Summary
Intracellulär Ca
Abstract
Spermier är manliga könsceller speciellt utformade för att nå, erkänna och smälta samman med ägget. För att utföra dessa uppgifter, måste sädesceller vara beredd att möta en ständigt föränderlig miljö och att övervinna flera fysiska hinder. Att vara i huvudsak transkriptionellt och translationellt tyst, dessa rörliga celler förlitar djupt på olika signaleringsmekanismer att orientera sig och simma i en riktad mode, och att brottas med tuffa miljöförhållanden under sin resa för att hitta ägget. I synnerhet är Ca2 +-förmedlad signalering avgörande för flera spermier funktioner: aktivering av motilitet, capacitation (en komplex process som förbereder sperma för akrosomreaktionen) och akrosomreaktionen (en exocytotic händelse som gör att sperma-ägg smältning). Användningen av fluorescerande färger för att spåra intracellulära fluktuationer i denna jon är av anmärkningsvärd betydelse på grund av deras enkla ansökan, känslighet och mångsidighet DETektion. Använda en enda färg-lastning protokoll vi använder fyra olika fluorometriska tekniker för att övervaka sperm Ca2 + dynamik. Varje teknik ger tydlig information som gör det möjligt för rumslig och / eller temporal upplösning, generera data både vid enstaka cell och cellnivåer befolkning.
Introduction
Ca2 + är en universell andra budbärare av signaltransduktionsvägar i eukaryota celler. Intracellulära Ca2 + (Ca 2 + i) deltar i regleringen av många grundläggande fysiologiska processer i både hetsiga och icke-retbara celler. Vikten och universalitet Ca2 + som andra budbärare under signaltransduktionshändelser härrör från dess tid och rum mångsidighet i överföringen av uppgifter i cellen. Medan Ca2 + kan inte syntetiseras de novo eller degraderas i cellen, dess intracellulära koncentrationen ([Ca2 +] i) hålls inom mycket snäva gränser genom olika cellulära mekanismer som kontinuerligt buffert, sequester, kategoriserar, och / eller ackumuleras Ca 2 +. Förändringar i koncentrationen av denna jon kan förekomma i mycket lokaliserade områden inom cellen 1, och dechiffrera sådana svängningar är nödvändig för att få en deEPER förståelse av (1) deras roll i den signalerande mekanismen, (2) deras fysiologiska betydelse, och (3) allmänna mekanismer för cellsignalering. Ca2 +-medierad signalering är av särskild betydelse i sperma fysiologi 2. Spermiemotilitet är en av de viktigaste funktionerna för gödsling framgång, och i själva verket kan flera spermiernas rörlighet defekter orsaka sterilitet 3-5. Vikten av Ca 2 + i flagellar rörelse har länge insett 6, men det är mekanismen för hur Ca 2 + styr den särskilda formen av flagellära böjning inte helt klarlagda.
Innan sammansmältning med ägget, måste spermierna genomgå capacitation, en komplex process som är avhängig spermier bostad innanför kvinnliga tarmkanalen. Under capacitation, är spermierna membranets lipid arkitektur och organisation ändras, främst som ett resultat av kolesterol avlägsnas från plasmamembranet. Dessutom flera proteiner är tyrosin-fosforylated 7. Viktigt under capacitation finns det en ökning av intracellulärt pH (pH i) och i [Ca 2 +] i, och membranpotentialen hyperpolariserar hos vissa arter 2. Capacitation sker enbart i en delpopulation av spermier (20-40%), och de mekanismer som är involverade i alla dessa cellförändringar är långt ifrån klart. Det är allmänt accepterat att endast en subpopulation av capacitated spermier genomgå akrosomreaktionen (AR) när den utsätts för fysiologiska induktorer. AR är också en Ca2 +-reglerade omständigheter behövs för befruktning i alla arter som har en Akrosomen (specialiserad organell med yttre och inre membran). Under denna process de yttre akrosomala membranet säkringar med spermiens plasmamembranet, släppa hydrolytiska enzymer som tillåter spermie att penetrera Glyco-proteinartade matrisen som omger ägget (zona pellucida, eller ZP). AR exponerar också en ny fusogen yta spermie som interagerar medägget plasmamembranet för den slutliga fusionen av båda gameter. Det finns flera cellulära ligander som inducerar AR, progesteron är en av de mest studerade bland dem.
I detta arbete presenterar vi fyra olika tekniker som innefattar användning av en Ca 2 +-känsliga fluorescerande färg för att mäta [Ca 2 +] i förändringar i mänskliga spermier utlöses av progesteron (med undantag för flödescytometri, där vi mätte [Ca 2 + ] Jag ökar induceras vid in vitro capacitation process). I detta fall använde vi Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), ett membran-genomsläppligt färgämne med ett Kd = 325 nM. In vitro vi övervakas fluorescens ändras som en funktion av tiden med tre av de metoder, och med den fjärde tekniken mätte vi fluorescensvärden vid en enda given tidpunkt. Dessa olika synsätt kompletterar varandra, eftersom sammanlagt ger de rumsliga och tidsmässiga resolution på både enskild cell och cellnivåer befolkning.
Cell Befolkning eller Bulk Experiment
Bulk tekniker används flitigt inte bara för att de instrument de behöver är lätt tillgängliga, men också för att de är enkla, väl etablerade, och möjliggöra utjämning av information från mätningar utförda på miljontals celler i ett enda experiment.
Teknik # 1. Konventionell fluorometri
Denna teknik övervakar förändringar i fluorescens som en funktion av tid, de försöken utförs i glas Kyvett med provvolymer som sträcker sig från 200 till 1000 | il. Korrekt blandning av tillsatta reagens kräver magnetisk omröring, och därför den temporala upplösningen som erhålls är i storleksordningen sekunder. Den typiska cellkoncentrationen utbud av de analyserade proverna är 10 5 -10 8 celler / ml.
