद्रित) से उचित मात्रा में इंजेक्शन द्वारा वांछित परीक्षण यौगिकों लागू करें:
- 30 सेकंड के लिए बेसल प्रतिदीप्ति मोल.
- 100 सेकंड (एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, अधिकतम प्रतिदीप्ति मूल्य प्राप्त करने के लिए) 20 माइक्रोन ionomycin जोड़ें.
- ऊपर 3.2.3 के लिए कदम 3.1 दोहरा, लेकिन बजाय स्नातकोत्तर की केवल विलायक (0.01% निर्जल DMSO के साथ HSM) इसे भंग करने के लिए इस्तेमाल किया जोड़कर एक नकारात्मक नियंत्रण चलाएँ.
- माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल के लिए कच्चे प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों निर्यात और निम्न समीकरण का उपयोग कर उन्हें मानक के अनुसार: (F/F0) - 1. एफ किसी भी समय (टी) में मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता है, और F0 प्रारंभिक 30 सेकंड के दौरान लिया मतलब बेसल प्रतिदीप्ति कहां है. 1 मूल्यों बनाम समय (2A चित्रा) - सम्पूर्ण श्रृंखला के (F/F0) प्लॉट. परीक्षण यौगिकों (ΔF) के अलावा पहले और बाद प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों के बीच अंतर को मापने, एक बार ग्राफ पर उन्हें साजिश और उपयुक्त सांख्यिकीय विश्लेषण तरीकों (चित्रा 2 बी) को लागू करने के डेटा की प्रक्रिया.
4. तकनीक # 2. फ़्लो रूकाडब्ल्यू fluorometry (एक बड़े सेल जनसंख्या से उच्च अस्थायी समाधान के साथ सूचना)
उपकरण: Intracellular [सीए 2 +] परिवर्तन जीवविज्ञान विज्ञान उपकरणों (ग्रेनोबल, फ्रांस) से एक राज्यमंत्री -200 तेजी कैनेटीक्स ऑप्टिकल प्रणाली को मिलकर SFM -20 रोका प्रवाह मिक्सर, दोनों का उपयोग कर उच्च अस्थायी समाधान के साथ मापा जाता है. सभी डेटा एक ही कंपनी से जैव Kine32 सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण कर रहे हैं.
- उपकरण में उपयुक्त परिस्थितियों सेट, रोशनी स्रोत प्रयोग शुरू करने से पहले कम से कम 15 मिनट पर दिया जाना चाहिए,, उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर समायोजित रोका प्रवाह निर्माता द्वारा स्थापित सीमा के भीतर एक वोल्टेज मूल्य को फोटोमल्टिप्लायर समायोजित, और सेट 37 में स्नान तापमान डिग्री सेल्सियस
- , HSM या तो (नकारात्मक नियंत्रण), 1 Fluo-3 बजे लोड शुक्राणु कोशिकाओं (1x10 7 कोशिकाओं / एमएल) की मिलीग्राम और परीक्षण किया जाना परिसर के 1 मिलीलीटर के साथ दूसरे सिरिंज के साथ साधन की सीरिंज से एक भरें10 माइक्रोन ionomycin सकारात्मक (नियंत्रण) या HSM भंग में 10 माइक्रोन स्नातकोत्तर नोट:. इस चरण में यह सीरिंज में तरल पदार्थ ड्राइंग जबकि बुलबुला गठन से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
- वे सिरिंज plungers की नोक को छूने तक दोनों साधन पिस्टन उठा.
- कोशिका क्षति को कम करने के लिए एक औसत दर्जे प्रतिक्रिया प्रदान करेगा कि न्यूनतम मूल्य के लिए प्रवाह दर निर्धारित करें. हम SFM-20 प्रणाली में उपयोग प्रवाह दर 1 मिलीग्राम / सेक 13 है.
- आवृत्ति (इस मामले में 10 मिसे में) और कुल नमूने समय (इस मामले में 50 सेकंड में) निर्धारित करें.
- . अभिकर्मकों मिश्रण नोट ट्रिगर: एक समय में एक ही ट्रिगर मैन्युअल बनाया जा सकता है, तो स्वत: लगातार चलाता है के एक सेट के रूप में अच्छी तरह से पूर्व क्रमादेशित किया जा सकता है.
- कच्चे प्रतिदीप्ति (मनमाना इकाइयों) बनाम समय का पता लगाने के कंप्यूटर स्क्रीन पर प्रदर्शित होता है.
- से प्रति अभिकर्मकों के मिश्रण का एक सीधी रेखा नहीं है कि एक का पता लगाने उत्पन्न होगा. इस प्रकार, क्रम में वास्तविक [सीए प्राप्त करने के लिए2 + एक प्रोत्साहन से व्युत्पन्न] परिवर्तन, मध्यम (नकारात्मक नियंत्रण) के साथ मिश्रण कोशिकाओं से प्राप्त नियंत्रण का पता लगाने प्रयोगात्मक निशान से हर एक से घटाया जाना चाहिए. आवश्यक के रूप में डेटा का विश्लेषण करें, कुछ कैनेटीक्स मानकों को भी जैव Kine32 अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ प्राप्त किया जा सकता है. घटाव के बिना कच्चे निशान तुलना की अनुपूरक चित्र 1 में दिखाया जाता है.