Teknik # 2. Stoppad Flow fluorometri
Thans teknik övervakar också förändringar i fluorescens som en funktion av tiden, men reagensen snabbt blandas (med tryck) i en inspelning kyvett innehållande en mycket liten provvolym (allt från 25 till 100 l). Därför är homogenisering av reagenser momentana, vilket möjliggör en hög temporal upplösning i storleksordningen millisekunder. Analys av de resulterande fluorescens mot tid spår är lämpliga för att bestämma reaktionshastigheter, belysa komplexiteten i reaktionsmekanismen, erhålla information om kortlivade reaktionsmellanprodukter, etc. Den gemensamma cellkoncentrationen sortiment av de analyserade proverna är 10 5 -10 7 celler / ml.
Single Cell Experiment
Bulk experiment rapporterar genomsnittliga beteendet hos ett stort antal celler, dock kan en population ofta uppvisar heterogena egenskaper som förbises vid denna typ av mätningar. Encelliga tekniker används således för att komplettera the information som erhållits med experiment cellpopulation.
Teknik # 3. Flödescytometri
Trots betydelsen av den information som härrör från en enda cell mätningar är det viktigt att analysera ett stort antal celler för att förhindra den felaktiga extrapolering av cell-specifika egenskaper till en hel population. Av detta skäl är hög genomströmning tekniker gynnat och den mest populära metoden är flödescytometri, där 10.000 celler per betingelse konventionellt analyseras. Denna metod gör multi-parametrisk analys av heterogena populationer som det kategoriserar celler enligt deras storlek (ljusspridning framåt (FSC)), granularitet (sidospridning (SSC)) och fluorescensintensitet (specifik märkning med en antikropp, viabilitet markör etc.) , vilket ger information om de parametrar "fördelning för en grupp av celler. Flödescytometri ger omedelbar stället tidsberoende uppgifter 8. Framåt och side scatter värden ARe också användbart för att välja en grind som innehåller celler, men diskriminerar cellulärt skräp, damm, etc. För fluorescensmätningar, negativa och positiva fluorescens kontroller ska också ingå. Om mer än en fluorescens kanal används, måste en process som kallas kompensation utföras (för detaljer se http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). Ersättning tillåter spektral överlappning diskriminering bland fluoroforer. Flödescytometri tillåter också diskriminering av döda celler, i allmänhet med hjälp av propidiumjodidfärgning.
Technique # 4. Single Cell Imaging
Mikroskopi är en annan vanlig metod för att studera enda cell beteende, det är väl lämpad för tidsberoende studier och det ger också rumslig upplösning. En stor nackdel är att hög genomströmning analys är endast i sin linda i dagsläget
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denna artikel rapporterar användningen av de fyra ovan nämnda tekniker för att mäta [Ca 2 +] i förändringar i humana spermier. Vi använde progesteron för att utlösa en Ca 2 + svar, eftersom det är väl känt att denna steroid producerar en övergående [Ca2 +] Jag ökar i spermier. I synnerhet, i mänskliga spermier, aktiverar progesteron direkt en Ca 2 +-kanal (nämligen CatSper) uttrycks uteslutande i plasmamembranet hos spermier 10,11. Vi mätte också vila [Ca 2 +] i före och efter capacitation med tanke på att det också är allmänt accepterat att en ökning av [Ca2 +] i. inträffar under capacitation. För tekniker som kräver en positiv kontroll använde vi en Ca 2 +-jonofor jonomycin-att inducera maximal Ca 2 ^-upptag in i cellen, och därmed maximal fluorescens svar; för den minimala fluorescensvärdet använde vi Mn 2 + för att släcka fluorescens.
Ett. Spermier Provberedning av uppsimningsförfarandet (se figur 1)
Använd ejakulerade bara prover (erhållna genom onani) vars egenskaper uppfyller de parametrar som fastställts av den senaste upplagan av Världshälsoorganisationens laboratorium handbok (finns på http://whqlibdoc.who.int/publications/2010/9789241547789_eng.pdf ) för undersökning och bearbetning av human sädesvätska.
- Erhåll spermaprovet inuti en steril behållare och placera den (med lossade lock) inuti en inkubator vid 37 ° C och CO 2 5% / luft 95% under 30 min. Detta steg är för prov kondensering.
- Placera 500 pl alikvoter av den kondenserade spermaprov på botten av rena provrör av glas (1,0 x 7,5 cm). Cirka åtta provrör behövs för en genomsnittlig storlek prov (4 ml).
- Försiktigt skikt 1 ml Hams F-10 medium (su. pplemented med 2 mM CaCl2 och 5 mg / ml bovint serumalbumin för att främja capacitation in vitro) på toppen av varje sperma alikvot (se figur 1) TIPS: Tryck på väggen av röret med spetsen av mikropipett, och försiktigt dispensera mediet ovanför provet. Det är viktigt att göra det långsamt som blandningen av båda skikten (prov och medium) måste undvikas.
- Försiktigt luta rören till en 30 ° vinkel ungefär. Detta kommer att öka ytan mellan de båda vätskorna, vilket ökar förskjutningen (simma upp) av mänskliga celler från provet till mediet under inkubation.
- Placera den grupp av lutade provrör inuti en inkubator vid 37 ° C och CO 2 5% / luft 95% under 1 timme.