- परीक्षण परिसर सिरिंज में अभिकर्मक को बदलने के लिए, आसुत जल के साथ अच्छी तरह से बाहर साफ. फिर आसुत जल के साथ इसकी अधिकतम मात्रा को सिरिंज भरने बंद कर दिया, प्रवाह fluorometer की इसी पिस्टन में जगह और आंतरिक तंत्र (पानी बर्बाद कंटेनर के लिए निर्देशित किया जाना चाहिए कुल्ला) के माध्यम से पानी धक्का. दो बार इस चरण को दोहराएँ.
- अगले वांछित परीक्षण परिसर के साथ दूसरे सिरिंज भरने, कदम 4.2-4.9 दोहराएँ.
- प्रयोग के अंत में, पूरी तरह से पानी draining, आसुत जल के साथ पूरे उपकरण कुल्लाआंतरिक नली.
5. तकनीक # 3. फ्लो (कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या से प्राप्त सिंगल सेल सूचना)
उपकरण: इस तकनीक समय में एक ही पल में कई मापदंडों के एक साथ माप की अनुमति देता है, लेकिन पिछले तकनीकों के विपरीत, यह समय के साथ परिवर्तन उपाय नहीं है, बल्कि यह माप के समय में पैरामीटर मान प्रदान करता है. इसलिए, बजाय इस मामले में प्रतिक्रिया ट्रिगर करने के लिए पृष्ठ जोड़ने के हम शुक्राणु कोशिकाओं में + स्तर से पहले और कैपेसिटेशन उत्प्रेरण के बाद intracellular सीए 2 मापा. हम एक FACSCanto cytometer (Becton डिकिंसन) का इस्तेमाल किया और डेटा FlowJo सॉफ्टवेयर (ट्री स्टार 9.3.3) के साथ विश्लेषण किया गया.
- परीक्षण किया जा करने के लिए हर हालत तहत ट्यूब प्रति सेल निलंबन के 500 μl (4x10 6 कोशिकाओं / एमएल) रखकर कोशिकामापी ट्यूबों में प्रयोगात्मक नमूने तैयार (इस मामले में, दस की स्थिति, 1 टेबल देखें). आने प्रतिदीप्ति डेटा लीजिएनमूना प्रति मीटर 10,000 घटनाओं.
- एक प्रयोग के लिए उपकरण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए स्थापित करने के लिए:
- एक नया बनाएँ: फ़ोल्डर, प्रयोग, नमूना और ट्यूबों की संख्या.
- के लिए उपयुक्त कोशिकामापी सेटिंग्स का चयन Fluo-3 (ए. आइसोथियोसाइनेट फिल्टर FITC-Fluorescein उपयोग) और पीआई (आयोडाइड फिल्टर पीआई-Propidium उपयोग).
- कोशिकामापी में बेदाग नियंत्रण ट्यूबों 1 और 2 चलाएँ. सीमा सेटिंग्स उपयुक्त हैं सत्यापित करने और कोशिकाओं से मलबे भेदभाव करने के क्रम में इसी गेट बनाने के लिए FSC और एसएससी डेटा लीजिए.
- मुआवजा नियंत्रण बनाने के लिए, निम्न नियंत्रण के नमूने को चलाने, ऑटो और अधिकतम प्रतिदीप्ति डेटा (पीआई और FITC चैनल) (नोट: इस कार्य को आमतौर पर उपकरण के तकनीशियन द्वारा किया जाता है) का संग्रह:
- बेदाग कोशिकाओं (ट्यूबों 1 और 2).
- प्रकोष्ठों Fluo-3 (ए. 2 माइक्रोन) (ट्यूब 3 और 4) के साथ भरा हुआ है.
- मृत कोशिकाओं (शुक्राणु कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए HSM में 0.1% ट्राइटन X-100 निलंबित)37 प्रकाश (ट्यूब 5 और 6) से संरक्षित डिग्री सेल्सियस, पर 30 मिनट के दौरान, पीआई (यानी 2.4 मिमी गड़बड़ी की 0.25 μl शुक्राणु निलंबन के 500 μl में जोड़ा जाता है 1.2 माइक्रोन पीआई) के साथ दाग.- दर्ज आंकड़ों को देखें और वांछित आबादी के लिए गेट का चयन करें.
- फाटक समायोजित और सभी मुआवजा नियंत्रण के लिए "लागू करें" का चयन करें.
- प्रयोग> मुआवजा सेटअप> क्षतिपूर्ति की गणना का चयन करें.
- मुआवजा सेटअप और लिंक और बचाने का नाम बदलें.
- सभी प्रयोगात्मक ट्यूब (इस मामले, ट्यूब 7-10 में) चलाएँ. अंत में, (कदम 5.6 देखें) के विश्लेषण के लिए उपलब्ध सॉफ्टवेयर के लिए सभी डेटा निर्यात.
- उपकरण के सॉफ्टवेयर, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध FlowJo सॉफ्टवेयर या Cytobank मुक्त सॉफ्टवेयर (का उपयोग कर एक प्रयोग के परिणामों का विश्लेषण http://www.cytobank.org/ ).