- Använd en mikropipett försiktigt bort den övre 700 il Hams F-10 medium (som nu innehåller rörliga spermier) från varje rör och pool alla insamlade prover i en enda ren glasrör (1.0 x 7.5 cm, för större mängder Använd en 15 mlFalcon-rör), undvika bubbelbildning. Placera 10 il samlingsprov på den optiska planglas av en Makler räknekammare bas, och sedan placera täckglaset (när locket är på plats, undvik att lyfta eller täcka igen för att upprätthålla en enhetlig spridning av spermaprov). Se till att undvika bubblor bildas inne i kammaren eftersom detta skulle leda till en felaktig celltal.
- Provet i ett mikroskop (användning av ett 20x objektiv rekommenderas). Den skyddsglas av Makler räknekammare har ett stort torg som består av 100 små kvadrater (dvs. en 10 med 10 rutnät). Räkna celler i någon remsa av 10 kvadrater. Detta antal utgör deras koncentration i miljoner celler / ml. Upprepa räkna in ytterligare två 10-kvadrat remsor, och beräkna genomsnittet av de tre punkter OBS. Om en Makler räknekammare (som är speciellt utformad för att räkna spermier) inte är tillgänglig, kan en hemocytometer kammare användas.
- Justera provets Final koncentration till 1x10 7 celler / ml i kompletterat Hams F-10 medium. När så erfordras, Inkubera provet vid 37 ° C och CO 2 5% / Luft 95% under 5 timmar för att främja capacitation.
2. Fluorescerande färg Laddar för Ca2 + Mätningar
Det finns flera fluorescerande färgämnen tillgängliga för att mäta intracellulär Ca 2 +, och lämpligt en måste väljas i enlighet med dess K ^, och dess emissions-och exciterings våglängder (för kvalitativa och kvantitativa mätningar, enkla och dubbla emissions-och excitationsvåglängder, respektive, måste vara används) mer information). För föreliggande kvalitativa program vi använt Fluo-3 AM, en cell-genomträngande färgämne med ett Kd = 325 nM, och enda emission och excitation våglängder av 506/526 nm, respektive 12.
- Förbered 50 | il av en 1 mM Fluo-3:00 förrådslösning genom att lösa upp innehållet i en 50 ^ g färgämne injektionsflaska (MW = 1130 g / mol) i 44 pl av vattenfri DMSO.
- Med hjälp av en 1,5 ml mikrofugrör blanda erforderlig volym spermasuspension (se erforderliga mängden för varje specifik teknik nedan) med tillräckligt 1 mM Fluo-3:00 stamlösning för att erhålla en slutlig koncentration av 2 ^ M Fluo-3:00 (dvs. 1 il lager Fluo-3 AM skall läggas för varje 500 pl spermiesuspension).
- Inkubera under 30 minuter vid 37 ° C och skyddas från ljus.
- Centrifugera röret vid 750 xg under 5 minuter med hjälp av en mikrocentrifug, aspirera och kassera supernatanten och suspendera pelleten i lämplig volym (se erforderlig koncentration för varje specifik teknik nedan) av mänskliga spermier Medium (HSM, mM: 120 NaCl, 15 NaHCO 3 2, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 Na laktat, 5 D-glukos, 1 Na-pyruvat, pH = 7,4) OBS: Bildandet av ett moln snarare än en pellet indikerar att cellerna är i gott skick.
- Cellerna är nu laddad med färgämnet, de förblir viabla (hölls vid 37 ° C och skyddas från ljus) under ca två timmar, och kan användas i någon av följande tekniker.
Tre. Teknik # 1. Konventionell fluorometri (Genomsnittlig information från ett stort cellpopulation)
Utrustning: För vår sperma befolkning [Ca2 +] i mätningar vi använder en SLM Aminco spektrofluorometer drivs av Olis programvara (Bogart, GA, USA) med magnetomrörare kontroll (SIM Aminco), och kopplas till en blå LED (Luxeon Star LXHL- LB3C, från LUMILEDS) och ett 465-505 nm bandpassfilter (Chroma Technology Corp) för Fluo-03:00 excitation. Lysdioden styrs av en specialbyggd strömförsörjning (700 mA). Emission ljus mäts genom att ställa emissionsvåglängden (λ Em) till 525 nm på spectrofluorometer s monokromatorn.
- Placera 570 pl av HSM och 30 | il av spermier cellsuspension (tidigare laddad med Fluo-03:00 och återsuspenderades i HSM att erhålla 1x10 8 celler / ml) i en plan botten glasrör (ID 8 x 50 mm). Placera en magnetisk omrörare inuti röret och sätt in röret i läsning kammare av spektrofluorometer (uppvärmt till 37 ° C), rör om provet under hela förvärvet tiden.
- Starta experimentet använder utrustningen programvara (Olis programvara i det här fallet) och fortsätt att förvärva fluorescensvärden med en frekvens av 0,5 Hz under 300 sek. Applicera de önskade testföreningar genom injektion av den lämpliga volymen från en stamlösning (i allmänhet 100X mer koncentrerade än den önskade slutliga koncentrationen) med användning av en Hamilton mikrospruta på följande sätt:
- Skaffa basal fluorescens i 30 sek.
- Vid 100 sek tillsätt 20 iM ionomycin (som en positiv kontroll, för att uppnå maximal fluorescens värde).
- Kör en negativ kontroll genom att upprepa steg 3.1 till 3.2.3 ovan, men lägger istället Pg endast lösningsmedlet användes för att lösa det (HSM med 0,01% vattenfri DMSO).
- Export råa fluorescensintensitetsvärdena till Microsoft Excel och normalisera dem med hjälp av följande ekvation: (f/f0) - 1. Där F är fluorescensintensiteten mätt vid en viss tidpunkt (t), och F0 är medelvärdet basala fluorescensen tas under den initiala 30 sek. Plotta den totala serien (f/f0) - 1 värden mot tid (Figur 2A). Mät skillnaden mellan de fluorescensintensitetsvärdena före och efter tillsats av testföreningarna (AF), rita dem på ett stapeldiagram och behandla uppgifterna tillämpar lämpliga statistiska analysmetoder (Figur 2B).
4. Teknik # 2. Stoppad Flow fluorometri (Information med hög tidsupplösning från en stor cell population)
Utrustning: Intracellulär [Ca 2 +] förändringar mäts med hög temporal upplösning med användning av en SFM-20 stoppat flöde bländare kopplad till en MOS-200 snabb kinetik optiskt system, både från instrument biologic vetenskap (Grenoble, Frankrike). Samtliga data analyseras med Bio-Kine32 mjukvara från samma företag.
- Ange lämpliga förhållanden i utrustningen, belysningen källan ska vara påslagen minst 15 minuter innan försöket, justera excitation och emission filter, justera fotomultiplikatorn till en spänning värde inom intervallet fastställts av slutade flöde tillverkare, och ange badtemperaturen vid 37 ° C.
- Fyll en av instrumentets sprutor med 1 ml Fluo-03:00-laddade spermaceller (1x10 7 celler / ml) och den andra sprutan med 1 ml av den förening som skall testas, antingen HSM (negativ kontroll),10 iM ionomycin (positiv kontroll) eller 10 iM Pg upplöst i HSM Anmärkning:. I detta steg är det viktigt att undvika att bubblor bildas samtidigt dra vätskorna i sprutorna.
- Lyft båda instrument kolvarna tills de vidrör spetsen på sprutan kolvarna.
- Ställ in flödeshastigheten till det minsta värde som kommer att ge ett mätbart svar i syfte att minimera cellskador. Flödeshastigheten vi använder i SFM-20 systemet är en ml / sek 13.
- Ställ in frekvensen (i detta fall 10 ms) och total provtagning tid (i detta fall 50 sek).
- Utlösa blandning av reagenser OBS:. Medan en enskild utlösare i taget kan göras manuellt, kan en uppsättning automatiska rad triggers förprogrammeras också.
- Spåret av rå fluorescens (godtyckliga enheter) mot tid visas på datorskärmen.
- Blandningen av reagensen i sig kommer att generera ett spår som inte är en rak linje. Således, för att erhålla den verkliga [Ca2 +] förändring härrör från ett stimulus, måste kontrollen spår erhålls genom blandning av celler med medium (negativ kontroll) subtraheras från var och en av de experimentella spår. Analysera data som krävs, vissa kinetiska parametrar kan också erhållas med Bio-Kine32 förvärv programvara. Raw spår utan subtraktion visas i Kompletterande Figur 1 för jämförelse.
- Om du vill ändra reagens i testföreningens sprutan, rengör den ordentligt med destillerat vatten. Fyll sedan sprutan till dess maximala volymen med destillerat vatten, placera den i motsvarande kolv slutade flöde fluorometer och pressa vattnet genom den inre mekanismen (sköljvattnet måste riktas till avfallsbehållare). Upprepa detta steg två gånger mer.
- Upprepa steg från 4,2 till 4,9, fyller den andra sprutan med den önskade nästa testföreningen.
- Vid slutet av experimentet, spola hela utrustningen med destillerat vatten, helt dränera vattnet fråninterna slangar.
Fem. Teknik # 3. Flödescytometri (Single Cell information från ett stort antal celler)
Utrustning: Denna teknik medger samtidig mätning av flera parametrar i ett enda ögonblick i tiden, men till skillnad från tidigare tekniker, betyder inte mäta förändringar över tiden, utan det ger parametervärdena vid tidpunkten för mätningen. I stället för att lägga till Pg för att utlösa svaret, i detta fall mätte vi intracellulär Ca2 +-nivåer i spermier före och efter induktion capacitation. Vi använde en FACSCanto Cytometer (Becton Dickinson) och data analyserades med FlowJo programvara (Träd Star 9.3.3).
- Förbered experimentproverna i cytometer rör genom att placera 500 l cellsuspension (4x10 6 celler / ml) per rör under varje tillstånd som skall testas (i detta fall tio villkor, se tabell 1). Samla fluorescensdata from 10.000 evenemang per prov.
- För att ställa upp ett experiment använder utrustningen programvaran till:
- Skapa ett nytt: mapp, experimentera, prov och antalet rör.
- Välj lämpliga cytometer inställningar för Fluo-3 AM (använd FITC-Fluoresceinisotiocyanat-filter) och PI (använd PI-propidiumjodid-filter).
- Kör de ofärgade kontroll rören 1 och 2 i cytometern. Samla FSC och SSC uppgifterna för att kontrollera att tröskelinställningarna är lämpligt och att skapa motsvarande grinden för att diskriminera skräp från celler.
- För att skapa ersättning kontroller, kör följande kontrollprover, samla auto och maximal fluorescens data (PI och FITC kanaler) (OBS: denna uppgift utförs vanligtvis av utrustningens tekniker):
- Ofärgade celler (rören 1 och 2).
- Celler som laddad med Fluo-3 AM (2 pM) (rören 3 och 4).
- Döda celler (spermier suspenderade i 0,1% Triton X-100 i HSM under 10 min vid rumstemperatur)färgas med PI (1,2 iM PI, dvs 0,25 il 2,4 mM PI sätts till 500 pl spermiesuspension) under 30 minuter vid 37 ° C, skyddat från ljus (rören 5 och 6).- Visa inspelade data och välj grinden för de önskade populationer.
- Justera grinden och välj "Apply" till all ersättning Controls.