6. तकनीक # 4. सिंगल सेल इमेजिंग (उच्च स्थानिक संकल्प के साथ सिंगल सेल सूचना) उपकरण:. कस्टम निर्मित इमेजिंग सेट अप हमारे इमेजिंग सेट अप एक तापमान नियंत्रक (मेडिकल सिस्टम कार्पोरेशन, Greenvale, एनवाई), एक Nikon PlanApo 60X (1.4 एनए तेल विसर्जन) के साथ सुसज्जित एक औंधा निकॉन Diaphot 300 माइक्रोस्कोप से बना है उद्देश्य. प्रतिदीप्ति रोशनी एक Luxeon वी स्टार Lambertian सियान एलईडी हिस्सा एक कस्टम निर्मित stroboscopic नियंत्रण बॉक्स से जुड़ी # LXHL-LE5C (Lumileds प्रकाश एलएलसी, सैन जोस, सीए) द्वारा प्रदान की जाती है. एलईडी dichroic दर्पण M40-DC400 (Rapp ऑप्टो इलेक्ट्रॉनिक, हैम्बर्ग, जर्मनी) (: उत्तेजना 450-490 एनएम, dichroic दर्पण 505 एनएम और उत्सर्जन 520-560 एनएम बैंडविड्थ) के साथ एक FlashCube40 विधानसभा में रखा गया था. एलईडी उत्पादन व्यक्तिगत प्रदर्शन के प्रति 2 मिसे की अवधि का एक फ्लैश के उत्पादन के लिए नियंत्रण बॉक्स के माध्यम से एक कूल स्नैप सीसीडी कैमरे का संकेत आउट एक्सपोजर को लयबद्ध था. कैमरा जोखिम समय फ़्लैश अवधि (2 मिसे) के बराबर निर्धारित किया गया था. छवियाँ हर 250 मिसे (एकत्र कर रहे हैं या के अनुसार समायोजित किया जा सकता हैबुद्धि सॉफ्टवेयर (Andor Bioimaging, Wilmington, नेकां) का उपयोग कर वांछित अस्थायी समाधान).
- केंद्र पर पाली एल lysine समाधान की एक 5 μl ड्रॉप (0.01% w / वी) को लागू करने से दौर कवर फिसल जाता है (व्यास = 25 मिमी) तैयार करें. यह कम से कम 1 घंटा (यह शुष्क हो सकते हैं) के लिए खड़े हैं. एक धारा निकलना बोतल का उपयोग कर उपयोग करने से पहले पानी के साथ इलाज क्षेत्र कुल्ला. उनके कशाभिका अभी भी ले सकता है, जबकि यह प्रक्रिया, शुक्राणु कोशिकाओं उनके सिर से कवर पर्ची का पालन करने की अनुमति होगी.
- तालिका 2 के अनुसार HSM में उन्हें भंग द्वारा परीक्षण किया जाना यौगिकों की तैयारी. यौगिकों (के रूप में संकेत दिया चैम्बर में पहले से ही मौजूद मात्रा के साथ मिश्रित जब यह होगा हमेशा एक ही मात्रा में जोड़ने के लिए, और ध्यान में कमजोर पड़ने लेने स्टॉक समाधान की एकाग्रता को समायोजित करने के लिए सुनिश्चित कर रही है, वही रिकार्डिंग कक्ष में क्रमिक रूप से जुड़ जाते हैं तालिका 2). वे उपयोग किया जाता है डिग्री सेल्सियस तक 37 में एक स्नान में सभी परीक्षण समाधान रखें.
- आरईसी के अंदर कवर पर्ची इकट्ठाके ording कक्ष और जगह 10 μl Fluo-3 केन्द्र में हूँ लोड कोशिकाओं (1 x10 7 कोशिकाओं / एमएल). पूर्व गर्म HSM के 200 μl के साथ कोशिकाओं को कवर.
- 37 के लिए पूर्व गर्म खुर्दबीन के मंच पर चैम्बर रखें डिग्री सेल्सियस, कोशिकाओं (चरण विपरीत का उपयोग) को देखने और इमेजिंग के लिए एक क्षेत्र का चयन करें. यह सेल घनत्व (चित्रा 5A देखें) उपयुक्त है जहां एक क्षेत्र का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है, भी कई कोशिकाओं की वजह से अतिव्यापी संकेतों के विश्लेषण के लिए मुश्किल बनाने नोट: सेल मजबूती से उनके सिर से कवर पर्ची से जुड़ा है लेकिन जो पुष्टि कशाभी आंदोलन, प्रदर्शन किया जाना चाहिए. व्यवहार्यता.
- फोकस और चमक को समायोजित करने के लिए जीने के रूप में प्रतिदीप्ति छवियों मोल.
- समय श्रृंखला छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (इस मामले में बुद्धि) को सक्रिय द्वारा प्रयोग शुरू करें. आमतौर पर चार छवियों छवि प्रति 2 मिसे की रोशनी के साथ प्रति सेकंड का अधिग्रहण कर रहे हैं.