- Välj experiment> kompensation inställning> beräkna ersättningen.
- Byt namn på ersättning setup och länka & spara.
- Kör alla experimentella rör (i det här fallet rör 7-10). I slutet, exportera alla data till programvaran tillgänglig för analys (se steg 5.6).
- Analysera resultaten av varje försök att använda utrustningen programvara, det kommersiellt tillgängliga FlowJo programvara eller Cytobank fri programvara ( http://www.cytobank.org/ ).
6. Technique # 4. Single Cell Imaging (Single Cell Information med hög rumslig upplösning) Utrustning:. Specialbyggd Imaging set-up Vår avbildning set-up består av en inverterad Nikon Diaphot 300 mikroskop utrustat med en temperaturregulator (Medical System Corp, Greenvale, NY), en Nikon PlanApo 60X (1,4 NA oljeimmersion) mål. Fluorescensbelysning tillhandahålls av en Luxeon V Star Lambertian Cyan LED del # LXHL-LE5C (Lumileds Lighting LLC, San Jose, CA) kopplad till en specialbyggd stroboskopiska styrbox. Lysdioden monterades in i en FlashCube40 församling med dikroiska spegeln M40-DC400 (Rapp Opto Electronic, Hamburg, Tyskland) (bandbredder: excitation 450-490 nm, dikroitisk spegel 505 nm och utsläpp 520-560 nm). LED utgång var synkroniserad med exponering Out signalen av en Cool Snap CCD-kamera via kontrollboxen för att producera en enda blixt av 2 ms varaktighet per enskild exponering. Kamerans exponeringstid sattes motsvarar blixtvaraktigheten (2 ms). Bilderna samlas varje 250 ms (eller kan justeras enligtden önskade temporal upplösning) med användning av IQ mjukvara (Andor Bioimaging, Wilmington, NC).
- Förbered runda täckglas (diameter = 25 mm) genom att applicera en 5-l droppe av poly-L-lysin-lösning (0,01% vikt / volym) på mitten. Låt den stå i minst 1 timme (det kan torka). Med hjälp av en sprutflaska skölj behandlade området med vatten före användning. Detta förfarande gör att spermierna att ansluta sig till locket glida ur sitt huvud, medan deras flagellum kan fortfarande flytta.
- Framställa föreningarna som skall testas genom att lösa dem i HSM enligt tabell 2. Föreningar tillsättes i följd i samma inspelningen kammaren, och sätt alltid lägga till samma volym, och för att justera koncentrationen av förrådslösningen med hänsyn till utspädning det kommer att ha när det blandas med volymen redan är närvarande i kammaren (såsom indikeras i Tabell 2). Håll alla testlösningar i ett bad vid 37 ° C tills de används.
- Montera locket glida inuti recording kammaren och plats 10 pl Fluo-3:00-laddade celler (en x10 7 celler / ml) i centrum. Täck cellerna med 200 | il av förvärmda HSM.
- Placera kammaren på scenen av mikroskopet som förvärmts till 37 ° C, se de cellerna (med användning av faskontrast) och välj ett område för avbildning. Det är viktigt att välja ett område där celltäthet är lämpligt (se figur 5A), alltför många celler gör analys svår på grund av överlappande signaler OBS: Celler bör vara fast monterade på locket glida av huvudet men uppvisar flagellar rörelse, vilket bekräftar. livskraft.
- Förvärva fluorescens bilder i live-läge för att justera fokus och ljusstyrka.
- Starta experimentet genom att aktivera tidsserier mjukvara Image Acquisition (IQ i det här fallet). Typiskt fyra bilder förvärvas per sekund med belysning av 2 ms per bild.
- Använd en mikropipett för att försiktigt lägga (droppvis) testföreningen (Pg i detta fall), fortsätt image förvärv efter behov och utför två sekvensprogram tillägg in i samma kammare: (1) 20 | iM jonomycin för att erhålla maximal fluorescens och (2) 5 mM MnCl2 för att erhålla minimal fluorescens. Alternativt kan föreningar tillsättas med användning av en perfusionskammare som erbjuder fördelarna av att aktivera stimulans avlägsnande, och förmågan att likformigt bada cellerna med föreningen. Samtidigt, har den nackdelarna med att kräva större mängder lösning, och att göra temperaturkontroll mer problematisk.
- Upprepa förvärv i en ny kammare med varje önskat test föreningen.
- Utför nätet bildanalys med hjälp av utrustning programvara, eller offline med antingen IQ programvara eller Image J freeware. Rita områden av intresse (ROI) runt varje cell (eller en del av cellen) och även välja en cell-fritt område (för automatisk bakgrunden subtraktion av programvaran). En tid-fluorescensintensiteten serien erhålls sedan för varje ROI och dessa uppgifter may exporteras till Microsoft Excel för vidare analys. Vi normalisera fluorescensintensitetsvärdena hjälp av följande ekvation: (f/f0) - 1. Där F är fluorescensintensiteten mätt vid en viss tidpunkt (t) och F0 är den genomsnittliga fluorescensen tas under den initiala 30 sek. Plotta den totala serien (f/f0) - 1 mot tid (figur 5B). Värden kan också normaliseras med hjälp av fluorescens värde erhålls efter ionomycin tillsats som 100%.
- Bildanalys kan alternativt utföras med hjälp av Image J fri programvara.
Teknik # 1. Konventionell fluorometri
Progesteron är ett av de kända AR inducerare och, som väntat, det gör det framkalla en övergående [Ca 2 +] i-ökning av human sperma (visad i fig. 2). Tillsättning av en kalciumjonofor (ionomycin) ger högsta [Ca2 +] i ökning, som inte återgår till basala nivåer.
Teknik # 2. Stoppad Flow fluorometri
Den progesteron-inducerad [Ca2 +] Jag ökar mättes som tidigare (konventionell fluorometri), men den här gången med större tidsupplösning, i detta fall frekvensen av förvärvet var 0,1 Hz. Såsom visas i figur 3, som orsakas både progesteron (övergående, röd linje) och jonomycin (ihållande, blå linje) en mycket snabb [Ca 2 +] i öka. Avsaknaden av en försening i progesteron-inducerad [Ca2 +] i ökningen är förenlig med tidigare rapporter tyder på att progesteron direkt aktiverar Ca2 + kanal CatSper, utan mellanliggande signalering 10,14.
Teknik # 3. Flödescytometri
[Ca 2 ^] i mättes i capacitated och icke-capacitated mänskliga spermier. Som tidigare rapporterats i mus 15, bovin sperma 16 och människasperma 17, observerade vi också ökat [Cen 2 ^] i i capacitated jämfört med icke-capacitated mänskliga spermier. Baldi, et al. (1991) 17 rapporterade högre basal [Ca2 +] i i capacitated än i icke-capacitated mänskliga spermier med konventionell fluorometri. I detta arbete har vi använt flödescytometri för att jag före och efter in vitro capacitation mäta [+ Ca 2]. Flödescytometri kan vi se att fördelningen av fluorescens värden för capacitated spermier (Figur 4D, blå spår) förskjuts till högre värden jämfört med icke-capacitated spermier (Figur 4D, rött spår). De fluorescens värden för varje enskild cell kan observeras i de tvådimensionella punktdiagrammen visas i figur 4G, viktigare, kan signalen som härrör från döda celler (15% ungefär) elimineras (Figur 4G, övre kvadranter).
Technique # 4. Single Cell Imaging
Den progesteron-inducerad [Ca2 +] i förändringen mättes i enstaka spermier. Progesteron Dessutom orsakar en ökning av [Ca 2 +] i både i spermiens huvud och i flagellum. Som observerats i befolkningen experiment avslöjade enda cell analys en övergående och en varaktig ökning av progesteron och ionomycin, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. Skiss av det experimentella protokollet för spermier provberedning av uppsimningsförfarandet. De viktigaste stegen för separation av rörliga spermier och för anpassning av deras koncentration illustreras. Den sista inkubationssteg utförs endast när capacitation krävs.
Figur 2. Progesteron orsakar en ökning av [Ca 2 +] i i humana spermier populationer. (A) Representativa fluorescens spår mot tid som visar [Ca 2 +] i-förändringar som orsakas av tillsats av 4 | iMprogesteron (Pg, rött spår), eller HSM med 0,01% DSMO (Pg fordon) som negativ kontroll (CTL, blå spår). Som en positiv kontroll, är förändringen inducerad av 10 iM ionomycin (Iono) visas för varje spår. Fluorescensvärden förvärvades vid en frekvens av 0,5 Hz under 120 sek. (B) Bars representerar genomsnittet AF från varje tillstånd ± SE, n = 3 (* p <0,001 jämfört med kontrollgruppen).
Figur 3. Progesteron och ionomycin inducera en snabb [Ca2 +] Jag ökar i mänskliga spermier populationer. [Ca2 +] i svaren registrerades genom provtagning var 10 msek (AFU = godtyckliga fluorescensenheter). (A) Raw spår för kontroll (blandning celler med HSM, grönt spår) och signaler som induceras med 10 iM p rogesterone (röd spår) eller med 10 ^ M jonomycin (blå spår). (B) rättad spåren för de signaler som induceras med 10 iM progesteron (röd spår) eller med 10 ^ M jonomycin (blå spår), erhålles genom subtraktion av styrsignalen (grön spåra i panel A) från deras motsvarande råa signaler (röda och blå spår i panel A, respektive). Progesteron framkallar en övergående reaktion, med en maximal fluorescens värde inträffar 2,7 sek efter tillsats av induktorn. Å andra sidan, genererar ionomycin en snabb och varaktig respons hela tiden (50 sek). Den infällda bilden i panel B visar en expanderad vy av den första 500 ms för varje svar. Observera att både ionomycin-och progesteron-inducerad [Ca2 +] Jag ökar startar omedelbart efter blandning av cellerna med induktorn. Varje spår representerar medelvärdet av tre inspelningar. Alla spår normaliserades mot deras minimala fluorescensvärden och överlagras på varandra.com/files/ftp_upload/50344/50344fig3large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. .. [Ca 2 +] i stiger under mänsklig spermiekapacitering underkastades flödescytometrianalys capacitated (blå tomter) och icke-capacitated (röda områden) spermaceller (A) framåt (FSC) och sidospridning (SSC) tomter; de valda porten är markerad med den blå linjen och endast cellerna inom detta område användes för vidare analys. Fluorescens histogram i FITC kanal från ofärgade (autofluorescens) (B) och Fluo-3:00 färgade (positivt för FITC) (D) spermier. Fluorescence histogrammen i PI kanal från ofärgade (autofluorescens) (C) och döda (positivt för PI) (E)-celler. Två-dimensionell fluorescens (Fluo-3 FÖRMIDDAG ennd PI) punktdiagram för ofärgade (F) och dubbel färgade (Fluo-3 AM-och PI) spermier (G), är andelen celler som registrerats i varje kvadrant indikeras av den röda numret. Dessa resultat är representativa för ett experiment (n = 5).