- (ड्रॉप के लिहाज से) ध्यान से जोड़ने के लिए एक micropipette का प्रयोग परीक्षण परिसर (इस मामले में स्नातकोत्तर), imag जारीई अधिग्रहण की जरूरत है और एक ही कक्ष में दो अनुक्रमिक नियंत्रण फाईल प्रदर्शन के रूप में: (1) 20 माइक्रोन ionomycin अधिकतम प्रतिदीप्ति प्राप्त करने के लिए और (2) 2 MnCl 5 मिमी न्यूनतम प्रतिदीप्ति प्राप्त करने के लिए. वैकल्पिक रूप से, यौगिकों प्रोत्साहन हटाने, और समान रूप से परिसर के साथ कोशिकाओं को स्नान करने की क्षमता को सक्षम करने का लाभ प्रदान करता है जो एक छिड़काव कक्ष का उपयोग कर जोड़ा जा सकता है. उसी समय, यह समाधान की बड़ी मात्रा की आवश्यकता के नुकसान है, और तापमान नियंत्रण अधिक समस्याग्रस्त बनाने की है.
- हर वांछित परीक्षण परिसर के साथ एक नया कक्ष में अधिग्रहण दोहराएँ.
- बुद्धि सॉफ्टवेयर या छवि जम्मू फ्रीवेयर का उपयोग उपकरण के सॉफ्टवेयर, या ऑफ़लाइन का उपयोग कर छवि विश्लेषण ऑनलाइन प्रदर्शन करना. प्रत्येक सेल (या सेल का हिस्सा) के आसपास ब्याज (ROIs) के क्षेत्रों ड्रा और यह भी एक सेल मुक्त क्षेत्र (स्वचालित पृष्ठभूमि घटाव के लिए सॉफ्टवेयर के द्वारा) का चयन करें. एक समय प्रतिदीप्ति तीव्रता श्रृंखला तो प्रत्येक रॉय और इन आंकड़ों माँ के लिए प्राप्त की हैवाई आगे के विश्लेषण के लिए माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल के लिए निर्यात किया. - 1 (F/F0): हम निम्न समीकरण का उपयोग कर प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों के मानक के अनुसार. एफ किसी भी समय (टी) में मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता है और F0 प्रारंभिक 30 सेकंड के दौरान लिया मतलब प्रतिदीप्ति कहां है. 1 बनाम समय (चित्रा 5 ब) - सम्पूर्ण श्रृंखला के (F/F0) प्लॉट. मान भी 100% के रूप में ionomycin इसके बाद प्राप्त प्रतिदीप्ति मूल्य का उपयोग सामान्यीकृत किया जा सकता है.
- छवि विश्लेषण वैकल्पिक छवि जम्मू मुफ्त सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है.
तकनीक # 1. परम्परागत fluorometry
प्रोजेस्टेरोन उम्मीद के रूप में, यह एक क्षणिक भड़काने करता है, ज्ञात एआर inducers में से एक है और [सीए 2 +] मैं मानव शुक्राणु (चित्रा 2 में दिखाया गया है) में वृद्धि हुई है. एक कैल्शियम ionophore (ionomycin) के अलावा अधिकतम कारण बनता है [2 Ca +] बेसल स्तर तक वापस नहीं करता जो मैं वृद्धि हुई है,.
तकनीक # 2. एससबसे ऊपर फ्लो fluorometry
प्रोजेस्टेरोन प्रेरित [सीए 2 +] मैं वृद्धि (पारंपरिक fluorometry) से पहले के रूप में मापा जाता है, लेकिन अधिक से अधिक अस्थायी समाधान के साथ इस समय किया गया था, इस मामले में अधिग्रहण की आवृत्ति 0.1 हर्ट्ज था. के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है, दोनों प्रोजेस्टेरोन (क्षणिक, लाल रेखा) और ionomycin (निरंतर, नीली रेखा) एक बहुत तेजी से [सीए 2 +] मैं वृद्धि का कारण बना. प्रोजेस्टेरोन प्रेरित [सीए 2 +] मैं वृद्धि करने में देरी की अनुपस्थिति कि प्रोजेस्टेरोन सीधे मध्यवर्ती संकेत 10,14 बिना सीए 2 + चैनल CatSper, सक्रिय हो सुझाव पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है.
तकनीक # 3. फ्लो
[सीए 2 +] मैं capacitated और गैर capacitated मानव शुक्राणु में मापा गया था. पहले माउस 15, गोजातीय शुक्राणु 16 और मानव शुक्राणु 17 में बताया, हम भी वृद्धि हुई [सी मनायाएक 2 + गैर capacitated मानव शुक्राणु की तुलना capacitated में] मैं. Baldi, एट अल. (1991) 17 की सूचना उच्च बेसल [2 Ca +] पारंपरिक fluorometry का उपयोग करते हुए गैर capacitated मानव शुक्राणु में से capacitated में मैं. इस काम में हम मैं पहले और इन विट्रो कैपेसिटेशन में बाद [+ 2 सीए] को मापने के लिए प्रवाह cytometry इस्तेमाल किया. प्रवाह cytometry capacitated शुक्राणु (चित्रा 4D, नीला ट्रेस) के लिए प्रतिदीप्ति मूल्यों का वितरण गैर capacitated शुक्राणु (चित्रा 4D, लाल ट्रेस) की तुलना में उच्च मूल्यों के लिए स्थानांतरित कर दिया है कि देखने के लिए सक्षम बनाता है. प्रत्येक व्यक्ति सेल के लिए प्रतिदीप्ति मूल्यों चित्रा 4 जी में दिखाया दो आयामी डॉट भूखंडों में मनाया जा सकता है, महत्वपूर्ण बात, मृत कोशिकाओं (लगभग 15%) से उत्पन्न होने वाले संकेत (चित्रा 4G, ऊपरी चतुर्भागों) समाप्त किया जा सकता है.