Figur 5. Progesteron orsakar en ökning av [Ca 2 +] i i humana spermier. (A) Representativa pseudofärger bilder av humana spermier visualiseras i början (kontroll), och efter progesteron (Pg, 45 sek), jonomycin (Iono, 300 sek ) och MnCl2 (380 sek) tillägg. (B) Representativa normaliserade fluorescens spår av nio enskilda celler från (A).
| Tube | Skick | Behandling | Värden som skall mätas | Kommentarer | Diagram |
| 1 | Kontroll (Icke-capacitated celler) | Ofärgade | a) FSC 1 och SSC 2 b) FITC 3 fluorescens c) PI 4 fluorescens | a) För att bestämma cellens storlek och kornighet och skapa gate b) FITC 3 autofluorescens c) PI4 autofluorescens | a) punktdiagram A, Rött b) Histogram B, Red c) Histogram C, Röd |
| 2 | Kontroll (capacitated celler) | Ofärgade | a) FSC 1 och SSC 2 b) FITC 3 fluorescens c) PI4 fluorescens | a) För att bestämma celler storlek end kornighet och skapa gate b) FITC 3 autofluorescens c) PI 4 autofluorescens | a) punktdiagram A, Blå b) Histogram B, Blå c) Histogram C, Blå |
| 3 | Positivt för FITC 3 (Non-capacitated celler) | Etikett med FITC | FITC 3 fluorescens | För att bestämma fluorescens i provet | Histogram D, Röd |
| 4 | Positivt för FITC 3 (capacitated celler) | Etikett med FITC | FITC 3 fluorescens | För att bestämma fluorescens i provet | Histogram D, Blå |
| 5 | Döda celler, positivt för PI 4 (Icke-capacitated celler) | Etikett med PI | PI 4 fluorescens | För att bestämma fluorescens av döda celler | Histogram E, Röd |
| 6 | Döda celler, positivt för PI 4 (capacitated celler) | Etikett med PI | PI 4 fluorescens | För att bestämma fluorescens av döda celler | Histogram E, Blå |
| 7 | Kontroll (Icke-capacitated celler) | Ofärgade | FITC 3 och PI 4 fluorescens | För att bestämma autofluorescens i FITC 3 och PI 4 kanaler | Dotplot F, Röd |
| 8 | Kontroll (capacitated celler) | Ofärgade | FITC 3 och PI 4 fluorescens | För att bestämma autofluorescens i FITC 3 och PI 4 kanaler | Dotplot F, Blå |
| 9 | Positivt för FITC 3 och PI 4 (Icke-capacitated celler) | Label med FITC 3 och PI 4 | FITC 3 och PI 4 fluorescens | För att bestämma de fluorescensvärdena i båda kanalerna i det experimentella tillståndet | Dotplot G, Röd |
| 10 | Positivt för FITC 3 och PI 4 (capacitated celler) | Etikett med FITC 3 och PI 4 | FITC 3 och PI 4 fluorescens | För att bestämma de fluorescensvärdena i båda kanalerna i det experimentella tillståndet | Dotplot G, Blå |
Tabell 1. Beskrivning av prover för en flödescytometer experiment 1 FSC: Forward Scatter, 2 SSC:. Sidospridning, 3 FITC: Fluoresceinisotiocyanat, 4 PI: propidiumjodid.
| Förening | Volym av stamlösning som skall tillsättas | Stock koncentration | Volym närvarande i kammaren vid tidpunkten för tillsats | Slutlig koncentration i kammaren |
| Progesteron | 100 | il | 9 iM | 200 | il | 3 ^ M |
| Jonomycin | 100 | il | 80 pM | 300 | il | 20 pM |
| MnCl2 | 100 | il | 25 mM | 400 | il | 5 mM |
Tabell 2. Beredning av lösningar för en avbildning experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intracellulär signalering är avgörande för de flesta cellulära aktiviteter, Ca2 + är en allestädes närvarande budbärare som åtföljer däggdjursceller under hela deras livscykel, från sitt ursprung vid befruktningen till slutet av sin livscykel. Som svar på olika stimuli, [Ca2 +] i ökar, oscillerar och minskar med tid och rum kodifiering, följaktligen, är olika processer aktiveras, modulerade eller avslutas av Ca2 +-kodade meddelanden. Intracellulär Ca 2 + dynamik är mycket viktiga i spermier fysiologi, eftersom denna jon är inblandad i en komplex orkestrering av signaltransduktionsprocesser. Kunskap om sådana Ca2 + fluktuationer kan hjälpa dechiffrera den molekylära identiteten av Ca2 inblandade +-kanaler, och deras specifika roller i olika signalkaskader. Ca 2 +-känsliga fluorescerande färgämnen utgör ett kraftfullt verktyg för att studera dem, vilket möjliggör mycket specifik och känslig Ca 2 + measurements som kan användas för att spåra koncentration förändringar i levande celler. I detta dokument diskuteras cellpopulation experiment (konventionella och stoppade flödet fluorometri) och enstaka experiment cell (flödescytometri och enda cell imaging) används antingen för att följa tid och rum [Ca2 +] förändringar i humana spermier vid en progesteron stimulus, eller att uppskatta Ca2 + vila nivåer före och efter in vitro capacitation.
Konventionell fluorometri är en utbredd teknik eftersom den krävs instrumenteringen är lätt tillgänglig i de flesta laboratorier, är det lätt att utföra, och det kan snabbt informera om det finns en [Ca2 +] i steg på en specifik stimulus. Stoppad flöde fluorometri, även om det krävs mer sofistikerad utrustning, ger hög tidsupplösning. Exempelvis Kaupp och medarbetare bestämdes att vid progesteron stimuli, spermier [Ca 2 +] i stiger omedelbart utanfördröjning 10, detta faktum, i kombination med ytterligare experimentella bevis 14, leder dem att föreslå att progesteron aktiverar direkt en Ca2 +-kanaler (CatSper), utesluter inblandning av en signalering kaskad eller av en extra progesteron receptor, åtminstone under initial progesteron-inducerad ökning. Progesteron framkallar en övergående ökning följt av en mindre och långsammare ökning, därför kan mer än en Ca2 + inträde mekanism vara involverad i det totala svaret.