तकनीक # 4. सिंगल सेल इमेजिंग
प्रोजेस्टेरोन प्रेरितघ [सीए 2 +] मैं परिवर्तन भी शुक्राणु कोशिकाओं में मापा गया था. प्रोजेस्टेरोन अलावा एक वेतन वृद्धि का कारण बनता है [2 Ca +] शुक्राणु सिर में और कशाभिका में दोनों मैं. जनसंख्या प्रयोगों में मनाया के रूप में, एकल कोशिका विश्लेषण क्रमशः, एक क्षणिक और प्रोजेस्टेरोन और ionomycin के लिए एक निरंतर वृद्धि का पता चला.
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Representative Results
चित्रा 1. तैरना ऊपर विधि द्वारा शुक्राणु नमूना तैयार करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल. गतिशील शुक्राणु की जुदाई के लिए और उनकी एकाग्रता के समायोजन के लिए बड़े कदम के योजनाबद्ध आरेख सचित्र हैं. कैपेसिटेशन आवश्यक है जब पिछले ऊष्मायन कदम ही किया जाता है.
चित्रा 2. प्रोजेस्टेरोन में वृद्धि का कारण बनता है [2 Ca +] मानव शुक्राणु आबादी में मैं. दिखा (ए) प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति निशान बनाम समय 4 माइक्रोन के योग के कारण [सीए 2 +] मैं परिवर्तनप्रोजेस्टेरोन (स्नातकोत्तर, लाल ट्रेस), या HSM नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 0.01% DSMO (स्नातकोत्तर वाहन) (सीटीएल, नीला ट्रेस) के साथ. एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, 10 माइक्रोन ionomycin (Iono) द्वारा प्रेरित परिवर्तन प्रत्येक का पता लगाने के लिए दिखाया गया है. प्रतिदीप्ति मूल्यों 120 सेकंड के दौरान 0.5 हर्ट्ज की एक आवृत्ति पर हासिल किया गया. (बी) बार हर हालत से औसत ΔF ± एसई का प्रतिनिधित्व करते हैं, एन = 3 (* पी नियंत्रण के साथ तुलना में 0.001 <).
चित्रा 3. प्रोजेस्टेरोन और ionomycin मिश्रण नियंत्रण के लिए एक तेज [सीए 2 +] मैं मानव शुक्राणु आबादी में वृद्धि हुई है. [सीए 2 +] मैं प्रतिक्रियाओं हर 10 मिसे (AFU = मनमाना प्रतिदीप्ति इकाइयों) नमूना द्वारा दर्ज किए गए. (ए) कच्चे निशान (प्रेरित HSM, हरे रंग का पता लगाने के साथ) और संकेतों के लिए कोशिकाओं को 10 माइक्रोन पी के साथ प्रेरित rogesterone (लाल ट्रेस) या 10 माइक्रोन ionomycin (नीला ट्रेस) के साथ. (बी) (हरे 10 माइक्रोन प्रोजेस्टेरोन (लाल ट्रेस) के साथ या नियंत्रण संकेत subtracting द्वारा प्राप्त 10 माइक्रोन ionomycin (नीला ट्रेस), के साथ प्रेरित संकेतों के निशान सही पैनल में उनके इसी कच्चे संकेतों (पैनल में लाल और नीले रंग के निशान एक, क्रमशः) से ए) का पता लगा. प्रोजेस्टेरोन प्रारंभ करनेवाला के अलावा के बाद 2.7 सेकंड से होने वाली एक अधिकतम प्रतिदीप्ति मूल्य के साथ एक क्षणिक प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है. दूसरी ओर, ionomycin समय (50 सेकंड) भर में एक तेजी से और निरंतर प्रतिक्रिया उत्पन्न करता है. पैनल बी में इनसेट प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए पहली बार 500 मिसे के एक विस्तृत दृश्य दिखाता है. ध्यान दें कि दोनों ionomycin और प्रोजेस्टेरोन प्रेरित [सीए 2 +] मैं बढ़ता प्रारंभ करनेवाला के साथ कोशिकाओं के मिश्रण के बाद तुरंत शुरू करते हैं. प्रत्येक ट्रेस तीन रिकॉर्डिंग के औसत का प्रतिनिधित्व करता है. सभी निशान उनकी न्यूनतम प्रतिदीप्ति मूल्यों के खिलाफ सामान्यीकृत और एक दूसरे पर आरोपित किया गया.com/files/ftp_upload/50344/50344fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
4 चित्रा. .. [सीए 2 +] मैं मानव शुक्राणु कैपेसिटेशन दौरान बढ़ जाता है capacitated (नीला भूखंडों) और लाल (भूखंडों) गैर capacitated शुक्राणु कोशिकाओं प्रवाह cytometry विश्लेषण के अधीन थे (ए) आगे (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) भूखंडों; चयनित गेट नीली रेखा के साथ संकेत दिया है और उस क्षेत्र के भीतर ही कोशिकाओं आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया. FITC बेदाग से चैनल (autofluorescence) (बी) और Fluo-3 में प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम दाग (FITC के लिए सकारात्मक) (डी) शुक्राणु AM. पीआई बेदाग से चैनल (autofluorescence) (सी) और मृत (पीआई के लिए सकारात्मक) (ई) कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति हिस्टोग्राम. दो आयामी प्रतिदीप्ति (Fluo-3 एक AMबेदाग लिए एन डी पीआई) डॉट साजिश (एफ) और (Fluo-3 AM और पीआई) दाग डबल शुक्राणु (जी), प्रत्येक चक्र में दर्ज की गई कोशिकाओं का प्रतिशत लाल संख्या से संकेत दिया है. ये परिणाम एक प्रयोग (एन = 5) के प्रतिनिधि हैं.
चित्रा 5. प्रोजेस्टेरोन में वृद्धि का कारण बनता है [2 Ca +] मानव शुक्राणु कोशिकाओं में मैं. (ए) मानव शुक्राणु कोशिकाओं के प्रतिनिधि pseudocolor छवियों शुरुआत (नियंत्रण) पर कल्पना, और प्रोजेस्ट्रोन के बाद (स्नातकोत्तर, 45 सेकंड), ionomycin (Iono, 300 सेकंड फाईल. (बी) के नौ व्यक्ति की कोशिकाओं के प्रतिनिधि सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति निशान (ए) से) और 2 MnCl (380 सेकंड).
| ट्यूब | शर्त | उपचार | मापा जा करने के लिए मान | टिप्पणियां | ग्राफ |
| 1 | कंट्रोल (गैर capacitated कोशिकाओं) | बेदाग | एक) एफएससी 1 और एसएससी 2 ख) FITC 3 प्रतिदीप्ति ग) पीआई 4 प्रतिदीप्ति | एक) सेल आकार और विघटन का निर्धारण और गेट बनाने के लिए ख) FITC 3 autofluorescence ग) PI4 autofluorescence | एक) डॉट प्लाट एक, लाल ख) हिस्टोग्राम बी, लाल ग) हिस्टोग्राम सी, लाल |
| 2 | कंट्रोल (capacitated कोशिकाओं) | बेदाग | एक) एफएससी 1 और एसएससी 2 ख) FITC 3 प्रतिदीप्ति ग) PI4 प्रतिदीप्ति | एक) एक कोशिकाओं के आकार निर्धारित करने के लिएघ विघटन और गेट बनाने ख) FITC 3 autofluorescence ग) पीआई 4 autofluorescence | एक) डॉट साजिश ए, ब्लू ख) हिस्टोग्राम बी, ब्लू ग) हिस्टोग्राम सी, ब्लू |
| 3 | FITC 3 (गैर capacitated कोशिकाओं) के लिए सकारात्मक | FITC के साथ लेबल | FITC 3 प्रतिदीप्ति | नमूने में प्रतिदीप्ति निर्धारित करने के लिए | हिस्टोग्राम डी, लाल |
| 4 | FITC 3 (capacitated कोशिकाओं) के लिए सकारात्मक | FITC के साथ लेबल | FITC 3 प्रतिदीप्ति | नमूने में प्रतिदीप्ति निर्धारित करने के लिए | हिस्टोग्राम डी, ब्लू |
| 5 | सकारात्मक पीआई 4 मृत कोशिकाओं, (गैर capacitated कोशिकाओं) | पीआई के साथ लेबल | पीआई 4 प्रतिदीप्ति | मृत कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति निर्धारित करने के लिए | Histoग्राम ई, लाल |
| 6 | सकारात्मक पीआई 4 मृत कोशिकाओं, (capacitated कोशिकाओं) | पीआई के साथ लेबल | पीआई 4 प्रतिदीप्ति | मृत कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति निर्धारित करने के लिए | हिस्टोग्राम ई, ब्लू |
| 7 | कंट्रोल (गैर capacitated कोशिकाओं) | बेदाग | FITC के 3 और पीआई 4 प्रतिदीप्ति | FITC के 3 और पीआई 4 चैनलों में autofluorescence निर्धारित करने के लिए | Dotplot एफ, लाल |
| 8 | कंट्रोल (capacitated कोशिकाओं) | बेदाग | FITC के 3 और पीआई 4 प्रतिदीप्ति | FITC के 3 और पीआई 4 चैनलों में autofluorescence निर्धारित करने के लिए | Dotplot एफ, ब्लू |
| 9 | FITC के 3 और पीआई 4 (गैर capacitated कोशिकाओं) के लिए सकारात्मक | लाFITC के 3 और पीआई 4 के साथ बेल | FITC के 3 और पीआई 4 प्रतिदीप्ति | प्रयोगात्मक हालत में दोनों चैनलों में प्रतिदीप्ति मूल्यों को निर्धारित करने के लिए | Dotplot जी, लाल |
| 10 | FITC के 3 और पीआई 4 के लिए सकारात्मक (capacitated कोशिकाओं) | FITC के 3 और पीआई 4 के साथ लेबल | FITC के 3 और पीआई 4 प्रतिदीप्ति | प्रयोगात्मक हालत में दोनों चैनलों में प्रतिदीप्ति मूल्यों को निर्धारित करने के लिए | Dotplot जी, ब्लू |
तालिका 1. एक प्रवाह cytometer प्रयोग के लिए नमूने का विवरण 1 एफएससी: आगे तितर बितर, 2 एसएससी:. ओर तितर बितर, 3 FITC: Fluorescein आइसोथियोसाइनेट, 4 पीआई: Propidium आयोडाइड.