Flödescytometri är en mycket kraftfull teknik men det kräver dyrbar instrumentering. När de är tillgängliga, är denna metod av anmärkningsvärd vikt, eftersom det mäter samtidigt flera parametrar, på ett stort antal celler, och på relativt kort tid. Viktigt ger det diskriminering mellan levande och döda celler. I denna uppsats visar vi för första gången med hjälp av flödescytometri att det finns en Ca2 + öka dnder capacitation i mänskliga spermier. Våra mätningar förutsatt fluorescensvärden för varje enskild cell, så att fördelningen av dessa värden i befolkningen tydligt kan observeras, i sin tur möjliggör eliminering av signalen från döda celler (Figur 4).
Fluorescens-baserade imaging analyser på intakta levande celler kompletterar de föregående tre teknikerna eftersom det tillför rumsliga upplösningen till mätningarna. Hög temporala och / eller rumslig upplösning under avbildning kan också erhållas, enligt tillgängliga instrumentering kapacitet (dvs. ljuskänslighet, ljuskälla, objektiv numerisk bländare, etc.). Men med tanke på att endast ett fåtal celler studeras på en gång, måste försöken upprepas flera gånger för att dra säkra slutsatser, vilket gör analysen tidskrävande.
I detta papper vi använde enkla experimentella protokoll för att illustrera var och en av de fyratekniker. Dock kan dessa metoder utökas för att studera processer i mycket större djup. Det finns ett stort antal fluorescerande färgämnen som kan riktas till specifika avdelningar av cellen (cytosol, mitokondrier, ER, endosomes, etc), det finns ratiometriska färgämnen (dubbel utsändning och / eller excitation våglängder) som möjliggör kvantitativ bestämning av parameter som mäts (kalibrering krävs), och slutligen, kan mer än ett färgämne användas på en gång för att samtidigt mäta, till exempel, [Ca 2 +] i och [pH] i-förändringar. Dessutom kan dessa tekniker kombineras med farmakologiska verktyg och / eller omsorgsfullt utformade protokoll (varierande extracellulära Ca2 + koncentration, pH-värden, temperaturer, eller någon annan faktor som kan påverka svaret) för att få information som kan användas för att belysa i detalj processen enligt studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Jose Luis De la Vega, Erika Melchy och Dr Takuya Nishigaki för tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Mexiko) (99.333 och 128.566 till CT), Dirección General de Asuntos del Personligt Académico / Universidad Nacional Autónoma de México (IN202212-3 till CT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-10 | Sigma-Aldrich | N-6013 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-7906 | |
| Calcium Chloride Dihydrate approx. 99% | Sigma-Aldrich | C-3881 | |
| Makler Counting Chamber | SEFI Medical Insruments LTD | SEF-MAKL | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F-1242 | 20 vials/50 μg each |
| Ionomycin | Alomone | I-700 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P0130 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-9888 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P-3911 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium bicarbonate | JT Baker | 3506 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M-2670 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1016 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-3125 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| D-Glucose | JT Baker | 1906-01 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-2256 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium L-lactate (aprox. 99%) | Sigma-Aldrich | L- 7022 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L-7011 | Component B |
| Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) | Sigma- Aldrich | X-100 | 2.4 mM solution in water |
| Round coverslip | VWR | 48380 080 | 25 mm diameter |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | M-3634 | |
| Attofluor; Cell Chamber, for microscopy | Life technologies | A-7816 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | 5x5 ml |
References
- Bouschet, T., Henley, J. M. Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain. Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).
- Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L. Calcium channels in the development, maturation, and function of spermatozoa. Physiol. Rev. 91, 1305-1355 (2011).
- Esposito, G., et al. Mice deficient for soluble adenylyl cyclase are infertile because of a severe sperm-motility defect. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2993-2998 (2004).
- Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84, 505-510 (2009).
- Carlson, A. E., et al. Pharmacological targeting of native CatSper channels reveals a required role in maintenance of sperm hyperactivation. PLoS ONE. 4, e6844 (2009).
- Brokaw, C. J. Calcium and flagellar response during the chemotaxis of bracken spermatozoids. J. Cell. Physiol. 83, 151-158 (1974).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121, 1139-1150 (1995).
- Svahn, H. A., van den Berg, A. Single cells or large populations. Lab on a chip. 7, 544-546 (2007).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 690-696 (2006).
- Strunker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, 382-386 (2011).
- Lishko, P., et al. The Control of Male Fertility by Spermatozoan Ion Channels. Annu. Rev. Physiol. , (2011).
- Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3. J. Biol. Chem. 264, 8179-8184 (1989).
- Kilic, F., et al. Caged progesterone: a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone. Journal of the American Chemical Society. 131, 4027-4030 (2009).
- Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, 387-391 (2011).
- Xia, J., Ren, D. The BSA-induced Ca2+ influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 119 (2009).
- Galantino-Homer, H. L., Florman, H. M., Storey, B. T., Dobrinski, I., Kopf, G. S. Bovine sperm capacitation: assessment of phosphodiesterase activity and intracellular alkalinization on capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation. Mol. Reprod. Dev. 67, 487-500 (2004).
- Baldi, E., et al. Intracellular calcium accumulation and responsiveness to progesterone in capacitating human spermatozoa. J. Androl. 12, 323-330 (1991).