| यौगिक | जोड़ा जाएगा स्टॉक समाधान की मात्रा | स्टॉक एकाग्रता | इसके अलावा के समय कक्ष में वॉल्यूम मौजूद | चैम्बर में अंतिम एकाग्रता |
| प्रोजेस्टेरोन | 100 μl | 9 माइक्रोन | 200 μl | 3 माइक्रोन |
| Ionomycin | 100 μl | 80 माइक्रोन | 300 μl | 20 माइक्रोन |
| 2 MnCl | 100 μl | 25 मिमी | 400 μl | 5 मिमी |
तालिका 2. एक इमेजिंग प्रयोग के समाधान के लिए तैयार करना.
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Discussion
Intracellular संकेत सबसे सेलुलर गतिविधियों के लिए महत्वपूर्ण है, सीए 2 + उनके जीवन चक्र का अंत करने के लिए, निषेचन में अपने मूल से, अपने पूरे जीवन भर स्तनधारी कोशिकाओं के साथ जुडा हुआ है कि एक सर्वव्यापी दूत है. विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में, [सीए 2 +] मैं बढ़ जाती है, oscillates और spatio-अस्थायी संहिताकरण के साथ कम हो जाती है, उसके अनुसार, विभिन्न प्रक्रियाओं को सक्रिय कर रहे हैं, संग्राहक या सीए 2 + इनकोडिंग संदेश द्वारा समाप्त. Intracellular सीए 2 + इस आयन संकेत पारगमन प्रक्रियाओं के एक जटिल आर्केस्ट्रा में शामिल है, के रूप में गतिशीलता, शुक्राणु शरीर क्रिया विज्ञान में बहुत महत्वपूर्ण हैं. इस तरह 2 सीए का ज्ञान + उतार चढ़ाव को समझने सीए 2 + शामिल चैनलों, और विशिष्ट cascades संकेत में उनके विशिष्ट भूमिकाओं के आणविक पहचान कर सकते हैं. सीए 2 + संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक अत्यंत विशिष्ट और संवेदनशील सीए 2 + मीटर सक्षम करने, उन्हें अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का गठनजीवित कोशिकाओं में एकाग्रता परिवर्तन ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि easurements. इस पत्र में, सेल आबादी प्रयोगों (पारंपरिक और बंद कर दिया प्रवाह fluorometry) और एकल कक्ष प्रयोगों (प्रवाह cytometry और एकल कक्ष इमेजिंग) spatio-अस्थायी [सीए 2 +] एक प्रोजेस्टेरोन प्रोत्साहन पर मानव शुक्राणु कोशिकाओं में परिवर्तन, या पालन करने के लिए भी इस्तेमाल किया जाता है + आराम के स्तर से पहले और इन विट्रो कैपेसिटेशन में बाद 2 सीए अनुमान लगाने के लिए.
आवश्यक उपकरण ज्यादातर प्रयोगशालाओं में आसानी से उपलब्ध है, क्योंकि पारंपरिक fluorometry एक व्यापक तकनीक है, यह प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और यह तेजी से एक विशिष्ट उत्तेजना पर एक [सीए 2 +] मैं वेतन वृद्धि है कि क्या वहाँ सूचित कर सकते हैं. अधिक परिष्कृत उपकरणों की आवश्यकता होती है, हालांकि प्रवाह fluorometry रूका, उच्च अस्थायी समाधान प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, KAUPP और सहकर्मियों प्रोजेस्टेरोन उत्तेजनाओं पर, शुक्राणु [सीए 2 +] मैं कोई साथ तुरंत बढ़ जाता है कि निर्धारितदेरी के 10, इस तथ्य यह है, अतिरिक्त प्रयोगात्मक सबूत 14 के साथ संयोजन के रूप में, उन्हें लगता है कि प्रोजेस्टेरोन का प्रस्ताव करने के लिए नेतृत्व सीधे कम से कम के दौरान एक संकेत झरना की या एक अतिरिक्त प्रोजेस्टेरोन रिसेप्टर के शामिल होने से इनकार एक सीए 2 + चैनल (CatSper) को सक्रिय प्रारंभिक प्रोजेस्टेरोन प्रेरित वेतन वृद्धि. प्रोजेस्टेरोन एक छोटे और धीमी वेतन वृद्धि के बाद क्षणिक वृद्धि लाती है, इसलिए एक से अधिक सीए 2 + प्रविष्टि तंत्र समग्र प्रतिक्रिया में शामिल किया जा सकता है.
प्रवाह cytometry एक बहुत शक्तिशाली तकनीक है, लेकिन यह महंगा उपकरण की आवश्यकता है. इसके साथ ही कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या है, पर और एक अपेक्षाकृत कम समय में, कई मापदंडों के उपाय के रूप में जब उपलब्ध हो, इस विधि, उल्लेखनीय महत्व का है. महत्वपूर्ण बात है, यह जीवित और मृत कोशिकाओं के बीच भेदभाव की अनुमति देता है. इस पत्र में हम एक सीए 2 है कि वहाँ प्रवाह cytometry का उपयोग पहली बार के लिए दिखाने + घ वृद्धिमानव शुक्राणु में कैपेसिटेशन uring. हमारे माप आबादी में इन मूल्यों का वितरण स्पष्ट रूप से मृत कोशिकाओं (चित्रा 4) से संकेत के उन्मूलन को सक्षम करने के बदले में, देखा जा सकता है, ताकि प्रत्येक व्यक्ति सेल के लिए प्रतिदीप्ति मूल्यों को प्रदान की.
यह मापन के लिए स्थानिक संकल्प कहते हैं क्योंकि बरकरार जीवित कोशिकाओं पर प्रतिदीप्ति इमेजिंग आधारित assays के पिछले तीन तकनीक पूरक. इमेजिंग के दौरान उच्च लौकिक और / या स्थानिक संकल्प भी उपलब्ध उपकरण क्षमताओं (यानी कैमरा संवेदनशीलता, रोशनी स्रोत, उद्देश्य संख्यात्मक एपर्चर, आदि) के अनुसार, प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, केवल कुछ कोशिकाओं को एक ही बार में अध्ययन कर रहे हैं, यह देखते हुए प्रयोगों के विश्लेषण समय लेने वाली है, जिससे विश्वसनीय निष्कर्ष निकालने के क्रम में कई बार दोहराया जाना चाहिए.
इस पत्र में हम चार में से हर एक को वर्णन करने के क्रम में सरल प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का इस्तेमाल कियातकनीक. हालांकि, इन तरीकों में बहुत अधिक गहराई में प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है. सेल के विशेष डिब्बों (माइटोकांड्रिया साइटोसॉल, ईआर, endosomes, आदि) को निशाना बनाया जा सकता है कि फ्लोरोसेंट रंगों की एक बड़ी संख्या है, की मात्रात्मक निर्धारण की अनुमति है कि ratiometric रंगों (डबल उत्सर्जन और / या उत्तेजना तरंग दैर्ध्य) कर रहे हैं पैरामीटर (अंशांकन आवश्यक है) मापा जा रहा है, अंत में, एक से अधिक डाई एक साथ मापने के लिए एक बार में इस्तेमाल किया है, उदाहरण के लिए, [सीए 2 +] मैं और [पीएच] मैं परिवर्तन किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, इन तकनीकों के विस्तार में स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सूचना प्राप्त करने के लिए औषधीय उपकरण और / या ध्यान से डिजाइन प्रोटोकॉल (बाह्य सीए 2 + सांद्रता, पीएच मान, तापमान, या प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं कि किसी भी अन्य कारक अलग) के साथ जोड़ा जा सकता है अध्ययन के तहत प्रक्रिया.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों तकनीकी सहायता के लिए जोस लुइस डी ला वेगा, एरिका Melchy और डॉ. ताकुया Nishigaki धन्यवाद. ऑस्ट्रीया जनरल डी Asuntos डेल पर्सनल Académico / Universidad Nacional ऑटोनोमा डी मेक्सिको (सीटी IN202212-3), इस काम Consejo नैशनल डे Ciencia y TECNOLOGIA (CONACYT-मेक्सिको) (सीटी को 99333 और 128566) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-10 | Sigma-Aldrich | N-6013 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-7906 | |
| Calcium Chloride Dihydrate approx. 99% | Sigma-Aldrich | C-3881 | |
| Makler Counting Chamber | SEFI Medical Insruments LTD | SEF-MAKL | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F-1242 | 20 vials/50 μg each |
| Ionomycin | Alomone | I-700 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P0130 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-9888 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P-3911 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium bicarbonate | JT Baker | 3506 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M-2670 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1016 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-3125 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| D-Glucose | JT Baker | 1906-01 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-2256 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium L-lactate (aprox. 99%) | Sigma-Aldrich | L- 7022 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L-7011 | Component B |
| Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) | Sigma- Aldrich | X-100 | 2.4 mM solution in water |
| Round coverslip | VWR | 48380 080 | 25 mm diameter |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | M-3634 | |
| Attofluor; Cell Chamber, for microscopy | Life technologies | A-7816 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | 5x5 ml |
References
- Bouschet, T., Henley, J. M. Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain. Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).
- Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L. Calcium channels in the development, maturation, and function of spermatozoa. Physiol. Rev. 91, 1305-1355 (2011).
- Esposito, G., et al. Mice deficient for soluble adenylyl cyclase are infertile because of a severe sperm-motility defect. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2993-2998 (2004).
- Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84, 505-510 (2009).
- Carlson, A. E., et al. Pharmacological targeting of native CatSper channels reveals a required role in maintenance of sperm hyperactivation. PLoS ONE. 4, e6844 (2009).
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